一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量PCR方法与流程

一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量pcr方法
技术领域
[0001]
本发明涉及pcr检测技术领域，具体涉及一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量pcr方法。


背景技术：

[0002]
旋毛虫病是一种危害非常严重的人兽共患寄生虫病，不但给畜牧业生产造成巨大的经济损失，而且对人类身体健康也构成巨大威胁。人或动物(猪、草食动物等)主要通过误食了被旋毛虫肌肉幼虫污染的肉类而发病。
[0003]
目前，关于旋毛虫的诊断，国际兽医局(oie)公认的方法为压片镜检法和消化法。目前我国也正在使用这两种方法，然而上述的两种方法在检测时存在着一定的弊端，镜检法费时费力且敏感性较低。消化法虽然在一定程度上可以提高旋毛虫的检出率，但该方法虫体检出率必须为每克肉中含有3条虫以上才能检出，且此方法在操作时极其繁琐，需消耗大量的人力和物力。从生物安全角度来看，由镜检法和消化法所造成的漏检肉品仍对人类的健康造成威胁(摄入约75条虫体即可引起人的感染)。国内外学者对猪旋毛虫检测的方法进行了大量的研究，如应用普通pcr、pcr芯片等检测旋毛虫样本，但这些方法由于其灵敏性较低、价格昂贵，不适用于大批量旋毛虫病样本的检测。


技术实现要素：

[0004]
为此，本发明提供一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量pcr方法，以解决现有技术中灵敏性较低、价格昂贵，不适用于大批量旋毛虫病样本检测的问题。
[0005]
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0006]
本发明提供一种用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量pcr的方法，所述方法包括：
[0007]
根据旋毛虫iss195株染色体的scfld4基因设计引物；
[0008]
将提取的旋毛虫基因进行倍比浓度稀释，对所述倍比浓度稀释的旋毛虫全长基因样本分别利用所述引物进行实时荧光定量pcr检测；
[0009]
以所述倍比浓度稀释的旋毛虫基因实时荧光定量pcr检测的ct值为纵坐标，以相对应的dna浓度的对数为横坐标，建立标准曲线；
[0010]
利用实时荧光定量pcr检测待测样品，根据所述待测样品的ct值和所述标准曲线，计算所述待测样品中旋毛虫基因相对应的浓度。
[0011]
本发明的一个实施例中，所述scfld4基因的扩增引物为：
[0012]
上游引物：5
’-
ttcttagtgctttctgggtcatctt-3’；
[0013]
下游引物：5
’-
cgcttttccacttaccattctgt-3’。
[0014]
本发明的一个实施例中，所述旋毛虫基因的倍比稀释浓度分别为：41.10ng/μl、8.22ng/μl、1.644ng/μl、0.3288ng/μl、0.06576ng/μl、0.013152ng/μl、0.002630ng/μl。
[0015]
本发明的一个实施例中，所述旋毛虫为t1型旋毛虫。
[0016]
本发明的一个实施例中，所述pcr反应体系为：1
×
monamptm chemohs qpcr mix 10μl；0.2μm正向引物0.4μl；0.2μm反向引物0.4μl；1
×
low rox dye or high rox dye 0.2μl；dna模板9μl；nuclease-free water to 20μl。
[0017]
本发明的一个实施例中，所述pcr反应条件为：95℃ 10min，95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 30s，40cycles。
[0018]
本发明的一个实施例中，所述标准曲线为：y＝-3.28x+23.531，其中18≤y≤35。
[0019]
本发明具有如下优点：
[0020]
本发明运用荧光染料法设计特异性引物，建立了实时荧光定量pcr的方法，具有敏感性强、稳定性好、通量高等特点，首次运用新基因专门针对绵羊肉制品中t1型旋毛虫的检测方法的建立的分子诊断方法。
[0021]
本发明的实时荧光定量pcr检测方法，不仅实现了pcr从定性到定量的飞跃，并且此方法灵敏度高、价格便宜并且既可以检单个样品又可检多个样品。
附图说明
[0022]
图1为本发明提供的提取纯化后100条旋毛虫的dna实时荧光定量pcr扩增曲线图，其中，虫体dna以51、52、53、54、55、56、57稀释进行，其中y1对应51稀释，y2对应52稀释，y3对应53稀释，y4对应54稀释，y5对应55稀释，y6对应56稀释，y7对应57稀释；
[0023]
图2为本发明提供的建立的实时荧光定量pcr标准曲线图，其中，旋毛虫体dna以51、52、53、54、55、56、57稀释，以57稀释dna检测浓度为0.002630ng/μl，以倍比浓度稀释的旋毛虫基因实时荧光定量pcr检测的ct值为纵坐标，以相对应的dna浓度的对数为横坐标；
[0024]
图3为本发明提供的毛尾线虫的实时荧光定量pcr扩增图，其中，1代表阳性对照，2代表毛尾线虫，3代表空白对照；
[0025]
图4为本发明提供的绵羊仰口线虫的实时荧光定量pcr扩增图，其中，1代表阳性对照，2代表绵羊仰口线虫，3代表空白对照；
[0026]
图5为本发明提供的食道口线虫的实时荧光定量pcr扩增图，其中，1代表阳性对照，2代表食道口线虫，3代表空白对照；
[0027]
图6为本发明提供的捻转血毛线虫的实时荧光定量pcr扩增图，其中，1代表阳性对照，2代表捻转血毛线虫，3代表空白对照；
[0028]
图7为本发明提供的实时荧光定量pcr检测同一质量组织中不同数目的条虫体灵敏验证结果图，其中，1代表40条，2代表20条，3代表10条，4代表5条，5代表1条，6代表空白对照，7代表阴性对照；
[0029]
图8为本发明提供的实时荧光定量pcr检测不同组织质量一条虫灵敏度验证结果图，其中，1代表1mg，2代表5mg，3代表10mg，4代表20mg，5代表空白对照，6代表阴性对照；
[0030]
图9为本发明提供的显微镜检测绵羊攻虫膈肌中旋毛虫图；
[0031]
图10为本发明提供的攻虫绵羊膈肌的实时荧光定量pcr结果图，其中，1代表攻虫组，2代表空白对照，3代表阴性对照；
[0032]
图11为本发明提供的73头绵羊疑似组织进行检测结果图，其中，1代表阳性对照，2代表8号，3代表14号，4代表空白对照，5代表阴性对照；
[0033]
图12为本发明提供的73头绵羊疑似组织进行检测结果图，其中，1表示阳性对照，2
表示32号，3表示37号，4表示27号，5表示空白对照，6表示阴性对照。
具体实施方式
[0034]
实施例1、用于检测绵羊肉制品旋毛虫的实时荧光定量pcr的标准曲线建立
[0035]
一、设计实时荧光定量的引物
[0036]
绵羊肉制品中旋毛虫实时荧光定量pcr方法的检测基因的筛选
[0037]
从本实验室前期研究已发表的global gene expression analysis of the zoonotic parasite trichinella spiralis revealed novelgenes in host parasite interaction文章中挑选旋毛虫iss195株染色体未知的scfld4基因的基因序号(基因序号：tsp-00874)基因号：10904414，然后在ncbi中的genbank基因库中找出此基因的全长基因，此基因在肌肉幼虫时期上调，将此基因在进行blast分析，发现保守性强。
[0038]
绵羊肉制品中旋毛虫实时荧光定量pcr方法引物设计，
[0039]
上游引物：5
’-
ttcttagtgctttctgggtcatctt-3’；
[0040]
下游引物：5
’-
cgcttttccacttaccattctgt-3’。
[0041]
二、提取旋毛虫的样品组织dna
[0042]
参照用steadypure通用型基因组dna提取试剂盒说明书进行，取适量样品：
[0043]
1、加入500μl buffer ls-2、20μl的proteinase k和10μl的rnase a(10mg/ml)，于56℃水浴温水浴至虫体完全裂解，(大约2～3h)；
[0044]
2、不定时颠倒，使样品充分裂解，向裂解液中加入200μl buffer bs-2和200μl 100％乙醇，充分吸打混匀；
[0045]
3、将上述溶液转移至μniversal dna mini column中，室温静置1min后，室温下12000rpm离心1分钟，弃滤液；
[0046]
4、向mini column中加入500μl的buffer wa，室温12000rpm离心1分钟，弃滤液；
[0047]
5、向mini column中加入750μl的buffer wb,室温12000rmp离心1分钟，弃滤液；
[0048]
6、重复3步骤一次；
[0049]
7、将mini column安置于新的2ml collection tube上，室温12000rpm离心2分钟；
[0050]
8、将mini column安置于新的1.5ml的离心管中，在mini column膜的中央处加入45μl的灭菌水，室温静置5分钟，然后室温12000rpm离心2分钟。收集于新ep管中。
[0051]
三、标准曲线建立
[0052]
取纯化后的干净虫体100条，提取旋毛虫全长基因dna，将阳性标准品以5的倍比稀释共稀释7个点，命名为y
n
(n＝1～7)。
[0053]
反应体系为：1
×
monamptm chemohs qpcr mix 10μl、0.2μm正向引物(10μm)a 0.4μl、0.2μm反向引物(10μm)a 0.4μl、1
×
low rox dye(100
×
)or high rox dye(100)b 0.2μl、dna模板9μl、nuclease-free water to 20μl。
[0054]
反应条件95℃ 10min，95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 30s，40cycles。
[0055]
阳性标准品以5倍比连续稀释7次分别标记为y1～y7，y1为100虫体所提取的dna浓度。y1～y7的dna浓度分别是：41.10ng/μl、8.22ng/μl、1.644ng/μl、0.3288ng/μl、0.06576ng/μl、0.013152ng/μl、0.002630ng/μl。用建立的实时荧光定量pcr方法对y1～y7进行检测，不同浓度梯度的模板其扩增曲线在指数范围其呈现了良好的平行关系，如图1所
示，以倍比浓度稀释的旋毛虫基因实时荧光定量pcr检测的ct值为纵坐标，以相对应的dna浓度的对数为横坐标，建立标准曲线，如图2所示，扩增效率为101.7％，扩增曲线呈良好的线性关系，标准曲线为：y＝-3.28x+23.531，其中y表示荧光定量pcr检测的ct值，ct的范围：18≤ct≤35；x表示dna浓度的对数，dna浓度可检测范围：0.0003186ng/μl≤dna浓度≤48.56ng/μl；相关系数r2＝0.9993。
[0056]
该检测体系中的dna的量相当于100、20、4、0.8、0.16、0.132、0.0064条旋毛虫dna质量，本试验检测y7的dna浓度为0.002630ng/μl，相当于能检测出千分之一条虫。
[0057]
试验实施例1、特异性试验
[0058]
用建立的实时荧光pcr检测旋毛虫法对旋毛虫、毛尾线虫、食道口线虫、捻转血毛线虫、绵羊仰口线虫的全长基因dna进行检测，旋毛虫提取的dna组设为阳性样本组，至少设3个平行复管和3个空白对照。阳性样品dna检测其ct平均值为31.959，食道口线虫的dna、绵羊仰口线虫的dna、捻转血毛线虫dna、毛尾线虫的dna检测、空白对照均不起峰，检测结果为阴性，无交叉反应，特异性良好，食道口线虫的dna检测结果如图5所示、绵羊仰口线虫的dna检测结果如图4所示、捻转血毛线虫dna检测结果如图6所示、毛尾线虫的dna检测结果如图3所示。
[0059]
特异性试验中，食道口线虫的dna、绵羊仰口线虫的dna、捻转血毛线虫dna、毛尾线虫的dna检测、空白对照均不起峰，检测结果为阴性，无交叉反应，特异性良好。
[0060]
试验实施例2、灵敏性试验
[0061]
取5mg绵羊膈肌肌肉分别加入1条、5条、10条、20条、40条虫，提取dna，进行检测，如图7所示。取1mg、5mg、10mg、20mg的绵羊膈肌组织分别加入1条虫，提取dna进行检测，结果显示都能100％的检出，如图8所示。
[0062]
相同肌肉组织，不同虫数量，虫量越多，检出率越高，灵敏性越强，相同虫量，不同质量的肌肉组织，检测结果为质量越小，检出率越高，灵敏性越强。
[0063]
最小检测量为在不同组织中含有1条旋毛虫的20mg的绵羊膈肌组织dna检测样本或在5mg的绵羊膈肌加入1条旋毛虫的dna检测样本中，均能检测到荧光信号，说明本检测方法灵敏度高。
[0064]
试验实施例3、阳性样品的检测
[0065]
(一)组织旋毛虫提取试验：
[0066]
(1)取灌胃攻虫饲养35天后的昆明小鼠1只；
[0067]
(2)脱颈处死后，用75％酒精浸泡1min后，用pbs浸泡1min。
[0068]
(3)去除小鼠的四肢、尾头、内脏和脂肪组织，只留胴体。
[0069]
(4)取膈肌压片镜检，显微镜下发现旋毛虫包囊及肌肉幼虫(倒置显微镜)。
[0070]
(5)将胴体称重。
[0071]
(6)配置人工消化液(1％hcl，1％胃蛋白酶)：6ml的hcl溶液溶于400ml蒸馏水中或超净水中，再加6g胃蛋白酶，定容至600ml(现配现用)。
[0072]
(7)将胴体及已检膈肌剪成小沙粒大小，分装于两个250ml的锥形瓶中。
[0073]
(8)各自加入120ml的人工消化液(一般是胴体体积的15倍加液)。
[0074]
(9)将锥形瓶瓶口封闭，220rpm，37℃，3h。
[0075]
(10)取出锥形瓶，用60目的网筛过滤肉渣，过滤到500ml的量杯中，然后加入37℃
的生理盐水至500ml，中和消化。
[0076]
(11)放置37℃的恒温培养箱静置30min。
[0077]
(12)取出静置液，去除400ml上层液体，留100ml下层混悬液。
[0078]
(13)将上述混悬液倒入250ml的量杯中，加入生理盐水至250ml，放置37℃恒温箱35min。
[0079]
(14)取出静置液，去除200ml上层液体，留50ml下层混悬液，混悬液倒入100ml量杯中，加生理盐水至100ml，放置37℃恒温箱静置30min。
[0080]
(15)取出静置液，去除80ml上层液体，留置20ml下层混悬液，室温静置15min，去除上清液，混匀，加到1.5ml离心管中，显微镜检活力，计数，约6000条，4℃保存。
[0081]
(二)阳性样品检测试验
[0082]
在试验室，利用人工消化法从昆明小鼠体内提取约6000条旋毛虫肌肉幼虫，在显微镜下进行活力检测。将提取的旋毛虫肌肉幼虫用0.9％的生理盐水稀释，口服灌胃给一只健康的体重为20kg的绵羊。60天后，送检疫中心刨杀，在高光条件下对膈肌切面进行观察，发现圆形卵状针尖大小的白点；用手术剪取白点较多的区域，大小约为20g，装于灭菌消毒过的自封袋，于实验室进行显微镜检和实时荧光定量pcr。用弓形剪刀夹住，沿着肌纤维的方向剪下约为麦粒大小的病灶部位，贴于载玻片上，盖上盖玻片，捏住两端压扁组织。在显微镜下观察，发现形状为橄榄状旋毛虫，如图9所示。将镜检过的组织进行实时荧光定量pcr，设立样本组、阴性组和空白对照组，结果检测该样本组织为阳性，如图10所示。
[0083]
六、采疑似病料进行检测
[0084]
对屠宰场绵羊进行编号。对应其编号，在每头绵羊身上分别取左右两块膈肌组织，去除膈肌膜，抻拽或压平膈肌组织，在高光条件下对膈肌斜切面进行观察，可发现膈肌上出现疑似圆形卵状颜色为白色的点或异常肉样的组织。共采集了73头绵羊疑似组织，并对疑似样品进行编号为1～73号。在实验室取每一份样品有卵圆形小白点或异常肉羊的组织，每一块大小约为2mm
×
10ram。将组织块放在两块玻璃片之间，用力挤压成半透明状。每一份都取四块这样的样本组织进行显微镜检查。镜检73份样品全为阴性。将镜检过的绵羊膈肌组织提取dna进行实时荧光定量pcr。其中8号、14号、32号、37号为阳性，27号为弱阳性，8号、14号结果如图11所示，32号、37号，27号结果如图12所示。证明本方法更具有灵敏性。
[0085]
本发明的方法以旋毛虫iss195株染色体未知的scfld4基因，设计了一对特异性引物，以旋毛虫的dna为模板，建立了实时荧光定量pcr检测旋毛虫的方法。建立的标准曲线拟合良好，标准曲线为：y＝-3.28x+23.531，相关系数为r2＝0.9993，扩增效率为101.7％。
[0086]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。