[0001]
本发明涉及一种酶解发酵法提高玛卡抗氧化能力的方法，尤其是一种利用微生物协同发酵制备高抗氧化能力的玛卡提取液，属于生物技术领域。
背景技术：
[0002]
玛卡是原产南美洲的一种十字花科植物。叶子椭圆，根茎形似小圆萝卜，可食用，是一种纯天然食品，营养成份丰富，有“南美人参”之誉。玛卡原产高海拔山区，适宜在高海拔、低纬度、高昼夜温差、微酸性砂壤、阳光充足的土地中生长；分布于南美安第斯山脉，人工种植于秘鲁中部和南部，中国的云南和新疆等地区，有较大面积的适种土地。玛卡富含高单位营养素，对人体有滋补强身的功用。研究表明玛卡营养成分主要包括：蛋白质含量为10%以上，59%的碳水化合物；8.5%的纤维，内含丰富的锌、钙、铁、钛、铷、钾、钠、铜、锰、镁、锶、磷、碘等矿物质，并含有维生素c、b
1
、b
2
、b
6
、a、e、b
12
、b
5
，脂肪含量不高但其中多为不饱和脂肪酸，亚油酸和亚麻酸的含量达53%以上，天然活性成份包括生物碱、芥子油苷及其分解产物异硫氰酸苄酯、甾醇、多酚类物质等。1999年，美国科学家发现了玛卡中含有两类新的植物活性成份，玛卡酰胺和玛卡稀，并确定这两种物质对平衡人体荷尔蒙分泌有显著作用，所以玛卡又被称为天然荷尔蒙发动机。在玛卡产品的针对性研究中，又发现了几种特殊的玛卡生物碱，随着研究的深入，玛卡中还会有更多的具有活性的新物质被分离和鉴定。
[0003]
目前关于玛卡的研究主要集中于玛卡的开发利用，提取方法主要包括化学法、酶解法和微生物发酵法，缺少酶解联合微生物发酵等的研究，尤其是缺少中草药配伍对玛卡抗氧化能力提升影响的相关研究，制约着玛卡在食品、保健品及医药等领域中的应用。本申请探讨对玛卡及其他中草药进行配伍提升药物中的玛卡体外抗氧化能力的方法，以解决现技术中玛卡高值化利用存在的营养物质提取率不高、资源化利用度等技术弊端。
技术实现要素：
[0004]
为了克服上述现有技术的不足，实现玛卡功能活性物质高效提取及抗氧化能力显著提升，本申请提供一种酶解发酵法提高玛卡抗氧化能力的方法，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术、中草药配伍应用技术，研制开发出高体外抗氧化能力的玛卡提取液，满足保健、医疗、食品等领域对玛卡的应用需求，该工艺技术发酵工艺简单高效、所得产品黄酮等活性物质提取率高，抗氧化能力强，生产成本低，易于工业化规模生产。
[0005]
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：一种酶解发酵法提高玛卡抗氧化能力的方法，其特征在于玛卡提取过程中添加葛根和川芎，其配伍比例为：玛卡100份、葛根2～5份、川芎1～2份。
[0006]
上述中草药原料进行如下预提取处理：将玛卡、葛根和川芎原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡30min；加入中草药原料质量比2%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400w，然后
静置30min以上。
[0007]
本申请提供一种酶解发酵法提高玛卡抗氧化能力的方法，其特征为对预提取后的中草药进行混菌好氧发酵，其中好氧发酵菌种主要包括米曲霉、啤酒酵母和枯草芽孢杆菌。
[0008]
上述混菌好氧发酵工艺具体包括以下步骤：（1）发酵培养配制：向预提取后的中草药中加入中草药原料10倍质量比的纯净水，然后加入发酵液质量比3～5%葡萄糖、0.3～0.5%硫酸铵、0.1～0.2%磷酸二氢钾、0.01%硫酸镁，搅拌均匀；（2）好氧发酵：向发酵液中接种米曲霉、啤酒酵母和枯草芽孢杆菌，接种量分别为发酵液体积比的2～3%、3～5%、5～8%；控温28～35℃进行好氧发酵，摇床转速100～150r/min,发酵时间12～24h；（3）固液分离：发酵结束后固液分离，得到玛卡提取液。
[0009]
进一步的，好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m
3
/m
3
.min。
[0010]
优选的，固液分离后的残渣可进行回收利用，添加到下一轮发酵培养基。
[0011]
优选的，发酵培养基配置过程中可添加1～2%的非淀粉多糖酶和0.5～1%的淀粉酶。
[0012]
上述米曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得米曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
9
cfu/ml。
[0013]
上述酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌ydp斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500ml装300mlpda液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
9
cfu/ml。
[0014]
上述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用lb培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
9
cfu/ml。
[0015]
本发明提供一种酶解发酵法提高玛卡抗氧化能力的方法，所得玛卡具有提取率和体外抗氧化能力显著提升，提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理，满足在保健、食品、医药、保鲜、饲料、肥料等领域的高效利用。
[0016]
本发明提供一种酶解发酵法提高玛卡抗氧化能力的方法，与现有技术相比，具有以下显著优势：（1）本申请科学配伍玛卡、葛根和川芎，既可以充分利用葛根、川芎等中草药对微生物的促生长作用；又通过中草药间的协同作用显著提升玛卡提取液的抗氧化能力，起到了“1+1>2”的技术效果；（2）本申请利用好氧菌（米曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌）共同发酵中草药原料提取玛卡，充分利用微生物间的协同作用，提升玛卡的提取率和体外抗氧化能力，其中：米曲霉能在髙温下分解纤维素，打破纤维素对玛卡功能活性成分（黄酮、多酚等）逸出的束缚；酵母菌在发酵过程中会产生各种降解细胞壁的酶类，使得更多的黄酮等活性物质从细胞壁中释放出来，且酵母是产生能够释放结合态酚酸的酶类，有利于提升玛卡的体外抗氧化能力；枯草芽孢杆菌在高温发酵过程中能够杀灭发酵液中的致病菌，并具有较强的产淀粉酶、蛋白酶等能力，可以将大分子淀粉、蛋白物质降解为微生物所利用；（3）采用液体发酵，提高了菌体的生长速率，缩短了发酵时间，提升了生产效率，发酵工
艺条件温和，生产成本低，且易于规模化生产，对提升行业经济效益及规模化推广应用具有重要作用。
具体实施方式
[0017]
实施例1一种酶解发酵法提高玛卡抗氧化能力的方法，具体工艺步骤包括：（1）中草药配伍:按玛卡100份、葛根3份、川芎1份比例准确配伍原料；（2）中草药预处理：将玛卡、葛根和川芎原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡30min；加入中草药原料质量比2%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400w，然后静置30min以上；（3）发酵培养配制：向预提取后的中草药中加入中草药原料10倍质量比的纯净水，然后加入发酵液质量比4%葡萄糖、0.45%硫酸铵、0.12%磷酸二氢钾、0.01%硫酸镁，搅拌均匀；并向发酵液中添加1%的非淀粉多糖酶和0.5%的淀粉酶；（4）发酵种子液制备：米曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得米曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
9
cfu/ml。
[0018]
酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌ydp斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500ml装300mlpda液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
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cfu/ml。
[0019]
枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用lb培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
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cfu/ml。
[0020]
（5）好氧发酵：向发酵液中接种米曲霉、啤酒酵母和枯草芽孢杆菌，接种量分别为发酵液体积比的3%、5%、8%；控温28～35℃进行好氧发酵，摇床转速100～150r/min,发酵时间16h；（6）固液分离：发酵结束后固液分离，得到玛卡提取液。
[0021]
实施例2一种酶解发酵法提高玛卡抗氧化能力的方法，具体工艺步骤包括：（1）中草药配伍:按玛卡100份、葛根5份、川芎2份比例准确配伍原料；（2）中草药预处理：将玛卡、葛根和川芎原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡30min；加入中草药原料质量比2%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400w，然后静置30min以上；（3）发酵培养配制：向预提取后的中草药中加入中草药原料10倍质量比的纯净水，然后加入发酵液质量比4%葡萄糖、0.45%硫酸铵、0.12%磷酸二氢钾、0.01%硫酸镁，搅拌均匀；并向发酵液中添加1%的非淀粉多糖酶和0.5%的淀粉酶；（4）发酵种子液制备：米曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得米曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
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cfu/ml。
[0022]
酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌ydp斜面上用接种环挑取
两环菌种，接种到500ml装300mlpda液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
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cfu/ml。
[0023]
枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用lb培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
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cfu/ml。
[0024]
（5）好氧发酵：向发酵液中接种米曲霉、啤酒酵母和枯草芽孢杆菌，接种量分别为发酵液体积比的3%、5%、8%；控温28～35℃进行好氧发酵，摇床转速100～150r/min,发酵时间16h；（6）固液分离：发酵结束后固液分离，得到玛卡提取液。
[0025]
实施例3一种酶解发酵法提高玛卡抗氧化能力的方法，具体工艺步骤包括：（1）中草药配伍:按玛卡100份、葛根3份、川芎1份比例准确配伍原料；（2）中草药预处理：将玛卡、葛根和川芎原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡30min；加入中草药原料质量比2%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400w，然后静置30min以上；（3）发酵培养配制：向预提取后的中草药中加入中草药原料10倍质量比的纯净水，然后加入发酵液质量比4%葡萄糖、0.45%硫酸铵、0.12%磷酸二氢钾、0.01%硫酸镁，搅拌均匀；（4）发酵种子液制备：米曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得米曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
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[0026]
酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌ydp斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500ml装300mlpda液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
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[0027]
枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用lb培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10
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[0028]
（5）好氧发酵：向发酵液中接种米曲霉、啤酒酵母和枯草芽孢杆菌，接种量分别为发酵液体积比的3%、5%、8%；控温28～35℃进行好氧发酵，摇床转速100～150r/min,发酵时间16h；（6）固液分离：发酵结束后固液分离，得到玛卡提取液。
[0029]
实施例4 不同工艺条件对玛卡活性成分提取率的影响试验分组：试验分为实施例1-3试验组、对照1组（实施例1发酵液）、对照2组（好氧发酵菌仅含米曲霉，其余同实施例1）、对照3组（好氧发酵菌仅含啤酒酵母，其余同实施例1）、对照4组（好氧发酵菌仅含枯草芽孢杆菌，其余同实施例1）、对照5组（实施例2发酵液）对照6组（好氧发酵菌仅含米曲霉，其余同实施例2）、对照7组（好氧发酵菌仅含啤酒酵母，其余同实施例2）、对照8组（好氧发酵菌仅含枯草芽孢杆菌，其余同实施例2）.对照9组（实施例3发酵液）、对照10组（好氧发酵菌仅含米曲霉，其余同实施例3）、对照11组（好氧发酵菌仅含啤酒酵母，其余同实施例3）、对照12组（好氧发酵菌仅含枯草芽孢杆菌，其余同实施例3）。
[0030]
表1 不同工艺条件对玛卡提取率的影响
试验组别黄酮含量（mg/g）多酚含量（mg/g）实施例1试验组3.826.75实施例2试验组3.186.12实施例3试验组2.855.64对照1组0.450.82对照2组1.893.63对照3组0.931.27对照4组1.312.28对照5组0.480.83对照6组1.913.75对照7组1.112.39对照8组1.792.95对照9组0.460.80对照10组1.753.24对照11组1.181.25对照12组1.432.72实施例5 不同工艺条件对玛卡提取液体外抗氧化能力的影响1、指标测定方法（1）玛卡对dpph自由基的清除作用：精确称取dpph9.7mg，加少量无水乙醇溶解后，以95%乙醇定容至250ml，制成浓度为0.2mmol/l的dpph溶液。取2ml已配制的dpph溶液，分别加入1ml不同浓度玛卡溶液，以95%乙醇补足到4ml，混匀，放置30min后，以95%乙醇为空白对照，在517nm处测定吸光值，计算抑制率；（2）玛卡对fe
3+
的还原作用：玛卡的还原力检测参考oyaizu方法。依次加入0.75ml0.2mol/l磷酸盐缓冲溶液(ph6.6)、0.75ml1%亚铁氰化钾和0.75ml 1mg/ml的玛卡溶液，混匀，50℃水浴20min；冰浴快速冷却后，加入0.75ml10%三氯乙酸，于3000
×
g、4℃下离心10min；取上清1.5ml加入0.1% fecl
3 0.5ml及ddh
2
o 10ml混匀后，室温静置反应10min，在700nm处测定提取液吸光度为a
1
，以1mg/mlv
c
为对照a，并以零管为a
0
，计算玛卡的相对还原力；2、试验分组同实施例4试验分组；3、试验结果表2 不同工艺条件对玛卡提取液体外抗氧化能力的影响试验组别dpph自由基抑制率（%）fe
3+
还原力（%）实施例1试验组84.28355.16实施例2试验组80.06311.93实施例3试验组76.23299.16对照1组31.47102.34对照2组47,23183.38对照3组42.11158.56
对照4组50.21196.52对照5组35.34106.98对照6组55.36185.18对照7组47.03153.48对照8组53.32188.24对照9组31.67102.59对照10组49.83172.72对照11组42.73155.38对照12组46.78180.32实施例4和实施例5试验结果表明，中草药原料间的配伍及发酵菌种间的协同作用对复方中草药玛卡的提取及其体外抗氧化能力有着显著的影响。
[0031]
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。