本发明涉及微生物领域，具体涉及一株分离的碳角菌属真菌xylariasp.及其在制备天然除草剂中的应用。
背景技术：
除草剂的发现和大规模地应用,是农业现代化的标志之一,为保障全球粮食生产安全作出了巨大贡献。随着除草剂的大量长期应用，不仅给环境带来的巨大的压力，同时由于杂草的不断生存进化，抗性杂草种类不断增多和抗性不断增强，这需要科学界不断的开发研制绿色新型除草剂。利用自然界生物中具有生物活性的代谢产物开发新的生物源除草剂是除草剂研发的一个重要途径和未来发展方向。因为这类化合物往往具有化学结构新异，作用靶点独特，广谱、低毒、低残留的特点，且受环境影响较小。另外，相对于开发一个新的化学除草剂产品需要耗时10年、花费约2.5亿美元的财力状况，这种利用天然产物研发新除草剂的方式具有定向性、研制周期短、研发费用相对低廉的优点。
微生物是自然界的天然产物宝库，其代谢产物结构种类十分丰富，在已商业化的产品中，有很多母体结构来自微生物代谢产物。如以茴香霉素(snisomycin)为模板化学合成了去草酮(methoxyphenone)，其中最成功的是例子是双丙氨磷(bialaphos)和草铵膦(phosphinothricin)。碳角菌属真菌xylaria多为腐生真菌，目前对于该属菌种的分类学研究较少，有很多菌种命名以小种表示，即在属名后加入sp以及菌种编号。随着研究的不断深入，大量的结构新颖的次生代谢产物从碳角属真菌中得到，其药理包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化、杀虫抗炎等。在次生代谢产物中，碳角菌属真菌可以产生结构较为丰富的细胞松弛素类化合物。
细胞松弛素(cytochalasins)是由真菌代谢产生的一类含氮类杂合骨架结构化合物，具有抗肿瘤，抗炎和神经保护活性等多种药理活性。而对于化合物19,20-epoxy-cytochalasinq研究主要集中在抗肿瘤领域，有文献报道其具有杀疟原虫的活性(plantamedica,2000,66(5):473-475)。对于其除草活性没有文献报道。
技术实现要素：
本发明目的在于，提供一株分离的碳角菌属真菌xylariasp.，所述真菌的保藏编号为cctccno：m2020734。
本发明的另一个目的在于提供了保藏编号为cctccno：m2020734的真菌xylariasp.的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
在筛选微生物来源除草剂过程中，申请人从湖北省武汉市郊区土壤中发现一株真菌代谢产物具有显著的抑制种子萌发的效果，经过鉴定该菌为xylariasp.该菌株已于2020年11月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：xylariasp.nh-1801，保藏编号为cctccno：m2020734，地址：中国武汉武汉大学。
该菌在pda平板培养1周后平板背面呈淡黄色，正面呈白色，菌丝粗壮浓密，气生菌丝发达，能产生鹿角状分枝子座。该菌株的发酵生长快速，适合大规模培养。
对该菌株的发酵产物，加入乙酸乙酯进行提取，提取物经鉴定为细胞松弛素类化合物19,20-epoxy-cytochalasinq，结构式如下：
该物质经水解后，为21-deacetyl-19,20-epoxy-cytochalasinq，结构式如下：
上述化合物可显著抑制种子的发芽生长，可作为农田苗前除草的除草剂，或是可直接将该菌株或者该菌株的发酵液作为除草剂。
以上所述的种子，优选的，为稗草种子、马唐种子、拟南芥种子、反枝苋种子、小飞蓬种子、牛膝种子、空心莲子草种子以及鸭趾草种子。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)首次发现xylariasp.有除草效果：通过我们的筛选实验，首次发现xylariasp.nh-1801发酵的乙酸乙酯提取物具有抑制拟南芥种子发芽的效果，进一步发酵其提取物对多种植物种子都具备抑制发芽的效果。
2)该菌株的发酵条件简单，产物含量大：该菌种代谢产生活性物质的培养基为大米，不需添加其他物质，并且化合物产量大，产量可以达到培养基0.1％，即100g大米最多可以得到100mg化合物。
3)首次分离出该菌株的除草有效物质：通过乙酸乙酯提取，硅胶柱分离，运用结晶的方法，分离得到纯的除草有效物质19,20-epoxy-cytochalasinq。
4)首次发现19,20-epoxy-cytochalasinq及其水解产物均具备除草效果：采用种子萌发实验发现，化合物19,20-epoxy-cytochalasinq以及其水解产物21-deacetyl-19,20-epoxy-cytochalasinq在200ppm时可以显著抑制稗草和反枝苋的种子萌发，该活性为首次发现，未见文献报道。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述，使本领域科技人员更全面理解本发明，但是本发明并不限于下述实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明以稗草种子和反枝苋种子为例，对xylariasp.nh-1801发酵产物中的活性化合物的效果进行验证；其对于马唐种子小飞蓬种子、牛膝种子、空心莲子草种子以及鸭趾草种子均有抑制发芽生长的效果，鉴于篇幅，不再赘述。
实施例1：
xylariasp.nh-1801的获得其及生理生化性质：
本发明所述的真菌xylariasp.nh-1801是从湖北省武汉市郊区土壤中分离纯化获得的，将菌种发酵后，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯提取物，采用抑制种子萌发的方法，发现乙酸乙酯提取物可以完全抑制拟南芥种子萌发。该菌在pda平板培养1周后平板背面呈淡黄色，正面呈白色，菌丝粗壮浓密，气生菌丝发达，能产生鹿角状分枝子座。通过形态鉴定和its序列比对，该菌种鉴定为xylariasp.。
至此，申请人获得了一株碳角属真菌xylariasp.，该菌株已于2020年11月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：xylariasp.nh-1801，保藏编号为cctccno：m2020734，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2
xylariasp.nh-1801发酵产物中的活性化合物的制备：
(1)培养基的配制：
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，自然ph值；大米培养基：大米80g,水100ml，放入500ml培养瓶中，121摄氏度灭菌后备用。
(2)种子液的制备：将斜面菌种xylariasp.nh-1801接种于茄形瓶中(pda培养基)，28℃恒温培养7d，用含0.1％吐温-80的无菌水将孢子洗下，配制成浓度为1.0×107个/ml的菌悬液，备用。
(3)发酵培养：按3％(ml/g)的接种量将菌悬液接入到大米中(共接种5瓶，大米用量400g)，28℃、静置培养8天。
(4)提取分离：在发酵瓶中加入等体积的乙酸乙酯，震荡提取1h，取上清。回收乙酸乙酯溶剂得到乙酸乙酯提取物。加入少量甲醇溶解乙酸乙酯提取物，上硅胶柱(100-200目，青岛海洋化工)。依次用石油醚：乙酸乙酯(5：1，3：1，2：1，1：1)(体积比)洗脱，在最终按照1：1洗脱时收集含有化合物19,20-epoxy-cytochalasinq馏分溶液，合并，回收溶剂，用甲醇溶解后，结晶，得到纯19,20-epoxy-cytochalasinq(200mg)。
(5)21-deacetyl-19,20-epoxy-cytochalasinq制备：将化合物19,20-epoxy-cytochalasinq(50mg)溶解于k2co3溶液中，室温搅拌6个小时，用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯，水洗至中性，回收乙酸乙酯，重结晶，得到21-deacetyl-19,20-epoxy-cytochalasinq(40mg)。
实施例3：
xylariasp.nh-1801发酵产物中的活性化合物及该化合物的水解产物抑制稗草种子萌发：
(1)试药的配制：分别称取化合物1(19,20-epoxy-cytochalasinq)、化合物2(21-deacetyl-19,20-epoxy-cytochalasinq)和除草剂2，4-d2mg，用甲醇溶解成1mg/ml。然后依次用甲醇化合物稀释成200ppm,100ppm,50ppm,25ppm,12.5ppm。将各个浓度的试药加入12孔板中，每孔200ul，每个浓度3个复孔，空白对照加入相同剂量的纯甲醇，挥干甲醇备用。
(2)稗草种子准备：将稗草种子(市售)流水冲洗4个小时后，用高锰酸钾溶液消毒15min，无菌水冲洗干净，晾干，每孔加入4粒稗草种子，然后加入无菌水200ul，28℃恒温培养箱中放置48小时后观察结果。
(3)测量与计算：用游标卡尺测量每粒种子发芽后的径与根的长度，按以下公式计算药物对种子萌发的抑制率。
抑制率＝(空白长度-样品长度)×100％/空白长度
(4)结果：实验结果见表1。化合物1和化合物2均具有显著抑制稗草种子萌发的活性，在最高浓度200ppm时，根长抑制率分别为83.3％和80.4％，茎长抑制率分别为80.4％和79.4％，对茎长抑制率与阳性对照除草剂2，4-d(78.7％)相当。化合物1和化合物2对稗草种子根的生长抑制作用强于对茎的生长，在低浓度时50ppm，化合物1和化合物2对根长抑制率分别为65.7％和60.7％，强于对茎长的抑制(分别为37.5％和34.5％),但是化合物1和化合物2对稗草根长的抑制均弱于除草剂2，4-d。
表1化合物抑制稗草种子萌发实验结果
实施例4
xylariasp.nh-1801发酵产物中的活性化合物及其水解产物抑制反枝苋种子萌发：
(1)试药的配制：分别称取化合物1(19,20-epoxy-cytochalasinq)、化合物2(21-deacetyl-19,20-epoxy-cytochalasinq)和除草剂2，4-d约2mg，用甲醇溶解成1mg/ml。然后依次用甲醇化合物稀释成200ppm,100ppm,50ppm,25ppm,12.5ppm。将各个浓度的试药加入12孔板中，每孔200ul，每个浓度3个复孔，空白对照加入相同剂量的纯甲醇，挥干甲醇备用。
(2)反枝苋种子准备：将反枝苋种子(市售)流水冲洗4个小时后，用高锰酸钾溶液消毒15min，无菌水冲洗干净，晾干，每孔加入5粒反枝苋种子，然后加入无菌水150ul，28℃恒温培养箱中放置48小时后观察结果。
(3)测量与计算：用游标卡尺测量每粒种子发芽后的总长度，按以下公式计算药物对种子萌发的抑制率。
抑制率＝(空白长度-样品长度)×100％/空白长度
(4)结果：实验结果见表2。化合物1和化合物2均具有显著抑制反枝苋种子萌发的活性，在200ppm浓度时，化合物1和2可以完全抑制种子萌发，抑制率达到100％，强于对照药物除草剂2，4-d(抑制率87.1％)。在低浓度50ppm时，化合物1和2也具有显著的抑制活性，对种子萌发的抑制率分别为77.2％和75.4％，与对照药物活性相当(抑制率为79.8％)。但是在更低浓度时，化合物1与化合物2的活性要弱于阳性对照药物。
表2化合物抑制反枝苋种子萌发实验结果