一种广东虫草高产优质栽培菌株GDGM60的制作方法

本发明涉及了食用菌技术领域，具体涉及一种广东虫草高产优质栽培菌株gdgm60。

背景技术：

广东虫草cordycepsguangdongensist.h.li,q.y.lin&b.song，现定名tolypocladiumguangdongense(t.h.li,q.y.lin&b.song)v.papp，由广东省微生物研究所李泰辉研究员发现并成功驯化栽培，于2013年1月被中华人民共和国卫生部(现为中华人民共和国国家卫生健康委员会)正式批准为“新资源食品”(中华人民共和国卫生部2013年第1号)。广东虫草与冬虫夏草属于同科虫草真菌，二者活性成分及含量非常相似。研究表明广东虫草具有显著的防治慢性肾衰竭功效，还具有治疗慢性支气管炎、提高免疫力、延长动物寿命等功效，在食品、保健品及药品等领域有巨大的应用前景。

目前广东虫草已实现规模化栽培，正处于产业化推广应用阶段。广东虫草子实体的快速及大量获得是其资源有效开发利用的重要前提，直接关系着广东虫草子实体的产业化应用速度。尽管目前栽培所用菌种性状较好，且产量也相对稳定，但其质量及产量等仍有待进一步提高。因此，有必要对现有菌种进行性状改良或选育优势新品种，并对高产优质菌株进行产业化栽培应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种广东虫草高产优质栽培菌株tolypocladiumguangdongensegdgm60，并对其进行规模化栽培应用。

本发明采用的技术方法为如下：

一种广东虫草高产优质栽培菌株tolypocladiumguangdongensegdgm60，其保藏编号为：gdmccno：61278。

所述的广东虫草高产优质栽培菌株tolypocladiumguangdongensegdgm60，是通过以下方法筛选得到：

s1：固体菌丝体培养制备及菌种培养

将广东虫草标准菌种tolypocladiumguangdongensegdgm30035接种到固体pda培养基上进行培养，收获菌丝体；

s2：菌丝体分生孢子诱导

将菌丝体置于紫外灯下照射后，转到黑暗中培养，待产孢后备用；

s3：分生孢子收集

在产孢的培养皿中加入无菌水，用枪头轻轻刮培养基，使孢子散在无菌水中，用无菌纱布过滤，收集滤液，离心，去上清，沉淀用无菌水重悬，镜检分生孢子浓度，并调整孢子悬液浓度；

s4：孢子悬液稀释涂板

将孢子悬液进行稀释，涂于固体pda平板上，吹干后置于黑暗中培养至长出菌落；

s5：单孢分离菌落挑选及原基诱导

挑取单个菌落接种至固体pda平板上，置于黑暗中培养，然后转至光照条件下进行周期性照射诱导原基形成；

s6：子实体栽培培养基配制及子实体栽培优势菌株筛选

筛选平板上能够诱导产生原基的单孢分离菌株，接种至ympt液体培养基中进行摇瓶培养，然后接种至米饭培养基，在黑暗中培养，再转至光照条件下进行周期性照射诱导子实体形成。

s7：筛选原基及子实体诱导最好的菌株，即得到广东虫草高产优质栽培菌株tolypocladiumguangdongensegdgm60。

优选的，所述的广东虫草高产优质栽培菌株tolypocladiumguangdongensegdgm60，是通过以下方法筛选得到：

s1：固体菌丝体培养制备及菌种培养

将广东虫草标准菌种tolypocladiumguangdongensegdgm30035接种到固体pda培养基上，置于23±1℃条件下黑暗培养30d，菌丝体长到90cm培养皿边缘的3/4；

s2：菌丝体分生孢子诱导

将菌丝体置于紫外灯下照射30min后，转到23±1℃条件下黑暗培养，待产孢后备用；

s3：分生孢子收集

在产孢的培养皿中加入无菌水，用枪头轻轻刮培养基，使孢子散在无菌水中，用四层无菌纱布过滤，收集滤液，12000rpm/min离心10min，去上清，沉淀用无菌水重悬，镜检分生孢子浓度，调整孢子悬液的浓度为10⁶个/ml；

s4：孢子悬液稀释涂板

将孢子悬液依次稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5后，取200μl分别涂于固体pda平板上，吹干后置于23±1℃条件下黑暗培养；

s5：单孢分离菌落挑选及原基诱导

挑取单个菌落后接种至固体pda平板上，置于23±1℃条件下黑暗培养，待菌落长至培养皿2/3时，转至500lux光照条件下10l/14d周期性照射诱导原基形成；

s6：子实体栽培培养基配制及子实体栽培优势菌株筛选

筛选平板上能够诱导产生原基的单孢分离菌株，接种至ympt液体培养基，120rpm/min摇瓶培养10d，接种至米饭培养基，置于23±1℃条件下黑暗培养10d后，转至500lux光照条件下10l/14d周期性照射诱导子实体形成；

s7：筛选原基及子实体诱导最好的菌株，即得到广东虫草高产优质栽培菌株tolypocladiumguangdongensegdgm60。

优选的，所述的固体pda培养基，即马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其配制方法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半小时，纱布过滤，再加10～20g葡萄糖和17～20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，将滤液置于121℃灭菌20min左右，冷却即得。

优选的，所述的ympt液体培养基的配方为：每升培养基含有麦芽提取物6g，胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母提取物6g，溶剂为去离子水。

优选的，所述的米饭培养基是由大米和营养液按质量比1:1～1.5配制而成，所述营养液按总质量分数100％计，配方为：葡萄糖1.0％～1.5％，蛋白胨0.3％～1.0％，麦芽提取粉0.3～0.6％，酵母浸膏0.3％～0.6％，其余为水，ph5.0～7.0。

本发明的广东虫草高产优质栽培菌株tolypocladiumguangdongensegdgm60具有生长周期短、子实体性状良好、产量高、适宜大面积推广等优势，具体特征在于：

(1)形态特征菌丝体白色，致密；子实体发育整齐，柱状或棒状，子实体颜色为淡绿色至淡黄色；光照40d后(表1)，子实体长度为6.9～11.9cm，平均8.9cm；子实体直径为1.8～4.2mm，平均2.6mm；其子实体直径与长度的比值0.03；子实体新鲜状态及烘干后外观形态及色泽均优于原始菌种gdgm30035(图2和图3)。

(2)生物学特征征将温度控制在23±1℃，空气相对湿度控制在65％±5％，空间co2浓度控制在0.01％～0.02％条件下，菌丝生长阶段，gdgm60菌株与原始菌株gdgm30035无明显差异；液体发酵培养阶段，gdgm60菌株菌丝体发酵速度较快，约5d左右发酵菌丝体即可达到子实体栽培接种要求；接种米饭培养基后，避光培养8～10d，菌丝可铺满90mm×120mm的栽培瓶基质；随后置于500lux光照条件下10l/14d周期性照射，在3～4d后菌丝由白色转为浅黄色，6～8d后原基出现。子实体生长60±5d即可采收。按大小等级分别收集子实体，烘干保存。

(3)规模化栽培优势征与原始菌种gdgm30035比较，本发明获得的高产优质栽培菌株gdgm60外观形态较好，子实体较粗、较长；菌丝体发酵时间缩短了10％～15％；从原基形成到子实体成熟的时间约缩短了7％～10％；子实体长度增加了约19％；子实体直径增加了约66％。

本发明的广东虫草高产优质栽培菌株tolypocladiumguangdongensegdgm60于2020年11月9日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：gdmccno：61278。

本发明的广东虫草标准菌种tolypocladiumguangdongensegdgm30035于2020年9月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：gdmccno：61208。

附图说明

图1是广东虫草菌株gdgm60与gdgm30035液体发酵状态比较(ympt培养基)。

图2是广东虫草菌株gdgm60与gdgm30035新鲜子实体形态特征比较；图中左为原始菌株gdgm30035，右为改良菌株gdgm60。

图3是广东虫草菌株gdgm60与gdgm30035烘干子实体形态特征比较；图中左为原始菌株gdgm30035，右为改良菌株gdgm60。

具体实施方式

根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：广东虫草单孢分离菌株获得

将广东虫草标准菌种gdgm30035接种到固体pda培养基(即马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其配制方法是称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和17g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，将滤液置于121℃灭菌20min左右，冷却即得)上，置于23±1℃条件下黑暗培养30d，菌丝体约长到90cm培养皿边缘的3/4。将菌丝体置于紫外灯下照射30min后，转到23±1℃条件下黑暗培养，产孢后在培养皿中加入适量无菌水，用枪头轻轻刮培养基，使孢子散在无菌水中，用四层无菌纱布过滤，收集滤液，12000rpm/min离心10min，去上清，沉淀用适量无菌水重悬，镜检分生孢子浓度，调整孢子悬液的浓度为10⁶个/ml。将孢子悬液依次稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5后，取200μl分别涂于固体pda平板上，吹干后置于23±1℃条件下黑暗培养，获得单菌落菌株。

实施例2：广东虫草高产优质菌种筛选

将单菌落菌株接种至固体pda平板上，置于23±1℃条件下黑暗培养。待菌落长至培养皿2/3时，转至500lux光照条件下10l/14d周期性照射诱导原基形成，并观察其原基形成速度。筛选平板上能够快速诱导产生原基的单孢分离菌株，一共获得100株单孢分离菌株，将单孢分离菌株接种至ympt液体培养基(其配方为每升培养基含有麦芽提取物6g，胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母提取物6g，溶剂为去离子水；其制备为将培养基中的各组分与去离子水混合，搅拌溶解，121℃灭菌10min，冷却即得)，120rpm/min摇瓶培养10d，然后接种至米饭培养基(该米饭培养基是由大米和营养液按质量比1:1.5配制而成，所述营养液按总质量分数100％计，配方为：葡萄糖1.5％，蛋白胨0.3％，麦芽提取粉0.6％，酵母浸膏0.3％，其余为水，ph6.5；其制备为将葡萄糖、蛋白胨、麦芽提取粉、酵母浸膏溶于水后，调节ph至6.5得到营养液，将营养液和大米混合，121℃灭菌10min，冷却即得)，置于23±1℃条件下黑暗培养10d后，转至500lux光照条件下10l/14d周期性照射诱导子实体形成。观察子实体形态特征及产量，筛选高产优质菌株，一共获得5株原基及子实体诱导较好的菌株，其中编号为gdgm60的广东虫草菌株的原基及子实体诱导效果最优，明显优于原始菌种gdgm30035，为改良后的高产优质栽培菌株，命名为tolypocladiumguangdongensegdgm60。

广东虫草菌株gdgm60与gdgm30035在ympt液体培养基中发酵状态见图1所示。

实施例3：广东虫草高产优质菌株gdgm60分子生物学特征及其规模化栽培应用

广东虫草gdgm60菌株的子实体向上生长，均匀变窄，柱状或棒状，淡绿色至浅黄色(图2)，光照40d后，子实体长度6.9～11.9cm，平均8.9cm，比原始菌株gdgm30035增加了19％；子实体直径1.8～4.2mm，平均值为2.6mm，比原始菌株gdgm30035增加了66％。其子实体直径与长度的比值0.03，比原始菌株gdgm30035增加了50％(表1)，液体发酵培养菌丝体发酵时间缩短了10％～15％；从原基形成到子实体成熟的时间约缩短了7％～10％；子实体新鲜状态及烘干后外观形态及色泽均优于原始菌种(图2和图3)，子实体质量显著提高。

表1改良菌株(gdgm60)与原始菌株(gdgm30035)子实体大小比较

规模化具体栽培流程如下：将广东虫草gdgm60菌株接种到固体pda培养基上，置于23±1℃条件下黑暗培养。待菌落长至培养皿2/3时，接种于ympt液体培养基中，120rpm/min摇瓶培养10d，形成均匀大小的菌球。配制米饭培养基，将菌球接种到装有米饭培养基的无菌塑料组培瓶中，置于23±1℃条件下黑暗培养。待菌丝长满培养基后，置于500lux光照条件下10l/14d周期性照射，并将空气相对湿度保持在85％、室内co2浓度控制在0.4％、栽培温度为23±1℃。广东虫草gdgm60生长60±5d即可采收。将广东虫草子实体从栽培基质基部取下，按大小等级分别收集，40℃烘干后干燥条件下保存。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。