对松墨天牛具有高毒力的Bt毒素的制作方法

本发明属于林业害虫的生物防治领域，具体涉及一种对松墨天牛具有高毒力的bt毒素。

背景技术：

松材线虫病是由松材线虫（bursaphelenchusxylophilus）寄生于松树并引发松树萎焉而死亡的一种毁灭性病害。松材线虫病起源于北美洲，主要为美国和加拿大，在20世纪松材线虫病传入日本，接着在1970-1980年间传播到中国，朝鲜等亚洲国家，随后传入葡萄牙和西班牙等欧洲国家甚至尼日利亚和墨西哥等国家。松材线虫病是松属植物中最具破坏性的病害之一，在亚洲，其主要为害树种包括中国马尾松（pinusmassoniana）、日本黑松（p.thunbergii）以及日本红松（p.densiflora），而在欧洲主要危害海岸松（p.pinaster），且该病在世界范围内造成环境和经济损失达数千万美元。由于松材线虫病的为害，每年日本至少损失700,000m³的松树。而该病自1982年传入我国江苏省南京市以来，在我国呈现快速扩散的态势，已扩散到18个省（区、市）、666个县级行政区，疫情发生面积达974万亩，直接威胁着我国近9亿亩松树的安全，且已经造成了上千亿元的经济损失和生态服务价值损失。

天牛科（cerambycidae）墨天牛属（monochamus）的昆虫是松材线虫的主要传播媒介，将松材线虫从枯死的松树上传播到活着的易感松树上。在我国，主要的传播媒介为松墨天牛，其也是主要的松树蛀干害虫，又被称为次期性害虫，生活在韧皮部或者木质部之中，具有很强的隐蔽性。目前，针对松墨天牛的防治手段主要有四种，即物理防治、化学防治、营林防治和生物防治。然而，这些防治方法各有优劣，对松墨天牛的防治未能达到最佳效果。其中生物防治具有绿色环保，持效期长的优点，进一步寻找有效的微生物制剂对松墨天牛进行生物防治，对于防控松材线虫病的扩散蔓延具有重要的意义。

苏云金芽胞杆菌（bacillusthuringiensis，简称bt）是目前应用最为广泛的生物农药，对16个目3000多种害虫有活性。苏云金芽胞杆菌的主要特征为在产生孢子期间能够合成晶体蛋白，这些晶体蛋白中的毒力因子为δ-内毒素，且这些毒素主要被分为两个家族包括cry和cyt。目前已发现的cry毒素有759种，根据氨基酸序列的同源性高低，可以将其分为75类，不同类别的cry毒素的杀虫谱表现出显著的特异性，分别对鳞翅目，鞘翅目，双翅目的昆虫表现出杀虫活性。在cry毒素家族中，已有研究发现cry3、cry7、cry8和cry34/35类毒素对鞘翅目的幼虫有活性。其中，cry3a是第一个分离到的对鞘翅目昆虫有杀虫活性的毒素，且已被应用于一些鞘翅目昆虫的防治。然而，由于cry3a毒素对天牛科幼虫的低毒力使得防治效果并不理想。因此，为有效防治天牛科墨天牛属昆虫，迫切需要解决cry3a毒素对其弱毒的问题。

在cry3aa毒素作用过程中，当其被昆虫摄取后，原毒素会被昆虫肠道蛋白酶酶解活化出55kda大小的活性片段，该片段对鞘翅目昆虫表现出杀虫活性（walteretal.,2008;lietal.,2011）。然后，单体的活性毒素寡聚化形成的低聚物与中肠上皮细胞刷状缘膜囊泡（bbnv）上的受体结合，从而引起膜穿孔并导致细胞死亡（pardo-lópezetal.,2013）。而已有研究表明，cry3aa毒素在松墨天牛幼虫中肠的过度酶解是导致其弱毒的主要原因（guoetal.,2020）。因此，为解决昆虫肠道蛋白酶对毒素的过度酶解现象，本发明以cry3aa2基因为对象，通过分子改造的手段对毒素中的胰蛋白酶识别位点进行突变，开发能够产生对墨天牛属昆虫具有高毒力的新型cry毒素，是一项具有重大意义和应用价值的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种对松墨天牛具有高毒力的bt毒素，以seqidno.4（cry3aa2）为支架毒素蛋白，通过分子改造的手段对毒素中的胰蛋白酶识别位点进行突变，开发能够产生对墨天牛属昆虫具有高毒力的新型cry毒素。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

对松墨天牛具有高毒力的bt毒素为毒素brc2007蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。编码如所述bt毒素的基因，所述基因其核苷酸序列如seqidno.1所示。

与在seqidno.4所列出的毒素cry3aa2蛋白的初始氨基酸序列相比，为克服昆虫肠道蛋白酶对毒素的过度酶解，本发明的brc2007蛋白中包括了五个位点的氨基酸突变，将五个胰蛋白酶的识别位点突变为不被识别的丙氨酸，分别为：结构域i中在位置65处由赖氨酸置换成丙氨酸，在位置70处由赖氨酸置换成丙氨酸，在位置231处由赖氨酸置换成丙氨酸，结构域ii中在位置468处由赖氨酸置换成丙氨酸，以及结构域iii中在位置596处由赖氨酸置换成丙氨酸（图1）。

结构域i的基因序列和氨基酸序列分别如seqidno.5和seqidno.6所示；

结构域ii基因序列和氨基酸序列分别如seqidno.7和seqidno.8所示；

结构域iii基因序列和氨基酸序列分别如seqidno.9和seqidno.10所示。

所述的毒素brc2007的三个结构域，这三个结构域中的任意一个结构域均可与bt毒素的其他家族毒素的结构域任意组合获得对鞘翅目具有高毒力的毒素。

所述的bt毒素的其他家族毒素，这些毒素均具有三级结构域，包括但不限于cry3、cry7、cry8类毒素。

所述对墨天牛属昆虫具有高毒力的bt毒素在防治天牛科墨天牛属昆虫中的应用。

所述墨天牛属昆虫包括松墨天牛（monochamusalternatusenda、monochamusalternatusalternatus）、云杉花墨天牛（monochamussaltuarius）、云杉小墨天牛（monochamussutor）、卡来罗纳黑天牛（monochamuscarolinensis）、密毛白点墨天牛（monochamusscutellatus）和松墨斑墨天牛（monochamusmutator）和樟子松墨天牛（monochamusgalloprovincialis）。

本发明的brc2007晶体蛋白用于墨天牛属昆虫的生物测定。在具体实施例中，优选地用于防治松墨天牛（monochamusalternatusalternatus）。

本发明的优点在于：

本发明的brc2007毒素与seqidno.4所示的毒素cry3aa2蛋白在体外酶解活化效率、杀虫活性和目标昆虫种类谱相比，brc2007毒素能够克服被昆虫肠道蛋白酶过度酶解的现象，即酶解活化出更多的55kda大小的活性片段，从而提高了对目标昆虫的杀虫活性。

附图说明

图1为brc2007与cry3aa2蛋白氨基酸序列的比对。

图2为brc2007基因克隆到pht304-g载体上。

图3为pht304-g穿梭载体图谱。

图4为brc2007晶体蛋白的sds-page的结果图。其中泳道1为蛋白marker，泳道2为brc2007晶体蛋白。

具体实施方式

以下叙述本发明的实施例。应说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，并不对本发明的范围构成任何限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案的情况下，对本发明做出改进，变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明所附权力要求保护范围内。

实施例1brc2007基因的克隆

对cry3aa2基因上五位点进行氨基酸的突变获得brc2007基因序列，分别为：在位置65处由赖氨酸（k）置换成丙氨酸（a），在位置70处由赖氨酸（k）置换成丙氨酸（a），在位置231处由赖氨酸（k）置换成丙氨酸（a），在位置468处由赖氨酸（k）置换成丙氨酸（a），以及在位置596处由赖氨酸（k）置换成丙氨酸（a）（图1）。生物合成的brc2007基因（序列如seqidno.1所示）直接通过xhoi和bamhi酶切位点利用t4连接酶克隆到穿梭载体pht304-g中。具体步骤如下：

目的片段双酶切体系pht304-g表达载体双酶切体系

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total20μltotal20μl

黏性末端双酶切处理：将上述所加试剂于冰上溶解后按照顺序依次加入到200μl的pcr管中，最后加入phusiondna聚合酶，然后混匀，放入pcr仪，37℃反应1h。

酶切产物切胶回收纯化：酶切后的产物包括线性dna片段以及线性化pht304-g载体片段利用omega的gelextractionkit试剂盒进行产物纯化。

t4连接体系：将上一步纯化回收的酶切的线性dna片段以及线性化的pht304-g载体利用t4连接酶进行连接，然后反应体系所加试剂按照如下顺序依次加入到200μl的pcr管中，然后混匀，放入pcr仪，25℃，30min，65℃，30min，最后4℃保存。连接体系如下：

10×t4ligasebuffer1μl

目的基因全长（双酶切处理后）5μl

pht304-g载体（双酶切处理后）1μl

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通过以上步骤最终获得含有brc2007基因的pht304-g载体（图2）。

实施例2穿梭载体pht304-g的构建

以苏云金杆菌/大肠杆菌的pht304穿梭载体为基础，设计合成cry3aa2基因的启动子，包括启动cyt1a基因的bti和btii启动序列，stab-sd序列以及多克隆位点序列（xhoi，sphi，xbai，bamhi，kpni和saci）。该合成片段通过hindiii和ecori酶切位点连入pht304质粒中（图3），最终获得穿梭载体pht304-g。

实施例3brc2007毒素在苏云金芽胞杆菌中的表达及纯化

将毒素brc2007利用电转化方法转入无晶体突变株hd73cry^-中，通过挑取单菌落在lb培养基中30℃培养过夜，然后保存甘油菌，即为brc2007菌液。

其中bt电击转化具体方法为：

1）2mm电击杯使用前置于4℃冰箱中。

2）10μl质粒加入到200μl感受态细菌中，混合均匀，冰浴10min。

3）冰浴后进行电击转化，条件为：电压2.5kv，电阻200ω，电容25μf。

4）电击结束后加1800μl的lb培养液，混匀后转入1.5ml离心管，置于30℃摇床中慢速培养3h。

5）取适量菌液于含有10μg/ml红霉素（em）的lb固体培养基上，30℃培养至长出单菌落。

6）挑斑并在1/2lb平板上划线30℃培养。

7）三天半后镜检挑出晶体较多的保存甘油菌。

将brc2007菌液接入pm培养基（酵母粉2g/l，胰蛋白胨10g/l，kh2po41g/l，feso4•7h2o0.02g/l，mgso4•7h2o0.3g/l，mnso4•7h2o0.02g/l，znso4•7h2o0.02g/l，ph7.0）中30℃培养至晶体释放期（60h），经过受体菌体，晶体蛋白的溶解后，利用盐酸将ph调至4.5，离心收集沉淀，获得brc2007晶体蛋白（图4），其序列如seqidno.2所示。

实施例4brc2007毒素对松墨天牛（monochamusalternatusalternatus）的生物测定

天牛人工饲料的配方：麸皮60g，虾粉10g，山梨酸2g，苯钾酸钠4g，酵母粉25g，琼脂30g，松树韧皮部100g，松树木质部50g，蔗糖40g，水300ml。

生物测定方法：松墨天牛幼虫分别培养在含有0.1g人工饲料的500µl离心管中。每一支离心管对应一只三龄初期幼虫，分别加入150µl不同浓度梯度的cry3aa2原毒素和brc2007毒素（200、100、50、25、10和5µg/ml)。各浓度梯度三组重复，每组含有10只幼虫作为重复（各浓度梯度测试30只）。以单蒸水作为空白对照。所有离心管放置在25℃、75%湿度的环境下培养，并对其进行光周期16:8处理（光照培养16小时，黑暗培养8小时）。观察各组幼虫的生长状况并在两周后计算各组幼虫死亡率，运用概率单位分析计算出致死中浓度（lc50）。brc2007毒素对松墨天牛三龄初期幼虫两周的lc50值为10.2μg/ml，与cry3aa2原始毒素相比，杀虫活性提高了11.5倍（详见表1）。

表1cry3aa2和brc2007毒素对松墨天牛幼虫的杀虫活性

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序列表

<110>福建农林大学

<120>对松墨天牛具有高毒力的bt毒素

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