MAP3K8检测试剂在制备牙髓炎筛查试剂盒及抑制剂在制备治疗牙髓炎的药物中的用途的制作方法

map3k8检测试剂在制备牙髓炎筛查试剂盒及抑制剂在制备治疗牙髓炎的药物中的用途
技术领域
[0001]
本发明涉及map3k8检测试剂在制备牙髓炎筛查试剂盒及抑制剂在制备治疗牙髓炎的药物中的用途。


背景技术：

[0002]
牙髓炎是指发生于牙髓组织的炎性病变。牙髓组织是一种疏松结缔组织，富含血管，神经和细胞外基质，位于牙本质包绕的牙髓腔内。当牙齿受到龋坏、外伤等时，牙髓暴露可导致细菌和毒素经牙本质小管侵入牙髓，使牙髓组织受激惹导致炎症发生。牙髓炎的主要症状是疼痛，如自发疼痛或者饮食时出现疼痛，严重影响人们的生活品质。如果能够找到与牙髓炎有关的生物标记物，通过对生物标记物的检测准确检测出牙髓炎，指导临床用药，将对患者有很大帮助。
[0003]
有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶8(map3k8，基因序列号为ensembl:ensg00000107968)在全身组织中广泛表达，其在免疫系统、炎症反应、及癌症发生中的作用尤为突出。同时，研究发现map3k8缺失对多种炎症有影响，如支气管炎、肠炎等。但是，研究表明map3k8缺失对于不同疾病的炎症反应影响是不同的。如：研究表明小鼠卵清蛋白引起的支气管炎症反应过程中，map3k8的缺失由于th2细胞分化导致ige水平的升高和剧烈的哮喘反应，即map3k8缺失导致炎症反应加剧；而在克罗恩肠炎(ibd)小鼠炎症模型中，map3k8缺失导致淋巴细胞数量减少，缓解疾病的发生及恶化。
[0004]
但目前尚未见map3k8与牙髓炎相关的现有技术。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供map3k8检测试剂在制备牙髓炎筛查试剂盒及抑制剂在制备治疗牙髓炎的药物中的用途。
[0006]
本发明提供了检测map3k8表达水平的试剂在制备牙髓炎筛查试剂盒中的用途。
[0007]
进一步地，所述检测map3k8表达水平的试剂为测序用试剂；
[0008]
和/或，所述检测map3k8表达水平的试剂为pcr试剂；优选地，所述检测map3k8表达水平的试剂为qpcr试剂；
[0009]
和/或，所述检测map3k8表达水平的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或酶联免疫分析试剂；
[0010]
和/或，所述检测map3k8表达水平的试剂为western blot试剂；
[0011]
和/或，所述检测map3k8表达水平的试剂为蛋白芯片检测方法用试剂。
[0012]
进一步地，所述检测map3k8表达水平的试剂是检测人组织中map3k8的试剂；
[0013]
优选地，所述检测map3k8表达水平的试剂是检测人牙髓组织中map3k8的试剂；
[0014]
更优选地，所述检测map3k8表达水平的试剂为检测map3k8 mrna表达水平的试剂。
[0015]
本发明还提供了一种牙髓炎筛查试剂盒，它包括用于检测map3k8表达水平的试
tissue)中各基因表达结果：a为正常牙髓组织和炎症牙髓组织中各基因的热图显示；b为正常牙髓组织和炎症牙髓组织中map3k8基因的表达。
[0037]
图2为map3k8表达下调病毒抑制牙髓组织的炎症反应的结果：a为sham组h&e结果；b为aav-scramble组h&e结果；c为aav-map3k8-down组h&e结果。
具体实施方式
[0038]
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0039]
实施例1、map3k8在炎症牙髓组织中表达显著上升
[0040]
1、方法
[0041]
收集2019年10月-2020年2月间，在四川大学华西口腔医院因自发痛、冷热刺激痛于牙体牙髓科就诊，临床诊断为不可复性牙髓炎，并计划进行根管治疗的炎症牙髓组织3例。同时因正畸需求，就诊于颌面外科要求拔除正畸牙的正常牙髓组织3例。收集各患者牙髓组织，利用trizol试剂(invitrogen,ca,usa)提取组织的总rna，按照本领域常规方法进行全基因组的转录组测序(rna-seq)，即利用bioanalyzer 2100和rna 6000nanolabchip kit(agilent,ca,usa)行总rna数量和纯度检测，提取polya rna，行rna剪切和逆转录成cdna，构建cdna文库，利用illumina x10高通量测序平台进行全转录组序列检测。按照统计学t检验方法，筛选并统计分析具有表达差异的基因(log2差异倍数＞1，或log2差异倍数＜-1，并且p值＜0.05)。
[0042]
2、结果
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牙髓组织转录组分析结果如图1所示。图1显示，质量控制合格的情况下，炎症牙髓组织(inflammed pulp tissue)中，map3k8的mrna表达相对于正常牙髓组织(control pulp tissue)显著升高，升高倍数为3.9倍，且具有显著统计学差异。
[0044]
3、结论
[0045]
人牙髓组织中，炎症刺激下显著升高map3k8的mrna表达。即相对于正常牙髓组织，炎症牙髓中map3k8的mrna表达显著升高。因此，通过检测牙髓组织中的map3k8 mrna表达水平，能够达到牙髓炎筛查的目的。
[0046]
实施例2、牙髓炎筛查试剂盒的组成及使用方法
[0047]
任何检测map3k8 mrna表达水平的试剂都可以用于制备牙髓炎筛查试剂盒。
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实施例3、map3k8表达下调病毒抑制牙髓组织的炎症反应
[0049]
1、方法
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1.1质粒构建以及病毒包埋
[0051]
使用aav helper-free system生产重组aav颗粒(即map3k8表达下调病毒)，它能使牙髓干细胞内map3k8表达下调，为本发明的一种优选map3k8抑制剂，其流程如下：
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1)设计大鼠源性map3k8(rno-map3k8)目的片段，靶序列为ggcgcagtcgaatacctaa(seq id no.1)。将上述序列克隆进入病毒载体gv479，为实验组(aav-map3k8-down组)。对照组(aav-scramble组)插入的序列为ttctccgaacgtctcacgt(seq id no.2)。该病毒载体包含反向末端重复(itr)序列及多克隆位点(mcs)片段。其元件顺序为u6-mcs-cag-egfp。
[0053]
2)将上述重组表达质粒同phelper(携带腺病毒来源的基因)和paav-rc(携带aav复制和衣壳基因)共转染进aav-293细胞(提供aav复制和包装所需的反式作用因子)。
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3)从被感染aav-293细胞中收集aav病毒颗粒上清液。
[0055]
4)将上述上清液进行2次cscl密度梯度离心和1次超滤，用以去除上清液中的细胞蛋白和残留的cscl离子，以此纯化病毒。
[0056]
5)用定量pcr法测定得到病毒的滴度。最终获得的病毒滴度为3.15
×
10
12
v.g./ml。分装并于-80℃保存病毒。
[0057]
实验组得到map3k8表达下调病毒；对照组得到对照病毒。
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1.2构建大鼠牙髓炎模型
[0059]
将sd大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，随机分成3组仰卧固定，双侧上颌第一磨牙，用1/4#球钻在咬合面开髓，暴露完整髓腔，生理盐水冲洗髓腔内牙本质碎屑，生理盐水小棉球置于牙髓断面与髓腔内，使牙髓组织暴露口腔环境而感染。3日后麻醉下取出棉球，行牙髓断面生理盐水冲洗，牙髓断面放置可吸收凝胶海绵，显微注射器注射1μl药物试剂于牙髓断面，树脂材料充填窝洞。按照注射药物试剂的不同，分为以下几组：(1)未处理组(sham组)，未进行开髓操作；(2)对照组(aav-scramble组)，注射对照病毒(携带序列如seq id no.2所示dna的病毒)；(3)实验组(aav-map3k8-down组)，注射map3k8表达下调病毒(携带序列如seq id no.1所示dna的病毒)。在处理72小时后处死大鼠。全身福尔马林灌注，取出实验磨牙牙周矩形颌骨骨块，置于4％多聚甲醛中固定24小时，行石蜡切片免疫染色，检测牙髓炎症情况。
[0060]
2、结果
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h&e染色结果显示：放置aav-scramble药物的大鼠第一磨牙牙髓断面呈典型的炎症状态，冠髓呈坏死崩解状态，细胞核破碎溶解，炎症区域扩展至根髓(图2b)。放置aav-map3k8-down药物的大鼠的牙髓炎症状态明显缓解，由坏死崩解状态转变为纤维化修复状态，牙髓断面呈纤维样结构，成束的纤维组织将坏死区域与根髓区域分离开，见血管新生(图2c)。
[0062]
3、结论
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aav-map3k8-down药物可以有效地抑制牙髓的炎症反应，抑制炎症细胞反应，减少组织坏死。说明map3k8抑制剂可以用于制备治疗牙髓炎的药物。
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综上，在人牙髓炎症组织中map3k8 mrna表达显著升高，通过检测人牙髓组织中map3k8 mrna表达，可以筛查待测人群患牙髓炎的风险：若map3k8 mrna表达显著升高，则患牙髓炎风险高。同时，对map3k8表达进行抑制可以有效抑制牙髓炎症反应，减少组织坏死。因此，本发明检测map3k8的试剂盒可用于牙髓炎的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据；而map3k8抑制剂可以用于制备治疗牙髓炎的药物。本发明检测试剂盒以及map3k8抑制剂均具有良好的应用前景。