一种基于叶酸的MIDA硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物及其制备与应用的制作方法

一种基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物及其制备与应用
技术领域
[0001]
本发明涉及一种基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物及其制备方法，本发明同时还涉及基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物在过氧化氢检测中的应用；本发明另外还涉及基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物作为药物递送载体的应用，属于化学合成领域和生物材料领域。


背景技术：

[0002]
过氧化氢（h2o2）是一种重要的活性氧分子，经氧化酶活化产生。它在生理过程中扮演多种角色，包括防御反应，蛋白质可逆氧化，氧化损伤和细胞信号转导等。研究发现在细胞器水平上，线粒体是h2o2的主要来源，也是氧消耗的主要细胞储存站。线粒体中产生的h2o2对生物体的影响利弊参半：一方面，线粒体h2o2可以为细胞存活、生长、分化及维护提供有益的推动作用；另一方面，过度生产的h2o2会导致诸多疾病，如炎症性疾病、心血管疾病、阿尔茨海默病和癌症等。因此，鉴于细胞内h2o2的稳态对人类健康和疾病的深远影响，有必要设计出新的荧光成像诊断方法，为实现对活细胞线粒体中h2o2的检测和量化提供理论指导。
[0003]
目前，基于h2o2为触发剂的靶向给药体系，主要集中于体外或细胞中对活性较高h2o2的检测。其存在的问题主要体现在：1）检测功能单一，不能实现在特定体内检测h2o2的同时，实现药物控释；2）体系复杂，响应速度慢，灵敏度低，具有较低的选择性，无法达到应有的治疗效果；3）缺乏诊断组件，从而丧失了检测目标性，易出现假阳性信号；4）缺乏理想的药物递送体系，即满足在血液循环中保持药物的零释放而在靶点发生迅速响应。因此，亟需搭建基于h2o2调控的诊疗一体式平台，以期达到对相关癌症早期预测与诊断的目的。
[0004]
综上所述，虽然已有部分检测过氧化氢的报道，并予以应用，但其响应功能单一，只能用于体外或细胞中对h2o2的定性或定量检测。此外，虽然明确h2o2与诸多疾病密切相关，但基于酸性敏感体系h2o2刺激的药物控释体系目前尚未报道。尤为重要的是，缺乏抗癌药物可以特异性地对肿瘤细胞进行识别。因此发展一种同时满足稳定性与响应性的荧光探针至关重要。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物及其制备方法；本发明的另一个目的是提供基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物在h2o2检测的应用。
[0006]
本发明的还有一个目的是提供基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物作为药物递送载体的应用。
[0007]
一、基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物的合成及制备
本发明提供的基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物，标记为lhx-1，其结构式如下：。
[0008]
本发明提供的基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物的制备方法，包括以下步骤：（1）将叶酸和无水三氟乙酸酐溶于四氢呋喃溶液中，于室温下反应10~12 h，反应完全后加入冰水混合物并用乙醚萃取，合并有机相，将溶液旋干，干燥后得淡黄色粉末；最后将其溶解于dmf溶液中，加入k2co3调ph至5.0~7.0，室温下搅拌后加入三氟乙酸酸化，洗涤，经柱层分离纯化即得叶酸衍生物。其中，叶酸和无水三氟乙酸酐的摩尔比为1:2.5~1:5。
[0009]
（2）将叶酸衍生物和4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于乙醇溶液中，于78℃回流4~6h，冷却至室温，洗涤、过滤可得基于叶酸的4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺类化合物。其中，叶酸衍生物和4-溴-1,8-萘二甲酸酐的摩尔比为1:1~1:3。
[0010]
（3）将基于叶酸的4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺类化合物溶解到甲醇溶液中，以硫酸铜为催化剂，加入甲醇钠（naome）于65℃下反应30min后，加入hi于40~55℃下反应3h，蒸干溶剂，得乳黄色固体物质，烘干后将其溶解到tfa中，并加入六亚甲基四胺（hmta），于60~75℃反应3~6h后，加入饱和食盐水，用ch2cl2进行萃取，蒸干有机相，柱层分离得基于叶酸的萘二甲酰亚胺类化合物。基于叶酸的4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺类化合物与naome摩尔比1:1~1:2；基于叶酸的4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺类化合物与硫酸铜摩尔比1:0.2~1:0.5；基于叶酸的4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺类化合物与hi摩尔比1:1~1:2.5；基于叶酸的4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺类化合物与六亚甲基四胺摩尔比1:0.3~1:0.6。
[0011]
（4）将基于叶酸的萘二甲酰亚胺类化合物、n-甲基亚胺基二乙酸（mida）硼酸酯和k2co3溶于乙腈溶液中，氮气保护下，常温搅拌反应10~15h；反应完全后，过滤并旋蒸溶剂，加入nabh4于常温下下继续反应20~24h，柱层分离得基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物。其中，基于叶酸的萘二甲酰亚胺类化合物、mida硼酸酯和k2co3的摩尔比1:1:1.5~1:1.5:2；基于叶酸的萘二甲酰亚胺类化合物和nabh4的摩尔比为1:1~1:1.5。
[0012]
基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物的质谱和氢谱谱图见图1和图2。
[0013]
二、基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物lhx-1在h2o2检测中的应用
1、lhx-1的荧光性能及对h2o2响应能力对lhx-1的dmso/pbs溶液（dmso：pbs=1:9，c=3
µ
m）进行荧光测试。研究发现，lhx-1因mida硼酸酯的阻断作用，无荧光发射性能，荧光探针化合物呈猝灭状态（图3）。当加入45eq h2o2时，在发射波长523nm处荧光强度达到最大值，这表明lhx-1对h2o2具有很好的响应能力（图3）。
[0014]
2、lhx-1对响应h2o2的影响对不同浓度的lhx-1的dmso/pbs溶液（dmso：pbs=1:9, λ
ex
=470 nm, λ
em
=523 nm），检测其与h2o2的响应过程。其中，探针浓度分别选择0.2 μm，0.5 μm，1 μm，2 μm，3μm，5μm，10 μm以及15 μm进行实验测试。实验结果表明，当lhx-1为3μm时，相对荧光强度比值最大（图4）。因此，lhx-1检测h2o2的最佳浓度为3μm，本专利选择在此浓度下进行。
[0015]
3、不同ph值对lhx-1响应h2o2的影响图5为本发明lhx-1在不同ph值下荧光响应曲线。从图中可以看到，在ph值范围为1.0到8.0之间，没有h2o2参与的情况下，化合物的荧光呈猝灭状态，即其荧光强度无明显变化。然而，当在体系中加入45eq h2o2时，随着ph值的增大，lhx-1的荧光强度也随之增强。在ph=5~6的范围内，lhx-1的荧光强度达到最大值。即在弱酸性条件下，lhx-1具有优良的光学性质，这表明lhx-1具备生物体应用潜力。
[0016]
4、lhx-1对h2o2单一选择性检测在lhx-1的dmso/pbs溶液（dmso：pbs=1:9，c=3
µ
m）中，分别加入45eq（相对于lhx-1）的金属离子k
+
、na
2+
、ca
2+
、mg
2+
、zn
2+
、cu
2+
、hg
2+
、fe
2+
、fe
3+
和活性氧物质h2o2、tbhp、hclo、ko2和no，只有h2o2的加入可以使lhx-1的dmso/pbs溶液在523nm处产生强烈荧光，金属离子k
+
、na
2+
、ca
2+
、mg
2+
、zn
2+
、cu
2+
、hg
2+
、fe
2+
、fe
3+
以及活性氧物质tbhp、hclo、ko2和no均不能使lhx-1的dmso/pbs溶液的荧光强度发生明显变化（如图6、7）。因此lhx-1能够对h2o2进行单一选择性识别。
[0017]
在lhx-1的dmso/pbs溶液（dmso：pbs=1:9，c=3
µ
m）中加入0~80eq h2o2进行荧光滴定实验（图8）。结果显示，在酸性条件下（ph=6.0）随着过氧化氢浓度的不断增大，化合物lhx-1荧光强度显著增强，直至饱和。
[0018]
基于荧光滴定实验，得出h2o2浓度在0~45eq内的线性回归方程（k=20.740, r2=0.984），如图9所示。通过方程计算得知lhx-1对h2o2的最低检测限为0.25
ꢀµ
m，这表明lhx-1具有非常高的灵敏度且弱酸性条件更有益于lhx-1灵敏度的提高，其作为药物载体为细胞内复杂环境下监测药物递送及释放提供了有力保障。
[0019]
5、lhx-1对h2o2的检测机理本发明lhx-1中荧光基团基于叶酸的萘二甲酰亚胺类化合物与猝灭基团mida硼酸酯连接，由于mida硼酸酯猝灭了基于叶酸的萘二甲酰亚胺类化合物的荧光，使得lhx-1无荧光发射性能。在h2o2的刺激下，猝灭基团mida硼酸酯快速断裂，并引发电子转移，猝灭基团mida硼酸酯的断裂使得荧光基团基于叶酸的萘二甲酰亚胺类化合物的荧光得以恢复并增强，实现了对于h2o2的高选择性、灵敏性检测。
[0020]
三、lhx-cpt的制备及药物释放性能1、lhx-cpt的制备将lhx-1作为药物载体，将药物喜树碱cpt负载于lhx-1上，具体制备如下：将lhx-1溶解
到乙醇中，加入药物喜树碱cpt于75~80℃下反应5~6h；反应结束后冷却室温，加入饱和食盐水，用ch2cl2进行萃取；将萃取物用无水na2so4干燥，抽滤，减压蒸馏除去溶剂，柱层分离即得lhx-cpt。lhx-1和喜树碱（cpt）的摩尔比为1:1.2~1:2.5。lhx-cpt的结构式如下：。
[0021]
2、药物释放性能图10为lhx-cpt在h2o2的dmso/pbs溶液中（ph=6）对cpt的释放曲线。从图中可以看出，在前10 min内药物释放速度缓慢；25 min后释放率达到61%；45 min后，药物释放率达到稳定状态，可达96%。从上述结果可知，基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物在弱酸性条件下极短时间内，抗癌药物cpt被充分释放。
[0022]
3、药物控释机理以基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物为药物载体，将药物喜树碱cpt负载于基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物上制备lhx-cpt。lhx-cpt在h2o2的刺激下，mida硼酸酯快速断裂，并引发电子转移，猝灭基团mida硼酸酯的断裂使得荧光基团基于叶酸的萘二甲酰亚胺类化合物的荧光得以恢复并增强，在电子转移过程中，促使lhx-cpt发生分子内消去反应（1,4-消去反应）并重排，伴随着co2分子的生成，抗癌药物cpt也得到释放，产生的荧光随cpt的释放逐渐增强，因此可以通过荧光强度的变化监测药物释放过程。
[0023]
综上所述，本发明合成了一种基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物，通过mida硼酸酯调控基团的特殊空间结构，能够荧光响应h2o2，可以实现对h2o2的检测。该基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物具有作为药物载体的功能，将药物喜树碱cpt负载于基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物上得到lhx-cpt，借助mida硼酸酯调控机制，能够实现中性条件（血液循环）稳定，酸性敏感的药物递送体系。在h2o2富集环境中，释放出具有抗癌活性的药物和荧光化合物，通过荧光信号转导来达到监测药物传输和释放的目的。同时，基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物通过引入叶酸配体，使其具有高效靶向性，可用于活细胞、活体中内源性h2o2检测及相关疾病的诊治。
附图说明
[0024]
图1为本发明lhx-1的质谱图；
图2为本发明lhx-1的氢谱图；图3为本发明lhx-1和lhx-1+h2o2的荧光光谱图；图4为本发明lhx-1在不同浓度h2o2中的荧光强度；图5为本发明lhx-1和lhx-1+h2o2在不同ph值下的荧光光谱图；图6为本发明lhx-1对不同金属离子的选择性；图7为本发明lhx-1对不同活性氧物质的选择性；图8为本发明子lhx-1对不同浓度h2o2的荧光光谱图；图9为本发明lhx-1在激发波长523 nm处，随不同浓度h2o
2 (0~45eq)变化的线性拟合关系；图10为本发明lhx-cpt在弱酸性条件下对cpt的释放曲线。
具体实施方式
[0025]
下面通过具体实施例对本发明lhx-1及lhx-cpt的制备和应用做进一步说明。
[0026]
实施例1 lhx-1的制备（1）在20 ml四氢呋喃（thf）溶液中，加入叶酸（fa，2.3 mmol，1.0 g）和3ml无水三氟乙酸酐（tfaa），使固体物质完全溶解。然后将混合物置于室温下作用10~12 h。反应完全后，在体系中加入一定量的冰水混合物，并用乙醚萃取。合并有机相后，将溶液于旋蒸仪上进行蒸干处理，干燥后得黄色粉末。接着将其溶解于dmf溶液中，并缓慢滴加k2co3至ph=5.0~7.0，体系在室温环境中搅拌30~50 min。最后加入三氟乙酸进行酸化，并分别用水和乙醚洗涤，柱层分离即得叶酸衍生物a。
[0027]
（2）将（1.2 mmol，0.55g）叶酸衍生物a和4-溴-1,8-萘二甲酸酐（1.0 mmol，0.28 g）溶于30 ml乙醇溶液中，78℃下回流4~6h，冷却至室温，并用水洗涤三次，过滤得基于叶酸的4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺类化合物b。
[0028]
（3）基于叶酸的4-溴-1,8-萘二甲酰亚胺类化合物b（1.0 mmol，0.70g）溶解到20 ml甲醇溶液中，滴加甲醇钠（1.5 mmol）溶液，加入硫酸铜（0.2~0.5 mmol，0.03~0.08g）作为为催化剂，于65℃下反应30min后，加入1.5 mlhi，于40~55℃下反应3h至颜色变暗。蒸干溶剂，得乳黄色固体物质。烘干后，将此中间化合物溶解到10 mltfa中，并加入0.5mmol六亚甲基四胺（hmta），反应3~6h后，加入饱和食盐水，用ch2cl2进行萃取，蒸干有机相，柱层分离得基于叶酸的萘二甲酰亚胺类化合物c。
[0029]
（4）将基于叶酸的萘二甲酰亚胺类化合物c（1.0 mmol，0.68g）加入20 ml乙腈溶液中，并加入mida硼酸酯（1.2 mmol，0.2g）及k2co3（1.5 mmol，0.21g），氮气保护下常温搅拌10~15h。体系反应完全后，过滤并旋蒸溶剂。之后加入nabh4（1.2 mmol，0.2g）继续作用24h，最后通过柱层分离得基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物d。产率为62%。
[0030]
lhx-1的合成路线如下：
。
[0031]
实施例2 lhx-cpt的合成将基于叶酸的mida硼酸酯-萘二甲酰亚胺类化合物d（0.6 mmol，0.56g）溶解到乙醇中，加入喜树碱（cpt，1.5 mmol，0.52 g）于80℃下反应5h；反应结束后冷却室温，倒入饱和食盐水，用ch2cl2进行萃取；将萃取物用无水na2so4干燥，抽滤，减压蒸馏除去溶剂，最后用二氯甲烧/甲醇的混合淋洗剂柱层分离得lhx-cpt d。产率为46.7%。
[0032]
lhx-cpt的合成路线如下：
。
[0033]
实施例3 lhx-1对h2o2的检测在lhx-1的dmso/pbs溶液（dmso：pbs=1:9，c=3
µ
m）中，分别加入45eq（相对于lhx-1的金属离子k
+
、na
2+
、ca
2+
、mg
2+
、zn
2+
、cu
2+
、hg
2+
、fe
2+
、fe
3+
和活性氧物质h2o2、tbhp、hclo、ko2和no，若lhx-1的dmso/pbs溶液在523nm处产生强烈荧光，则加入的是h2o2；若lhx-1的dmso/pbs溶液的荧光强度没有发生明显变化，则加入的是其他金属离子和活性氧物质。