[0001]
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种细菌的标记方法，该细菌能被巨噬细胞吞噬，从而实现巨噬细胞中细菌的标记。
背景技术：
[0002]
巨噬细胞属于免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞macrophages是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片或病原体进行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。
[0003]
细胞荧光标记在细胞生物学、生物医学等领域得到广泛使用，如流式细胞仪、激光扫描共聚焦显微镜等广谱分析等。新型、简洁的细菌(特别是致病菌)的荧光标记对细菌病理学与免疫学的研究提供了极大的便利。而传统的细菌荧光标记使用表达绿色荧光蛋白表达细菌。该方法需要对细菌进行dna转染，蛋白表达等技术手段处理。另外，研究者采用d-氨基酸缀合荧光素与细菌在生长溶液中孵育，该探针被细菌吸收，通过细胞代谢途径，共价键连接在细菌的细胞壁。该方法能够荧光标记含有不同细菌，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌；标识细菌细胞壁，不改变细菌外膜结构，便于研究细菌表面成分的生物学功能；可以实现活细菌的标记。但是如何实现活细胞中细菌的标记仍是研究的热点。
技术实现要素：
[0004]
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提出了一种巨噬细胞中幽门螺丝杆菌的标记方法。主要通过合成具有靶向和显色作用的碳纳米球，靶向标记幽门螺丝杆菌，实现幽门螺丝杆菌的可视化标记，然后将标记的幽门螺丝杆菌转染至巨噬细胞中，实现巨噬细胞中幽门螺丝杆菌的标记。其中，甘露糖能靶向巨噬细胞，适配体能靶向幽门螺丝杆菌，染色剂能显色。
[0005]
为了实现这样的目的，在本发明的技术方案中，首先通过合成具有靶向和显色作用的碳纳米球，靶向标记幽门螺丝杆菌，实现幽门螺丝杆菌的可视化标记，然后将标记的幽门螺丝杆菌转染至巨噬细胞中。
[0006]
本发明的方法包括如下步骤：
[0007]
1、碳纳米球的制备
[0008]
配制浓度为10-20份的柠檬酸100份去离子中，充分搅拌后转入带有聚四氟乙烯内胆的高压反应釜，在120-200℃条件下，反应时间24小时，反应结束后，反应釜自然冷却到约60℃，用乙醇和去离子水依次洗涤数次，离心分离，真空烘干，得到碳纳米球。
[0009]
2、碳纳米球的表面修饰
[0010]
将10-20份的氨基修饰的甘露糖与20-40份的碳纳米球超声分散于100份去离子水
中，再分别加入5-10份的染色剂和适配体，在搅拌条件下，缓慢加入与碳纳米球质量比为1：1的偶联剂，室温下反应24小时，反应后溶液经离心、沉淀、洗涤，干燥后，得到表面修饰的碳纳米球。
[0011]
3、细菌的靶向定位与巨噬细胞的转染
[0012]
将制备的表面修饰的碳纳米球与幽门螺丝杆菌共培养24小时后，洗去未吸附的碳纳米球。再将吸附碳纳米球的幽门螺丝杆菌转染至巨噬细胞中，通过荧光显微镜观察细菌在细胞中的状态。
[0013]
上述的偶联剂可以为：1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，其中edc和nhs的质量比为1:1。
[0014]
上述的染色剂为叶绿素铜钠盐、柠檬黄、赤藓红的一种。
[0015]
上述的适配体序列为tgcgtgtttacgtgtcgatgtccgggtaccctcgg。
[0016]
本发明的优点在于：
[0017]
(1)本发明以生物质碳源为原料制备碳纳米球。所用原料生物安全性高、毒性小，碳纳米球表面具有丰富的含氧基团，易于进一步功能化。
[0018]
(2)本发明中甘露糖能靶向巨噬细胞，适配体能靶向幽门螺丝杆菌，染色剂能显色，实现了多功能的作用。
具体实施方式
[0019]
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0020]
实施例1
[0021]
1、碳纳米球的制备
[0022]
配制浓度为20份的柠檬酸100份去离子中，充分搅拌后转入带有聚四氟乙烯内胆的高压反应釜，在200℃条件下，反应时间24小时，反应结束后，反应釜自然冷却到约60℃，用乙醇和去离子水依次洗涤数次，离心分离，真空烘干，得到碳纳米球。
[0023]
2、碳纳米球的表面修饰
[0024]
将20份的氨基修饰的甘露糖与40份的碳纳米球超声分散于100份去离子水中，再分别加入10份的叶绿素铜钠盐和适配体，在搅拌条件下，缓慢加入与碳纳米球质量比为1：1的edc和nhs，室温下反应24小时，反应后溶液经离心、沉淀、洗涤，干燥后，得到表面修饰的碳纳米球。
[0025]
3、细菌的靶向定位与巨噬细胞的转染
[0026]
将制备的表面修饰的碳纳米球与幽门螺丝杆菌共培养24小时后，洗去未吸附的碳纳米球。再将吸附碳纳米球的幽门螺丝杆菌转染至巨噬细胞中，通过荧光显微镜观察细菌在细胞中的状态。
[0027]
实施例2
[0028]
1、碳纳米球的制备
[0029]
配制浓度为10份的柠檬酸100份去离子中，充分搅拌后转入带有聚四氟乙烯内胆的高压反应釜，在120℃条件下，反应时间24小时，反应结束后，反应釜自然冷却到约60℃，用乙醇和去离子水依次洗涤数次，离心分离，真空烘干，得到碳纳米球。
[0030]
2、碳纳米球的表面修饰
[0031]
将10份的氨基修饰的甘露糖与20份的碳纳米球超声分散于100份去离子水中，再分别加入5份的柠檬黄和适配体，在搅拌条件下，缓慢加入与碳纳米球质量比为1：1的edc和nhs，室温下反应24小时，反应后溶液经离心、沉淀、洗涤，干燥后，得到表面修饰的碳纳米球。
[0032]
3、细菌的靶向定位与巨噬细胞的转染
[0033]
将制备的表面修饰的碳纳米球与幽门螺丝杆菌共培养24小时后，洗去未吸附的碳纳米球。再将吸附碳纳米球的幽门螺丝杆菌转染至巨噬细胞中，通过荧光显微镜观察细菌在细胞中的状态。
[0034]
实施例3
[0035]
1、碳纳米球的制备
[0036]
配制浓度为15份的柠檬酸100份去离子中，充分搅拌后转入带有聚四氟乙烯内胆的高压反应釜，在150℃条件下，反应时间24小时，反应结束后，反应釜自然冷却到约60℃，用乙醇和去离子水依次洗涤数次，离心分离，真空烘干，得到碳纳米球。
[0037]
2、碳纳米球的表面修饰
[0038]
将15份的氨基修饰的甘露糖与30份的碳纳米球超声分散于100份去离子水中，再分别加入5份的赤藓红和适配体，在搅拌条件下，缓慢加入与碳纳米球质量比为1：1的edc和nhs，室温下反应24小时，反应后溶液经离心、沉淀、洗涤，干燥后，得到表面修饰的碳纳米球。
[0039]
3、细菌的靶向定位与巨噬细胞的转染
[0040]
将制备的表面修饰的碳纳米球与幽门螺丝杆菌共培养24小时后，洗去未吸附的碳纳米球。再将吸附碳纳米球的幽门螺丝杆菌转染至巨噬细胞中，通过荧光显微镜观察细菌在细胞中的状态。