一种结合超滤法和超速离心法的外泌体提取方法与流程

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本发明涉及外泌体提取分离技术领域，具体是一种结合超滤法和超速离心法的外泌体提取方法。


背景技术：

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外泌体是一种由活细胞分泌，直径在40-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中。目前主要使用的结合超滤法和超速离心法的外泌体提取方法主要为超速离心法、超滤法、密度梯度离心法、试剂盒提取、免疫磁珠法等，但超速离心法和超滤法应用较为普遍。
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超速离心法大体包含4个步骤：
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(1)低速离心去除残留细胞；
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(2)高速离心去除细胞碎片；
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(3)0.22μm滤膜过滤去除大直径囊泡；
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(4)超速离心沉淀外泌体，为提高纯度可选用蔗糖密度梯度离心。
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但超速离心法也有操作耗时长、分离效率低、仪器昂贵等缺点。
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超滤法是将溶剂及小分子物质过滤到膜的另一侧，而将相对大分子物质截留在超滤膜上，以达到分离的目的。外泌体直径范围40～150nm，最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径，可用于收集大于800nm、400nm或200nm物质，也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体。但超滤法的过滤膜上容易形成死细胞残体和蛋白质等多种物质的堆积，堵塞的可能性大，影响过滤效率，更会导致外泌体的粘附，从而造成损失。而且，过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。
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目前结合超滤法和超速离心法的外泌体提取方法仍是以超滤法为主，没有结合两种方法、简化了外泌体提取步骤的提取方法。


技术实现要素：

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针对目前外泌体提取方法复杂的问题，本发明提出了一种结合超滤法和超速离心法的外泌体提取方法，合理结合超速离心法和超滤法，实现简化外泌体提取步骤、方便快捷提取外泌体的目的。
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本发明提出的技术方案如下：一种结合超滤法和超速离心法的外泌体提取方法，所述的方法包括以下步骤：
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步骤一：将超滤膜呈倒圆锥形安装固定在外泌体提取离心管内；
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步骤二：在所述外泌体提取离心管内注入上清液并低速离心，直至大分子离心沉淀在所述超滤膜底部；
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步骤三：高速离心，直至所述外泌体滤出超滤膜；
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步骤四：取出超滤膜，得到所述外泌体。
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进一步作为本发明技术方案的改进，所述低速离心为离心力1500-2200g，离心时
间为8-15分钟，；所述高速离心为离心力9000-12000g，离心时间为25-40分钟。
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进一步作为本发明技术方案的改进，所述超滤膜孔径为0.15-0.30μm。
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进一步作为本发明技术方案的改进，所述外泌体提取离心管内有固定所述超滤膜的凸点和凹槽。
[0020]
进一步作为本发明技术方案的改进，所述凸点位于所述外泌体提取离心管管体内壁、超滤膜上沿对应处，所述凹槽位于所述所述外泌体提取离心管管体底部的所述超滤膜。
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与现有技术相比，本发明的优势之处为：
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1、通过结合超速离心法和超滤法的部分步骤，先低速离心利用超速离心法沉积了大分子物质在超滤膜底部，再高速离心利用离心力作为超滤法的外加力使外泌体穿过了超滤膜，即完成分离提取外泌体的目的，无需多次人工提取过滤等操作，简化了外泌体提取步骤，规避了使用超速离心法费时费力、高度依赖人工、回收率低等缺点，摒弃了传统的超滤法中采用多种器械来进行过滤提取等操作步骤。
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2、通过将超滤膜设置为倒圆锥形安装在外泌体提取离心管内来提取外泌体，使得超滤膜斜置，低速离心时大分子沉积在超滤膜底部，但不堵塞超滤膜上部，使得高速离心使外泌体顺利滤出超滤膜，避免了超滤法的超滤膜垂直放置，而使超滤膜孔被细胞或者生物大分子堵塞的问题，从而影响外泌体分离率。
附图说明
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图1是本发明提取外泌体的流程图。
具体实施方式
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为了使本领域技术人员更好地理解本技术的技术方案，下面结合附图对本技术进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本技术的保护范围有任何的限制作用。
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应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
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需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该技术产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本技术的限制。
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此外，术语“水平”、“竖直”、“悬垂”等术语并不表示要求部件绝对水平或悬垂，而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相对“竖直”而言更加水平，并不是表示该结构一定要完全水平，而是可以稍微倾斜。
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在本技术的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本技术中的具体含义。
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本发明提出的一种结合超滤法和超速离心法的外泌体提取方法，所述的方法包括以下步骤：
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步骤一：将超滤膜呈倒圆锥形安装固定在外泌体提取离心管内；
[0032]
步骤二：在所述外泌体提取离心管内注入上清液并低速离心，直至大分子离心沉淀在所述超滤膜底部；
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步骤三：高速离心，直至所述外泌体滤出超滤膜；
[0034]
步骤四：取出超滤膜，得到所述外泌体。
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优选的，所述低速离心为离心力2000g，离心时间为10分钟，；所述高速离心为离心力10000g，离心时间为30分钟。
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优选的，所述超滤膜孔径为0.22μm。
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优选的，所述外泌体提取离心管内有固定所述超滤膜的凸点和凹槽。
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优选的，所述凸点位于所述外泌体提取离心管管体内壁、超滤膜上沿对应处，所述凹槽位于所述所述外泌体提取离心管管体底部的所述超滤膜。
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本发明的原理如下：将细胞上清液加入到放置好超滤膜的外泌体提取离心管中，低速离心时，采用了超速离心法的原理，上清液首先受离心力作用，大分子沉积在了超滤膜的底部，外泌体等在上部；然后高速离心，采用了超滤法的原理，离心力作为施加给外泌体的外加力，使得外泌体穿过了超滤膜，与大分子等物质分离开，进入了外泌体提取离心管，如此外泌体便被提取了出来。
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以上仅是本技术的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将技术的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本技术的保护范围。