一个调控棉纤维伸长生长的MYB基因及其应用的制作方法

技术领域：

本发明涉及一个棉花纤维快速伸长期优势表达的myb家族转录因子及其编码基因，命名为ghfem1(fiberelongation-relatedmybtranscriptionfactor1)，该基因能够正调控陆地棉纤维伸长生长。本发明所涉及的fem1基因是一个在棉花纤维品质改良上有重要价值的基因，通过杂交、转基因等技术方法，可将该基因用于棉花纤维品质改良的分子育种研究。

背景技术：
：

棉花(gossypiumhirsutum)是重要的棉纺织工业原料和战略物质储备资源，棉花产业在我国国民经济生产中具有举足轻重的作用。我国目前国产“高等级棉”短缺，“低等级棉”过剩，已无法满足纺织企业转型升级发展需求，优质棉花严重依赖于进口，制约了我国纺织工业的产品竞争力的提升及其健康发展。因此，培育高产优质棉花品种是目前我国棉花育种的当务之急，也是我国现今棉花育种的重要目标。

棉纤维是棉花种子表面的表皮毛，是由胚珠外表皮细胞分化而来的不分支的单细胞毛状突起。棉纤维细胞发育可分为纤维起始、伸长(初生壁合成)、次生壁合成及脱水成熟四个时期。其中，快速伸长期是控制着棉花纤维细胞最终长度的时期，对棉花品质有着决定性的影响。快速伸长期开始于开花后5天左右，并且一直持续到开花后19–20天，这段时间是陆地棉纤维生长的高峰期，其最快的生长速度可达到2毫米/天。在这段时间内，棉纤维生长速度呈现为“s"形曲线，即：开始伸长较慢，6–12天生长速度最快，至棉花开花后的15–20天，纤维生长的长度可以达到棉纤维成熟长度的80％。在此期间优势表达的转录因子可能通过复杂的调控网络有效控制棉纤维伸长发育，对棉纤维品质改良具有重要意义。

myb蛋白是植物中一个大型蛋白家族，通常含有一个保守的dna结合结构域，被命名为myb结构域。依据myb结构域数目的不同，myb蛋白被分为4类：含有一个myb结构域的myb相关蛋白(myb-relatedprotein)，含有2个myb结构域的r2r3-myb蛋白，含有3个myb结构域的r1r2r3-myb蛋白和含有4个myb结构域的4r-myb蛋白。植物myb转录因子能够结合不同的顺式作用元件——myb结合位点(mbs)，其识别序列有一定的灵活性，但结合相同顺式作用元件的不同物种的myb转录因子也可能调控相同的途径。

植物myb蛋白的功能多种多样，它们参与植物初生和次生代谢过程，调控植物的配子发育，参与植物生物和非生物胁迫应答，调控植物细胞的形态结构以及模式建成。研究表明，拟南芥atmyb11、atmyb12及atmyb111和大豆gmmyb9a1能够控制类黄酮生物合成，而拟南芥atmyb75、atmyb90、atmyb113和atmyb114控制花青素的生物合成。猴面花rcp1和苜蓿wp1可以调控类胡萝卜素的生物合成。拟南芥atmyb20、atmyb42、atmyb46、atmyb52、atmyb54、atmyb58、atmyb63、atmyb69、atmyb83、atmyb85和atmyb103可启动木质素、纤维素和木聚糖的生物合成。gl1(一个r2r3myb转录因子)和atmyb23控制拟南芥表皮毛的起始。在拟南芥叶表皮细胞中，只有表达gl2蛋白的细胞最终分化为表皮毛细胞，而gl1-ttg1-gl3复合物能够直接促进gl2和r3-myb的表达。而r3-myb蛋白能够迅速移动到邻近细胞，与gl1竞争性结合gl3，抑制gl2的表达，从而使得此细胞不能分化为表皮毛细胞。此外，atmyb23一方面可以与gl1共同控制拟南芥表皮毛的起始，与atmyb5共同调控表皮毛伸长；另一方面则可以受atmyb66调控而促进根毛形成基因的表达。以上研究结果表明，myb家族转录因子在表皮毛发育的信号传导过程中起着至关重要的作用。此外，还有研究表明，拟南芥myb基因能够调控根毛生长而不影响根毛密度。水稻mph1能够通过控制节间细胞的长度从而影响水稻的株高。苹果myb39l参与花粉管生长的调控过程。相对于拟南芥来说，棉花中myb类转录因子的调控机制研究相对滞后，其在棉花纤维伸长发育过程中的功能尚未见到系统报道。

技术实现要素：
：

本发明的目的在于提供一个正调控棉花纤维伸长发育的myb转录因子及其编码基因。

本发明所提供的myb转录因子编码基因名称为ghfem1，来源于陆地棉(gossypiumhirsutum)，该基因全长序列为1149bp，开放阅读框为933bp，编码一个含310个氨基酸的蛋白质，分子量为33.8kda。该转录因子具有典型的myb结构域和转录抑制因子结合结构域(ear-domain)(图1)。分别用定量rt-pcr和蛋白印迹分析了ghfem1在棉花各组织/器官中的表达谱。结果如图2所示，该基因在伸长生长阶段的棉纤维细胞中优势表达。我们分析了该蛋白的亚细胞定位，构建了pbi-ghfem1:gfp融合表达载体，转化农杆菌，再将含有该表达载体的农杆菌注入烟草叶片，2天后取烟草叶片下表皮置于激光共聚焦显微镜观察荧光，结果显示ghfem1-gfp融合蛋白定位于细胞核中(图3)。同时，构建了pgbkt7-ghfem1载体，转化酵母菌株ah109，利用酵母系统检测该蛋白的转录激活活性。结果如图4所示，含有pgbkt7-ghfem1载体的ah109只能在sd/-trp培养基上生长，而不能在sd/-trp/-ade选择培养基上生长，说明该蛋白并不具有转录激活活性，可能作为转录抑制因子发挥其功能。

进一步，我们构建了分别由棉纤维特异性启动子tua9和rdl1启动的ghfem1基因的rna干扰(rnai)载体(tua9:ghfem1rnai载体，rdl1:ghfem1rnai载体)，转化棉花，获得ghfem1rnai转基因棉花。定量rt-pcr分析表明，ghfem1基因在转基因棉花纤维中的表达量显著降低(图5a)。表型分析表明，转基因棉花株高、株型、叶片大小及形态、结实率、棉桃大小、种子大小均与野生型没有明显差异(图5b-d)，但其纤维长度明显短于野生型(图5e和5f)。而且，br信号及细胞伸长相关的下游基因(如ghnced1、ghmyb109、ghcesa10、ghaif2和ghcpd等)在转基因棉花纤维中表达量显著变化(图6)。这些结果都说明ghfem1在棉纤维细胞伸长生长和相关品质性状形成中发挥重要调控作用，具有改良棉纤维品质的潜在应用价值。

本发明的优点：

1、提供了一个棉花新基因ghfem1的全长基因序列和所编码的蛋白质序列。分析表明，该基因在棉纤维伸长发育时期优势表达，蛋白质结构分析证实该基因编码蛋白属于r2r3myb转录因子。通过酵母系统检测了该蛋白的转录激活活性，证实ghfem1蛋白作为转录抑制因子对下游基因发挥调控作用。

2、分析了ghfem1蛋白的亚细胞定位，证实该蛋白定位于细胞核，与其转录因子的特性相符。

3、在棉纤维伸长阶段，抑制ghfem1在棉纤维中的表达导致br信号及细胞伸长相关的下游基因(如ghnced1、ghmyb109、ghcesa10、ghaif2和ghcpd等)在转基因棉花纤维中的表达发生显著变化，从而影响棉纤维伸长生长，最终导致纤维长度明显变短。这说明ghfem1能够正向调控棉纤维细胞伸长生长，具有改良棉纤维品质的潜在应用价值。可用于通过杂交、转基因等方式进行棉花纤维品质改良的分子育种研究。

本发明通过以下附图和实施进行进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

附图说明：

图1.ghfem1基因的鉴定。(a)ghfem1蛋白结构域分析：r2、r3结构域(黑色)和转录抑制因子结合结构域(eardomain,灰色)。(b)ghfem1的基因结构。黑框代表外显子，线形代表3’-非翻译区，起始密码、终止密码均已标出。

图2.ghfem1表达模式分析。(a)荧光定量rt-pcr分析ghfem1基因在棉花各组织及不同发育时期的纤维中的表达模式；(b)蛋白印迹分析ghfem1蛋白在棉花各组织及纤维中的表达模式。0dpa，开花当天胚珠；3dpa，开花后3天胚珠及纤维；6dpa，开花后6天纤维；9dpa，开花后9天纤维；12dpa，开花后12天纤维；15dpa，开花后15天纤维；18dpa，开花后18天纤维；21dpa，开花后21天纤维；25dpa，开花后25天纤维；r，根；s，茎；c，子叶；l，叶；h，下胚轴；a，花药；p，花瓣。

图3.ghfem1蛋白亚细胞定位分析。左图(gfp)：ghfem1-gfp融合蛋白在烟草叶片细胞中表达产生的gfp绿色荧光；中图(dapi)：细胞核特异性染色剂dapi对烟草叶片细胞染色显示红色荧光，指示细胞核的位置；右图(merge)：左图和中图重叠合并的图像，表明gfp与dapi荧光完全重合，从而证明ghfem1蛋白定位于细胞核中。

图4.ghfem1蛋白激活活性分析。(a)酵母转化子在sd/-trp/-ade培养基上划线生长。(b)冻融法检测酵母转化子中β-半乳糖苷酶活性，以转入空的pgbkt7载体的酵母转化子作为阴性对照，以转入pgbkt7-ghmyb24(具有转录激活活性的转录因子)载体的酵母转化子作为阳性对照。

图5.ghfem1rnai棉花表型分析。(a)ghfem1rnai转基因棉花株型及株高比较。(b)ghfem1rnai转基因棉花叶型比较。(c)ghfem1rnai转基因棉花棉桃大小、形态比较。(d)ghfem1rnai转基因棉花成熟种子形态、大小比较。(e)ghfem1rnai转基因棉花成熟纤维比较。(f)ghfem1rnai转基因棉花成熟纤维长度测量及统计分析。结果表明，抑制ghfem1基因表达，导致纤维发育受阻，长度变短；l1-l3，rnai转基因棉花株系,l1-1、l1-2是l1株系的两个植株，l2-1、l2-2是l2株系的两个植株，l3-1、l3-2是l3株系的两个植株，代表同一株系的重复测试结果。用t-test进行统计学分析，*代表转基因和野生型之间存在显著性差异(p<0.05)，**代表转基因和野生型之间存在极显著性差异(p<0.01)。

图6.定量rt-pcr分析一些棉纤维发育及br信号通路相关的重要基因在ghfem1rnai转基因棉花纤维中表达量，其中每一列中从左到右分别是wt，r1，r2，r3，r4，r5的ghnced1、ghnced5、ghpal等表达量结果，test进行统计学分析，*代表转基因和野生型之间存在显著性差异(p<0.05)，**代表转基因和野生型之间存在极显著性差异(p<0.01)。r1-r5，rnai转基因棉花株系。结果显示：在棉纤维中抑制ghfem1的表达引起ghnced1、ghnced5、ghpal、ghgt5、ghant17、ghaif2和ghcpd的表达量显著上调，而ghcesa10和ghmyb109的表达量显著下调。wt：野生型；r1–r5：5个ghfem1rnai转基因棉花株系。

具体实施方式：

1、棉花ghfem1基因基因组dna序列和cdna分离克隆

用ctab法提取棉花开花后9天纤维rna(按lixb,cail,chengnh,liujw,2002.molecularcharacterizationofthecottonghtub1genethatpreferentiallyexpressedinfiber.plantphysiol.130:666-674进行)，用superscript^tmiirnaseh-reversetranscriptase(invitrogenlifetechnologies)反转录成cdna；然后，以cdna为模板，用基因特异的引物(ghfem1-orf-l5’-ggggaattcatggatgtaacaagcacacc-3’和ghfem1-orf-r5’-cttggatcctcactcgatcttactcatcc-3’)及高保真dna聚合酶pfu，在94℃-5分钟，1个循环；94℃-1分钟，58℃-1分钟，72℃-1.5分钟，29个循环；最后，72℃延伸10分钟的pcr反应条件下，扩增得到一个约为1kb的dna片段(fem1基因),如seqidno.1所示。将该片段插入到pbluescriptsk-载体中。利用该质粒上的t3和t7启动子对目的dna片段进行测序，得到其orf序列，再利用3'-race获得其3'-utr区，用dnastar软件分析该dna序列，与cdna序列进行比较，分析ghfem1基因中的内含子大小和插入位置。结果显示:fem1的dna基因序列全长1149bp，仅一个外显子区，无内含子，编码区933bp(从第86–1018bp)，atg为起始密码，tga为终止密码；第1–85bp为5’-上游区，第1019–1149bp为3’-非翻译区。

棉花ghfem1基因编码的蛋白质序列如seqidno.2所示,。

ghfem1蛋白结构域分析证实该基因编码蛋白属于r2r3myb转录因子。如图1(a)：r2、r3结构域(黑色)和转录抑制因子结合结构域(eardomain,灰色)。ghfem1的基因结构如图1(b)。黑框代表外显子，线形代表3’-非翻译区，起始密码、终止密码均已标出。

2、实时荧光定量rt-pcr分析

1)棉花各组织总rna的提取(按蒋建雄、张天真，2003，利用ctab/酸酚法提取棉花组织总rna。棉花学报，15:166-167进行)。

2)逆转录：按m-mlv逆转录酶(promega公司)的使用说明书操作。

3)实时荧光定量pcr：按荧光定量pcr试剂盒(toyobo)的使用说明书操作。以棉花持家基因ghubi1作为内参，计算基因表达的相对值。为了得到最佳的实验效果，pcr扩增条件及引物效率都以目的基因的cdna为模板进行优化。该实验中每个组织采集3次样品，分别提取rna，每个样品的rna重复3次实时定量rt-pcr实验，最后统计9次实验结果，计算其平均值和标准差。定量rt-pcr和蛋白印迹分析ghfem1在棉花各组织/器官中的表达谱的结果如图2所示，其中:图2(a)荧光定量rt-pcr分析ghfem1基因在棉花各组织及不同发育时期的纤维中的表达模式；(b)蛋白印迹分析ghfem1蛋白在棉花各组织及纤维中的表达模式。0dpa，开花当天胚珠；3dpa，开花后3天胚珠及纤维；6dpa，开花后6天纤维；9dpa，开花后9天纤维；12dpa，开花后12天纤维；15dpa，开花后15天纤维；18dpa，开花后18天纤维；21dpa，开花后21天纤维；25dpa，开花后25天纤维；r，根；s，茎；c，子叶；l，叶；h，下胚轴；a，花药；p，花瓣。

结果显示:该基因在伸长生长阶段的棉纤维细胞中优势表达。

3、ghfem1蛋白亚细胞定位分析

①构建pbi-ghfem1:gfp融合表达载体,将载体转化入农杆菌gv3101感受态细胞中，30℃摇床过夜活化阳性单菌落。

②取活化的菌液至含有卡那霉素和四环素的液体lb培养基中，30℃摇床培养，待到其od600在1左右时，5000转，离心10分钟。弃去上清。

③用配制好的渗透缓冲液(10μm氯化镁、0.5％葡萄糖、200μmas、10μmmes)将农杆菌液混匀，之后室温避光重悬2个小时左右。

④选取生长幼嫩的烟草叶片，利用注射器将菌液通过气孔注射入幼嫩的烟草叶片部位。用透明袋将注射完毕的烟草罩起来，在培养室中培养2天，将透明袋去掉。

⑤撕取烟草叶表皮细胞，经dapi染色后于共聚焦显微镜下观察并拍照。结果显示ghfem1-gfp融合蛋白定位于细胞核中(图3)。

4、ghfem1转录激活活性检测

将pgbkt7空载体、pgbkt7-ghmyb24(一个确定有转录激活活性的转录因子)和pgbkt7-ghfem1载体通过liac/peg法转化酵母菌株ah109和y187，pcr检测确定阳性菌落后，分别将含有pgbkt7空载体、pgbkt7-ghmyb24和pgbkt7-ghfem1载体的ah109菌落分别划线于sd/-trp/-ade平板上，待生长2-3天后观察是否有新的菌落生长。将含有pgbkt7空载体、pgbkt7-ghmyb24和pgbkt7-ghfem1载体的y187菌落接种于液体sd/-trp液体培养基中，过夜培养，取1ml菌液集菌后点于滤纸上，在液氮中反复冻融三次后，在加有β-巯基乙醇和x-gal的z-buffer中显色，检测lacz报告基因是否被激活表达。结果如图4所示，含有pgbkt7-ghfem1载体的ah109只能在sd/-trp培养基上生长，而不能在sd/-trp/-ade选择培养基上生长，说明该蛋白并不具有转录激活活性，可能作为转录抑制因子发挥其功能。

5、ghfem1rnai转基因棉花的创制及表型分析

构建tua9和rdl1启动子启动ghfem1rnai载体(tua9:ghfem1rnai载体，rdl1:ghfem1rnai载体)，转化农杆菌，然后通过农杆菌介导浸染棉花下胚轴，将转化后的外植体进行筛选培养，选出抗性愈伤组织。然后在分化培养基上诱导分化出胚性愈伤组织，再转入胚诱导培养基中诱导分化出体细胞胚，再生出苗，移栽到大田中生长发育成熟，开花结实。取开花后9天的棉纤维提取rna，通过实时荧光定量rt-pcr分析转基因棉纤维中ghfem1及其br信号和细胞伸长相关基因的表达。待棉花成熟后，收取第二至第五果枝的前5个棉桃，手工测量其纤维长度。

定量rt-pcr分析表明，ghfem1基因在转基因棉花纤维中的表达量显著降低(图5a)。表型分析表明，转基因棉花株高、株型、叶片大小及形态、结实率、棉桃大小、种子大小均与野生型没有明显差异(图5b-d)，但其纤维长度明显短于野生型(图5e和5f)。而且，br信号及细胞伸长相关的下游基因(如ghnced1、ghmyb109、ghcesa10、ghaif2和ghcpd等)在转基因棉花纤维中表达量显著变化(图6)。这些结果都说明ghfem1在棉纤维细胞伸长生长和相关品质性状形成中发挥重要调控作用，具有改良棉纤维品质的潜在应用价值。

说明书核苷酸和氨基酸序列表

＜110＞华中师范大学

＜120＞一个调控棉纤维伸长生长的myb基因及其应用

＜160＞2

＜210＞1

＜211＞1149bp

＜212＞dna

＜213＞棉花(gossypiumhirsutum)

＜400＞1

ggggaaaaaaaaaacacacacacacacacacacacatccaaagaacccaagtccttccct60

attgcatgcctttcaatttgatttcatggatgtaacaagcacaccaaatagaaaagaaat120

ggatcggatcaaaggtccatggagccccgaagaagatgacttgctccagcagctggtaca180

gaaacatggccccagaaactggtctttgatcagcaaatcaatccccggccgatccggtaa240

atcctgtcggctccgatggtgcaatcaactgtcaccgcaagttgagcaccgtgccttcac300

cccggaagaagacgagaccatcatccgagcacatgccaggttcggtaacaagtgggccac360

catagcccgactcctcaacggccgtaccgacaacgccattaaaaaccactggaactccac420

gctaaaacgtaagtgcttgccggttggggaagagtgtaatttcgttgctaatggagggta480

tgatggtaatctgggaggagaggaacggcaaccgttgaaaagatcggtgagtgctggtct540

atacatgagtccagggagcccatcgggatcggatgtgagcgattctagtgttcccgtctt600

atcatcttcttacgtgtacaagccgatcccaaggaccggcggtgttaacgttgatgtaaa660

tgttacgccagctggagtggaagcggtatcatcttccaacgatccaccgacctcactgag720

tctgtctttaccgggggtggagtcatgtgaggtggtgtcaacccagccaataacggagtc780

aactcagaatcggagtgaagaaaggggaggtggggtgatgggtttcagtgcggagtttat840

ggcggcgatgcaagagatgataagggttgaggtgaggaattacatgacgcagatgcagca900

acagcagcagcagcaaaacggcgcagttccgggaggagcgggaatggggatgtgtttgga960

tggggggttcaggaattttatggctgtgaaccgagtcgggatgagtaagatcgagtgaaa1020

ggttaaaaatgagagtaaaagatgagaaaaaactgggctgtgttttttcttggtatgggg1080

attaggcggtgaataattttgttcattttacggagagagagatgggtgaaaaagctaaaa1140

aatgacaag1149

＜210＞1

＜211＞310

＜212＞prt

＜213＞棉花(gossypiumhirsutum)

＜400＞1

metaspvalthrserthrproasnarglysglumetaspargile

151015

lysglyprotrpserproglugluaspaspleuleuglnglnleu

202530

valglnlyshisglyproargasntrpserleuileserlysser

354045

ileproglyargserglylyssercysargleuargtrpcysasn

505560

glnleuserproglnvalgluhisargalaphethrprogluglu

657075

aspgluthrileileargalahisalaargpheglyasnlystrp

808590

alathrilealaargleuleuasnglyargthraspasnalaile

95100105

lysasnhistrpasnserthrleulysarglyscysleuproval

110115120

glygluglucysasnphevalalaasnglyglytyraspglyasn

125130135

leuglyglyglugluargglnproleulysargservalserala

140145150

glyleutyrmetserproglyserproserglyseraspvalser

155160165

aspserservalprovalleusersersertyrvaltyrlyspro

170175180

ileproargthrglyglyvalasnvalaspvalasnvalthrpro

185190195

alaglyvalglualavalserserserasnaspproprothrser

200205210

leuserleuserleuproglyvalglusercysgluvalvalser

215220225

thrglnproilethrgluserthrglnasnargserglugluarg

230235240

glyglyglyvalmetglypheseralagluphemetalaalamet

245250255

glnglumetileargvalgluvalargasntyrmetthrglnmet

260265270

glnglnglnglnglnglnglnasnglyalavalproglyglyala

275280285

glymetglymetcysleuaspglyglypheargasnphemetala

290295300

valasnargvalglymetserlysileglu

305310