一种链霉菌及其发酵产乐普霉素B的方法与流程

一种链霉菌及其发酵产乐普霉素b的方法
技术领域
1.本发明涉及工业微生物发酵技术领域，具体涉及一种链霉菌及其发酵产乐普霉素b的方法。


背景技术：

2.乐普霉素b(leptomycin b)(cas号：87081-35-4)是一种不饱和支链脂肪酸，分子式是c
33h48
o6，分子量为540.73，化学结构式如图4所示。
3.乐普霉素b最初发现于链霉菌streptomyces sp.ats1287的发酵液中(hamamoto t,gunji s,tsuji h,beppu t.leptomycins a and b,new antifungal antibiotics.i. taxonomy of the producing strain and their fermentation,purification and characterization.jantibiot(tokyo).1983；36(6):639-645.doi:10.7164/antibiotics.36.639)，被鉴定为具有抗真菌活性的不饱和支链脂肪酸。
4.乐普霉素b作为一种常用的出核转运抑制剂，可以通透细胞，抑制细胞核向细胞浆的蛋白转运，其抑制出核转运的机理为乐普霉素b可以直接与crm1 (chromosome maintenance protein 1，一种参与细胞主动运输的核出口受体)结合，抑制crm1与靶输出蛋白的核定位信号相互作用，从而抑制crm1和带有出核信号的蛋白结合，最终导致由crm1介导的出核转运的抑制。
5.近年来，随着研究的深入，发现该化合物具有显著的抗肿瘤活性，因此，乐普霉素b在抗恶性肿瘤方面也成为一种潜在的靶向性药物。2017年lorenzobrunetti等人在《blood》杂志上发表的文章中表明，乐普霉素b通过抑制突变型npm1蛋白出核，从而诱导急性髓细胞白血病(aml)m2亚型患者白血病细胞分化(brunetti,lorenzo et al acute myeloid leukemia with mutated npm1 isdependent on the cytoplasmic localization of npm1c,[j]blood,2017,877.)。2018 年殷倩倩等人在《中国病理生理杂志》发表的文章中表明，通过抑制runx3蛋白出核转运，lmb可明显降低乳腺癌细胞的活力并抑制乳腺癌细胞的增殖(殷倩倩,马东慎,魏瑜,刘慧.不同分子亚型乳腺癌细胞系中runx3蛋白表达及定位研究[j].中国病理生理杂志,2018,34(09):1603-1609.)。
[0006]
乐普霉素b发酵方面，现有的技术中，hamamoto t等人报道了通过培养链霉菌streptomyces sp.ats1287并经分离纯化后，可获得一定量的乐普霉素b，但是，发酵液中乐普霉素b在菌丝体中的最高效价约40mg/l，发酵水平较低，菌种较为原始，不适于工业化的应用(hamamoto t,gunji s,tsuji h,beppu t. leptomycins a and b,new antifungal antibiotics.i.taxonomy of the producing strainand their fermentation,purification and characterization.j antibiot(tokyo). 1983；36(6):639-645.doi:10.7164/antibiotics.36.639)。因此，寻找一种新的可高效发酵获得乐普霉素b的菌种具有重要的意义。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的之一在于提供一种链霉菌(streptomyces sp.)hdcc00025，该微生物菌种于2020年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.20886，，并登记在册，证明存活。
[0008]
本发明的目的还在于提供了一种链霉菌(streptomyces sp.)hdcc00025 (cgmcc no.20886)在制备乐普霉素b或者含有乐普霉素b的药物组合物的应用。
[0009]
本发明还提供了一种乐普霉素b的制备方法，该方法包括采用链霉菌 (streptomyces sp.)hdcc00025(cgmcc no.20886)在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵的步骤。
[0010]
在优选的实施方案中，上述可同化的碳源选自玉米淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、甘油、豆油、山梨醇、甘露醇之一或者上述物质的组合，优选玉米淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、豆油之一或任意几种的组合。
[0011]
在优选的实施方案中，上述可同化的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐之一或者上述物质的组合，优选黄豆饼粉、大豆卵磷脂、酵母抽提粉、酵母粉之一或任意几种的组合。
[0012]
在优选的实施方案中，上述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或上述物质的组合，优选碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾。
[0013]
在优选的实施方案中，所述营养培养基含有玉米淀粉10-50g/l、麦芽糊精 10-50g/l、豆油5-20g/l、酵母抽提粉1-15g/l、大豆卵磷脂5-20g/l、黄豆饼粉5-20g/l、酵母膏5-20g/l、硫酸镁1-10g/l、磷酸氢二钾2-8g/l、碳酸钙0-50 g/l。
[0014]
在优选的实施方案中，所述有氧发酵的温度为20-35℃，优选23-30℃；培养基ph为5.0-8.0，优选5.0-7.0；培养时间为24-240小时，优选72-168小时；通氧量为0.1-2.0vvm，优选0.5-2.0vvm。
[0015]
在优选的实施方案中，所述链霉菌(streptomyces sp.)hdcc00025(cgmccno.20886)是通过种子液接种至所述营养培养基中进行所述发酵培养的；其中，所述种子液是将链霉菌(streptomyces sp.)hdcc00025(cgmcc no.20886)在种子培养基里进行种子培养得到的；所述种子培养的条件为：种子培养的温度为 20℃-30℃，优选23℃-28℃；培养基ph为5.0-8.0，优选5.0-7.0；培养时间为 24-80小时，优选24-60小时。
[0016]
在优选的实施方案中，所述的种子培养基含有葡萄糖5-20g/l、玉米淀粉5-20 g/l、黄豆饼粉5-20g/l、酵母抽提粉1-10g/l、碳酸钙1-20g/l，硫酸镁1-10g/l，磷酸氢二钾1-10g/l。
[0017]
本发明乐普霉素b通过以下条件进行hplc检测：
[0018]
色谱柱：agilent poroshell 120ec-c18(4.6
×
50mm，2.7μm)
[0019]
柱温：30℃；
[0020]
进样体积：2μl；
[0021]
流速：0.5ml/min；
[0022]
检测波长：225nm；
[0023]
分析时间：10min；
[0024]
流动相：
[0025]
流动相a：0.1％(体积百分比)磷酸水溶液；
[0026]
流动相b：0.1％(体积百分比)磷酸乙腈溶液；
[0027]
时间(min)07.58.58.610流动相a(％)3810103838流动相b(％)6290906262
[0028]
本发明链霉菌(streptomyces sp.)hdcc00025(cgmcc no.20886)主要生物学特征为：菌落形态圆整，表面凸起，菌落直径大小约7～15mm，菌落表面有沟纹，中间偶稍凹陷，基质菌丝发达，与培养基结合紧密，不易挑起，颜色呈米色或淡黄色，气生菌丝白色，产孢丰富，前期淡黄色，后期转浅青色、灰色，无可溶性色素。
[0029]
本发明菌株(streptomyces sp.)hdcc00025(cgmcc no.20886)为一株全新的乐普霉素b产生菌，生产能力高，其产生乐普霉素b的能力比现有技术中其他菌种有了大幅度的提高，乐普霉素b的效价可维持在1200mg/l以上，有利于实现工业化生产。
附图说明
[0030]
图1为菌株hdcc00025(cgmcc no.20886)在isp2培养基上的显微镜检图 (400
×
)。
[0031]
图2为菌株hdcc00025(cgmcc no.20886)在isp2培养基上的菌落特征图。
[0032]
图3为菌株hdcc00025(cgmcc no.20886)通过发酵培养后，对菌体进行分离提取，经hplc检测的乐普霉素b图谱。
[0033]
图4乐普霉素b(leptomycin b)化学结构式。
具体实施方式
[0034]
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0035]
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0036]
其中所用放线菌dna提取试剂盒购自北京三博远志生物技术有限责任公司；
[0037]
pcr产物纯化回收所用的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0038]
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0039]
实施例1：菌株来源
[0040]
链霉菌(streptomyces sp.)hdcc00025(cgmcc no.20886)是从中国浙江省湖州市莫干山某山坡的土壤中分离得到。
[0041]
在莫干山区域土壤进行交叉采样，随机取5个采样点，每个点取土壤样品 10g，放入锥形瓶中，混合均匀后取样品10g，加入到一个装入90ml无菌水的锥形瓶中(瓶中有一个磁力搅拌器)，漩涡搅拌30分钟，使其充分混匀制成悬浊液，即为10-1
菌悬液。用稀释涂布平
板法将上述悬浊液与无菌水按照体积比1： 9稀释成10-2
，10-3
，10-4
，10-5
浓度，取不同稀释倍数菌悬液0.1ml，涂布于isp2 培养基平板中，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布，室温下静置30分钟后置于28℃恒温培养箱。待菌落长出后，观察记录菌落颜色、透明度、菌落表面、边缘形态。最终挑取1000株菌株接种于isp2培养基制成斜面，并进行发酵验证。用接种环挑取斜面培养的菌体一环，分别接种于含有20ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，于28℃条件下震荡培养1天后，再吸取1ml移种于含有20ml 发酵培养基的250ml锥形瓶中，于28℃条件下震荡培养3天后，经hplc检测所得发酵液中乐普霉素b的含量，挑选出最高产菌株即链霉菌(streptomyces sp.) hdcc00025(cgmcc no.20886)。
[0042]
种子培养基配方(g/l)：葡萄糖10g/l，淀粉10g/l，黄豆饼粉10g/l，酵母抽提粉5g/l，碳酸钙15g/l，硫酸镁1.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，加水定容至1000 ml，ph 7.0
±
0.1。
[0043]
发酵培养基配方(g/l)：玉米淀粉40g/l，麦芽糊精20g/l，酵母抽提粉5g/l，酵母粉10g/l，酵母膏10g/l，碳酸钙30g/l，加水定容至1000ml，ph 7.0
±
0.1。
[0044]
实施例2：链霉菌(streptomyces sp.)hdcc00025(cgmcc no.20886)的形态学、培养学特征、生理生化特征。
[0045]
参照《链霉菌鉴定手册》、《放线菌的分类与鉴定》、《常见细菌系统鉴定手册》等书中的有关内容进行实验：颜色的判断参照ral k7色卡中的颜色进行对照。
[0046]
1、菌株的形态学特征：将菌株hdcc00025(cgmcc no.20886)接种于isp2 培养基中进行插片培养，28℃培养3-5天后取盖玻片于载片中，在光学显微镜下 400
×
倍观察，结果见图1。
[0047]
2、菌株培养学特征：菌株hdcc00025(cgmcc no.20886)在isp2培养基上28℃条件下培养7～10天后，菌落形态椭圆形，有放射状条纹，表面凸起，菌落直径大小约7～15mm，菌落表面有沟纹，中间偶稍凹陷，基质菌丝发达，与培养基结合紧密，不易挑起，颜色呈米白色，气生菌丝白色，产孢丰富，前期浅黄色，后期转浅灰色，无可溶性色素，结果见图2。
[0048]
其他培养学特征则采用isp1、isp3、isp4、isp5、苹果酸钙、高氏一号、营养琼脂7种培养基，28℃条件下培养7～10天后，观察其菌落、菌丝、孢子及色素产生情况，结果如表1所述。
[0049]
表1菌株hdcc00025(cgmcc no.20886)在7种培养基上的培养特征
[0050][0051]
3、生理生化特征试验：结果表2～表7。
[0052]
a)碳源的利用：采用isp9作为基础培养基，各种碳源的终浓度均为1.0％，见表2。
[0053]
b)无机氮源的利用：采用isp9作为基础培养基，硝酸钾和硫酸铵的浓度均为0.1％，见表2。
[0054]
c)降解试验和nacl耐受实验采用基础培养基为gyea(ph6.8)，各种降解物的浓度及降解试验结果见表3；nacl耐受实验结果见表7。
[0055]
d)过氧化氢酶试验、ph试验和温度试验均采用isp2培养基。过氧化氢酶试验结果见表4，ph试验结果见表5，温度试验结果见表6。
[0056]
e)m.r、v-p等实验采用《常见细菌系统鉴定手册》方法，结果见表4。
[0057]
f)除温度实验外，均为28℃培养7～10天。
[0058]
表2菌株hdcc00025的碳源和氮源的利用情况
[0059]
碳源生长情况碳源生长情况无机氮源生长情况d-葡萄糖4水杨苷2硫酸铵+d-棉子糖1d-乳糖4硝酸钾-d-木糖1半乳糖2
ꢀꢀ
d-山梨醇3肌醇1
ꢀꢀ
l-阿拉伯糖2甘露醇3
ꢀꢀ
甘油3甘氨酸1
ꢀꢀ
麦芽糖4木聚糖2
ꢀꢀ
d-果糖3菊粉3
ꢀꢀ
d-蔗糖3鼠李糖3
ꢀꢀ
[0060]
表3菌株菌株hdcc00025的降解试验结果
[0061]
降解物降解物浓度结果降解物降解物浓度结果腺嘌呤0.5％3，+酪蛋白1％4，+鸟嘌呤0.5％4，-酪氨酸1％3，-黄嘌呤0.4％3，-tween-401％4，-木聚糖0.4％3，-tween-601％3，-次黄嘌呤0.4％4，+tween-801％3，-[0062]
表4菌株hdcc00025主要的生理生化特征
[0063][0064][0065]
表5菌株hdcc00025生长的ph试验
[0066][0067]
表6菌株hdcc00025生长的温度试验
[0068]
温度(℃)714283745生长情况12420
[0069]
表7菌株hdcc00025对nacl的耐受性
[0070]
nacl浓度1％4％7％10％菌株生长情况3100
[0071]
备注：表2-7中，0：无生长；1：生长很弱；2：能生长，有少量孢子；3：生长良好，有大量孢子；4：生长最好，有丰富孢子；+：阳性；-：阴性。
[0072]
实施例3菌种鉴定
[0073]
1、链霉菌hdcc00025(cgmcc no.20886)的16s rdna序列分析
[0074]
参照《分子克隆实验指南》书中的有关内容进行实验。收集菌丝体，然后用放线菌
dna提取试剂盒抽提总dna。采用通用引物27f(2 7 f：5
’‑
a g a g tt t g a t c c t g g c t c a g-3’)/1495r(1 4 9 2r：5
’ꢀ‑
tacggctaccttgttacgactt-3’)进行16srdna序列扩增，扩增体系和pcr 反应程序如表8所示，pcr产物检测采用0.8％琼脂糖凝胶电泳，pcr产物纯化回收采用sanprep柱式pcr纯化产物试剂盒，纯化后的pcr产物直接送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。
[0075]
表8 pcr扩增体系和反应程序
[0076][0077]
菌株hdcc00025(cgmcc no.20886)所测的16s rdna的序列经校对后，与 genbank数据库中相关种、属的序列进行同源序列blast比较，以确定该菌株的分类地位。
[0078]
菌株hdcc00025(cgmcc no.20886)所测得到的16s rdna序列(seq idno:3)，提交ncbi与genbank中相关序列进行blast比较，结果见表9(表中只列出同源性较高的模式菌株)。
[0079]
表9菌株hdcc00025(cgmcc no.20886)和典型模式菌株的同源性
[0080][0081]
通过对菌株hdcc00025 16s rdna区域进行测序，与genbank数据库中相关种、属的
序列进行同源序列blast比较，发现其与streptomyces scabrisporusstrain、streptomyces sp.等同源性均高达99.72％及以上，同时对菌株hdcc00025 进行表观特征试验，发现该菌株和链霉菌属(streptomyces sp.)分类相关参数非常接近，故将菌株hdcc00025鉴定为链霉菌属(streptomyces sp.)菌株。
[0082]
2、本发明链霉菌hdcc00025与其他乐普霉素b产生菌的比较如下：
[0083]
hamamoto t等人报道了链霉菌streptomyces sp.ats1287，该菌株在文献中描述的各种培养基中显示的菌落形态和孢子颜色，均与本发明的链霉菌hdcc00025 有较大不同。
[0084]
结合前述本发明的链霉菌hdcc00025的形态学、培养特征、生理生化特征和16s rdna序列鉴定结果，可知本发明的菌株hdcc00025属于链霉菌属 (streptomyces sp.)菌株，且不同于其他已知的乐普霉素b产生菌，故本发明的链霉菌hdcc00025是一株全新的乐普霉素b产生菌菌种。
[0085]
实施例4制备乐普霉素b发酵液
[0086]
(1)斜面孢子的制备与培养：
[0087]
斜面培养基配方(g/l)：酵母抽提粉4.0g/l，麦芽抽提物10.0g/l，葡萄糖4.0 g/l，琼脂20.0g/l，消前ph 7.2～7.4，试管30
×
200mm，装量15ml，经121℃灭菌20min，冷却至55-60℃左右摆斜面，待冷却凝固后，接种一环孢子或菌丝体至斜面，28
±
1℃培养7～10天后，孢子成熟。
[0088]
(2)种子液的制备与培养：
[0089]
种子培养基配方(g/l)：葡萄糖5g/l、玉米淀粉5g/l、黄豆饼粉20g/l、酵母抽提粉10g/l、碳酸钙1g/l，硫酸镁1g/l，磷酸氢二钾1g/l。消前ph 7.0； 250ml规格的三角摇瓶，装量50ml，121℃灭菌20min。接种107～108cfu/ml 至种子培养基中，28
±
1℃，250rpm振荡培养24小时，此时培养液ph 6.8-7.2，菌丝体浓度8％(体积百分比)。
[0090]
(3)发酵培养基的制备与培养：
[0091]
发酵培养基配方(g/l)：
[0092]
玉米淀粉10g/l、麦芽糊精10g/l、豆油5g/l、酵母抽提粉15g/l、大豆卵磷脂5g/l、黄豆饼粉5g/l、酵母膏5g/l、硫酸镁1g/l、磷酸氢二钾2g/l、碳酸钙0g/l。消前ph 5.0。250ml规格的三角摇瓶，装量20ml，121℃灭菌 20min。将种子液以5％(体积比)的接种量接入。在28
±
1℃，250rpm振荡培养 120小时。
[0093]
经hplc方法检测发酵液中乐普霉素b的含量，测得为1174ug/ml。
[0094]
实施例5制备乐普霉素b发酵液
[0095]
(1)斜面培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(1)
[0096]
(2)种子培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(2)
[0097]
(3)发酵培养基的制备与培养：
[0098]
玉米淀粉20g/l、麦芽糊精20g/l、豆油10g/l、酵母抽提粉10g/l、大豆卵磷脂10g/l、黄豆饼粉10g/l、酵母膏10g/l、硫酸镁5g/l、磷酸氢二钾5g/l、碳酸钙20g/l。消前ph 6.0。250ml规格的三角摇瓶，装量20ml，121℃灭菌 20min。将种子液以8％(体积比)的接种量接入。在23
±
1℃，250rpm振荡培养 72小时。
[0099]
经hplc方法检测发酵液中乐普霉素b的含量，测得为986ug/ml。
[0100]
实施例6制备乐普霉素b发酵液
[0101]
(1)斜面培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(1)；一级种子培养基配方及培养条件同实施例4中步骤(2)。
[0102]
(2)种子罐种子液的制备：
[0103]
种子罐中种子液培养基配方同实施例4中步骤(2)中种子培养基；
[0104]
在15l的种子罐中投入10l的种子培养基，用蒸汽灭菌，121℃灭菌20min，待冷却至28℃后接入一级的摇瓶种子液200ml。搅拌转速200rpm，通气量1.0 vvm，28
±
1℃培养24小时，此时种子液ph 7.4，菌丝浓度15％(体积比)。
[0105]
(3)发酵罐发酵液的制备：
[0106]
发酵培养基的配方
[0107]
玉米淀粉50g/l、麦芽糊精50g/l、豆油20g/l、酵母抽提粉15g/l、大豆卵磷脂20g/l、黄豆饼粉20g/l、酵母膏20g/l、硫酸镁10g/l、磷酸氢二钾8g/l、碳酸钙50g/l。消前ph 7.0。
[0108]
发酵罐体积50l，投料体积30l，用蒸汽灭菌，121℃，20min，待冷却至 28℃后接入种子罐种子液3l。搅拌转速300-600rpm(转速在前3天逐渐从300 rpm升至600rpm)，通气量2.0vvm，30℃培养168小时。
[0109]
经hplc方法检测发酵液中的乐普霉素b的含量为1218ug/ml。