一种鉴别近单双倍体恶性间皮瘤的标志物及其鉴别方法与流程

[0001]
本发明涉及作用于鉴别近单倍体和近双倍体恶性间皮瘤的诊断标志物，属于生物医学分析领域。


背景技术：

[0002]
恶性间皮瘤(malignant mesothelioma，mm)是一种侵袭性胸膜肿瘤，具有高度侵袭性和预后差的特征。空气中的石棉暴露是间皮瘤发生、发展主要的致病因素，职业辐射和既往的胸部辐射治疗也是间皮瘤发展的危险因素。恶性间皮瘤潜伏期时间长，发病高峰期在接触后45年，其总体5年生存率为8.5％，近几十年来其发病率持续上升。
[0003]
恶性间皮瘤在临床上早期症状不明显，大多数患者在确诊时已是晚期。目前，治疗mm的方法包括手术、放疗和化疗，但均未能显著改善患者生存时间。手术切除包括胸膜切除术/切除纵隔淋巴结/胸膜外肺切除术等，通常适用于上皮样型mm年轻患；放射治疗可以缓解晚期疾病的症状，但难以避开周围正常组织，且对完整肺的毒性很高；对于不能进行手术和放疗的晚期患者，化疗成为他们唯一的选择。
[0004]
setdb1是组蛋白甲基转移酶家族的成员之一，人源setdb1由1291个氨基酸残基组成，全长约143.1kda，含有22个外显子(gene id：9869)，其主要引起组蛋白h3第9位的赖氨酸残基发生甲基化，在基因转录抑制和常染色体基因沉默的生物网络中具有多重调控功能。已有研究表明setdb1在间皮瘤细胞中存在一定的突变率，但其功能未知。
[0005]
mm肿瘤细胞根据其染色体数目缺失数，可分为近单倍体核型(near-haploid)和近双倍体核型(near-diploid)。在恶性间皮瘤中，近单倍体核型较少(小于5％)，目前仅有一例双相样mm的近单倍体核型被报道，而近双倍体型则较为常见。有研究者认为近单倍体型的产生会导致大量遗传物质损失，可能影响肿瘤进展无关的区域，但这种损失也可能会消除重要肿瘤抑制基因，导致肿瘤发展。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于为鉴别近单倍体和近双倍体恶性间皮瘤寻找新的标志物及其发现该标志物的肿瘤抑制功能。
[0007]
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种鉴别近单双倍体恶性间皮瘤的标志物，其特征在于所述标志物为甲基化酶setdb1，所述setdb1通过表达显著抑制了间皮瘤细胞的生长、克隆形成、ros生成以及体内肿瘤生长，在间皮瘤细胞中发挥肿瘤抑制子的功能，并在近单倍体间皮瘤细胞中表达缺失，却在近双倍体间皮瘤细胞中正常表达，从而鉴别近单双倍体恶性间皮瘤。
[0008]
一种利用权利要求1所述的鉴别近单双倍体恶性间皮瘤的鉴别方法，该方法包括如下步骤：
[0009]
a.分别构建携带lenti-gfp、lenti-setdb1、lenti-setdb1-gfp基因的慢病毒表达载体，并感染近单倍体间皮瘤细胞株,建立过表达setdb1模型，western blot；
[0010]
b.嘌呤霉素筛选30天建立稳转细胞株lenti-gfp、setdb1、setdb1-gfp，通过ctg法检测细胞生长；
[0011]
c.嘌呤霉素筛选30天建立稳转细胞株lenti-gfp、setdb1、setdb1-gfp，进行克隆形成实验并定量分析；
[0012]
d.嘌呤霉素筛选30天建立稳转细胞株lenti-gfp、setdb1-gfp，检测细胞活性氧ros水平；
[0013]
e.稳转细胞株裸鼠成瘤实验；
[0014]
f.将正常间皮细胞、各组近单倍体和近双倍体间皮瘤细胞裂解，western blot。
[0015]
本发明通过甲基化酶setdb1来鉴别解决了恶性间皮瘤中近单双倍体特征，从而可以快速的判断肿瘤发展情况。
附图说明
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图1是间皮瘤细胞株过表达setdb1后setdb1和h3k9-me2/3蛋白的表达情况；
[0017]
图2是ctg检测过表达setdb1对间皮瘤细胞生长的影响；
[0018]
图3是过表达setdb1对间皮瘤克隆形成的影响；
[0019]
图4是定量分析setdb1过表达对间皮瘤细胞的克隆形成影响；
[0020]
图5是过表达setdb1对间皮瘤细胞ros产生的影响；
[0021]
图6是裸鼠成瘤实验中，过表达setdb1对间皮瘤肿瘤生长的影响；
[0022]
图7是裸鼠成瘤实验中，过表达setdb1对注射瘤液35天后裸鼠肿瘤重量的影响；
[0023]
图8是裸鼠成瘤实验中，过表达setdb1对注射瘤液35天后体内裸鼠肿瘤生长的影响；
[0024]
图9是在正常间皮细胞、近单倍体和近双倍体间皮瘤细胞中setdb1蛋白的表达情况。
具体实施方式
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下面将结合具体实例以及附图对本发明作详细介绍，本发明在实施中选用的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。一种鉴别近单双倍体恶性间皮瘤的标志物，其特征在于所述标志物为甲基化酶setdb1，所述setdb1通过表达显著抑制了间皮瘤细胞的生长、克隆形成、ros生成以及体内肿瘤生长，在间皮瘤细胞中发挥肿瘤抑制子的功能，并在近单倍体间皮瘤细胞中表达缺失，却在近双倍体间皮瘤细胞中正常表达，从而鉴别近单双倍体恶性间皮瘤。
[0026]
一种利用权利要求1所述的鉴别近单双倍体恶性间皮瘤的鉴别方法，该方法包括如下步骤：
[0027]
a.分别构建携带lenti-gfp、lenti-setdb1、lenti-setdb1-gfp基因的慢病毒表达载体，并感染近单倍体间皮瘤细胞株,建立过表达setdb1模型，western blot；
[0028]
b.嘌呤霉素筛选30天建立稳转细胞株lenti-gfp、setdb1、setdb1-gfp，通过ctg法检测细胞生长；
[0029]
c.嘌呤霉素筛选30天建立稳转细胞株lenti-gfp、setdb1、setdb1-gfp，进行克隆形成实验并定量分析；
[0030]
d.嘌呤霉素筛选30天建立稳转细胞株lenti-gfp、setdb1-gfp，检测细胞活性氧ros水平；
[0031]
e.稳转细胞株裸鼠成瘤实验；
[0032]
f.将正常间皮细胞、各组近单倍体和近双倍体间皮瘤细胞裂解，western blot。
[0033]
具体实验分析
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本发明的要点是首先利用携带lenti-gfp、lenti-setdb1、lenti-setdb1-gfp基因的慢病毒载体感染近单倍体间皮瘤细胞，稳定过表达setdb1，通过细胞生长(ctg法)、克隆形成、细胞活性氧ros以及裸鼠成瘤实验检测过表达setdb1对间皮瘤细胞生长的影响，结果发现setdb1在间皮瘤细胞中发挥肿瘤抑制子的功能。最后western blot分析setdb1在正常间皮细胞、近单倍体间皮瘤和近双倍体间皮瘤细胞中蛋白的表达情况，表明肿瘤抑制子setdb1在近单倍体间皮瘤中普遍缺失，而在近双倍体间皮瘤细胞中正常表达，表达情况存在明显差异性，具体包括以下步骤：
[0035]
a.慢病毒包装：将293t铺板于p100中，并用无抗生素10％fbs的1640培养一天；在ep管中加750μl无血清1640，加入质粒(lenti-gfp/setdb1/setdb1-gfp、δ8.9、vsv-g，三者比例为10:10:1)和20μl plus reagent；混合均匀后孵育15min；取750μl无血清1640和30μl lipofectamine，混合后加入dna-plus中；混合均匀后孵育15min；加入细胞中，培养3h后换液；次日换成完全培养基并收集上清；5000rpm，4℃离心30min后于-80℃保存。慢病毒感染细胞：将间皮瘤细胞提前一天铺至六孔板中，培养箱中培养；弃培养基，培养基和病毒按比例加入六孔板中，总体积为1.2ml，同时加入1μl 10μg/μl的螯合剂polybrene；12h后换成完全培养基；培养4天后收蛋白，western blot检测蛋白的表达。
[0036]
免疫印迹结果如图1所示，间皮瘤细胞株meso542和meso257已稳定过表达setdb1。b.将meso542、meso257筛选30天的稳转细胞株lenti-gfp、setdb1-gfp以4000个/孔，提前一天铺至96孔板中，培养3,6,9天弃培养基并加入70μl/孔的ctg检测液；水平振荡器震荡2min，静置10min；转移溶液至新的白色96孔板，发光检测仪检测，结果如图2。
[0037]
结果表明过表达setdb1显著抑制间皮瘤细胞的增殖能力。
[0038]
c.将meso542、meso257筛选30天的稳转细胞株lenti-gfp、setdb1-gfp以3000个/孔铺至六孔板中，培养箱中培养至克隆形成；弃培养液，pbs清洗，空气干燥；每孔加入1ml甲醇固定20min；弃甲醇，空气干燥；每孔加入1ml结晶紫染色30min；回收结晶紫；洗去染液，空气干燥，拍照，如图3。33％的醋酸洗脱结晶紫；检测a
570nm
处吸光度，作图，如图4。
[0039]
结果表明过表达setdb1抑制了间皮瘤细胞克隆的形成。
[0040]
d.细胞活性氧ros检测：将相同数目的meso542、meso257筛选30天的lenti-gfp、setdb1-gfp细胞分于六孔板中，置于培养箱中培养48h；每孔中加入2μl浓度为2μm dcfh-a探针，培养箱中孵育1h；胰酶消化，制成悬液；1000rpm离心5min，弃上清；用pbs重悬，重复上一步；用pbs重悬，将细胞液以100μl/孔转移至黑色酶标板中；酶标仪测定荧光值。
[0041]
如图5，结果表明setdb1过表达后抑制了肿瘤细胞ros产生。
[0042]
e.裸鼠成瘤实验：将间皮瘤meso542 lenti-gfp、setdb1-gfp两种稳转细胞铺入p150中，待到长满后用胰液消化；细胞计数，稀释成1.0
×
106个/100μl；离心后，细胞用100μl溶液(pbs和基质胶1:1配置)重悬；取16只雌性裸鼠随机分为两组(8+8)，分别注射meso542 lenti-gfp、meso542 setdb1-gfp细胞悬液，构建裸鼠体内转移瘤模型。每组左右腋下各注
射100μl的瘤液；每天观察，静待肿瘤的形成；在第35天时，每组处死4只，取出肿瘤，结果如图6，结果显示，注射过表达setdb1细胞的肿瘤与对照相比，明显减小。统计肿瘤重量如图7发现，setdb1的表达对肿瘤生长的抑制率达57％。将剩余分为lenti-gfp+h2o，setdb1-gfp+h2o两组，每组各2只，每天腹腔注射水，同时在饮用水中给予一定浓度的叶酸减少生殖毒性。一周后处死所有裸鼠，剥除肿瘤。结果如图8显示，setdb1-gfp+h2o组比lenti-gfp+h2o组肿瘤小，可见setdb1过表达抑制体内肿瘤生长能力。
[0043]
f.选用1株正常间皮细胞(lp9)和20株间皮瘤细胞，弃培养基，用pbs清洗一次；加入100μl左右的裂解液；细胞刮刀刮下细胞，转移至ep管；将ep管置于4℃冰箱的转盘上，裂解2h；4℃，12000rpm离心30min；收上清测体积。测定蛋白浓度后制备成2mg/ml的蛋白样品；sds-page凝胶电泳；western blot,ecl显色液显色，成像仪拍照记录。细胞株显影结果如图9，间皮瘤细胞株包括正常间皮细胞lp9，近单倍体型间皮瘤细胞meso257、meso542、meso136、meso507、meso295、meso963、meso59、jmn1b，近双倍体型间皮瘤细胞meso428、meso924、meso729、meso281、meso381、meso933、meso1028、meso647、meso863、meso764、meso383、meso188。
[0044]
结果表明setdb1主要在近单倍体型间皮瘤细胞中表达缺失，而在近双倍体型间皮瘤细胞中正常表达。