一株高产耐热碱性纤维素酶的菌株及生产方法与流程

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[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高产耐热碱性纤维素酶的芽孢杆菌及生产方法。


背景技术：
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[0002]
纤维素是地球上分布最广泛、蕴藏量最丰富的可再生有机资源。天然纤维素由排列规则、整齐的结晶区和相对不规则、松散的非结晶区(无定形区)组成，微生物能够产生大量的酶来降解和修饰自然界中的纤维素，将天然纤维素转化为饲料、化工等原料。其中，纤维素酶是能将纤维素水解成还原糖的一类酶系的总称，且酶与酶之间具有协同作用。
[0003]
碱性纤维素酶是纤维素酶系的一个组分，即羧甲基纤维素酶(carboxymethyl cellulase，cmcase)，也称内切酶，最早于20世纪70年代由日本学者从芽孢杆菌的培养物中发现，在碱性条件下具有较高的活性和稳定性，它不含有纤维素酶系的其它两个组分(外切β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶)，主要对天然纤维中占10％左右的非结晶区的纤维素分子起作用，对结晶区纤维素水解活力很低，不会明显降低纤维的强度，因此在纺织、洗涤剂、废水处理和制浆造纸等行业中具有很好的应用前景。特别地，碱性纤维素酶的研究和应用已经渗透到制浆造纸工业的许多方面。碱性纤维素酶因其具有对废纸适应性强、处理条件温和等优势，应用于酶法废纸脱墨和二次纤维的酶改性等过程中可以有效解决废纸利用过程中的环保问题和纤维质量下降问题。利用碱性纤维素酶进行的酶促打浆不仅能够降低打浆能耗，而且可以增加纤维产量，改善纸张的成纸性能。
[0004]
碱性纤维素酶主要由在碱性环境中生长的嗜碱性细菌、放线菌和链霉菌产生。其中，由于芽抱杆菌的抗逆性强，在耐酸、耐碱、耐高温等方面具有明显优势，其所产的酶在碱性和高温等极端环境条件下同样具有很大的优势，因此利用芽孢杆菌生产碱性纤维素酶已成为碱性纤维素酶研究领域的一个重要方向。目前研究较多并具有工业化生产价值的是嗜碱性芽孢杆菌，其所生产的碱性纤维素酶最适作用ph范围在8.0-11.0，最适作用温度为45℃。但是，碱性纤维素酶的生产目前仍存在很多问题，如酶活力不高、发酵水平低、酶系组成不合理等，严重限制了碱性纤维素酶的工业应用。因此，产量高、酶系合理、耐热性好及ph使用范围宽的产纤维素酶菌株的筛选及其发酵工艺的研究，对指导碱性纤维素酶制剂的生产具有重要意义。


技术实现要素：
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[0005]
为了解决上述技术问题，本发明将提供一株高产耐热碱性纤维素酶的芽孢杆菌突变菌株。
[0006]
所述芽孢杆菌具体为芽孢杆菌(bacillus sp.)ac-77，该菌株已于2020年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为cgmcc no.20674。
[0007]
所述芽孢杆菌(bacillus sp.)ac-77是通过ntg诱变的方式获得的高产耐热碱性
纤维素酶菌株。
[0008]
所述芽孢杆菌(bacillus sp.)ac-77摇瓶发酵产碱性纤维素酶的方法具体如下：
[0009]
将种子液按2％-5％接种量转接至摇瓶发酵培养基中，36℃-37℃，摇床转速200-220r/min条件下培养48-54h。将发酵液在4-6℃、8000-9000r/min条件下离心10-15min，收集上清液即得到碱性纤维素酶粗酶液。
[0010]
摇瓶发酵培养基组成(g/l)：cmc-na 8.5-11.5，豆饼粉18.0-21.0，淀粉9.0-10.5，nacl 4.0-5.5，kh2po
4 0.8-1.1，na2co
3 9.0-12.0(分开灭菌)，其余为水，ph7.5-8.0，121℃灭菌20min。
[0011]
所述芽孢杆菌(bacillus sp.)ac-77发酵罐发酵生产碱性纤维素酶的方法具体如下：
[0012]
液体种子摇瓶培养：取一环斜面培养的菌株接入种子培养基中，36℃-37℃，摇床转速200-200r/min条件下培养24h，获得种子液；
[0013]
种子扩大培养：将种子液按照体积比8％-10％的接种量转接到种子罐中继续培养12h，控制罐压0.05-0.08mpa，培养温度36℃-37℃，搅拌转速180-200r/min，ph值7.5-8.0；
[0014]
发酵培养：将扩大培养后的种子液按照体积比8％-10％的接种量接入到发酵罐培养基中，36℃-37℃培养，罐压0.05-0.08mpa，搅拌转速300-800r/min，当溶氧降至最低再回升至20％时，开始补料，控制溶氧在20％-30％之间；发酵过程通过协调补加补料培养基、液氨、磷酸来控制发酵液ph，使其维持在7.5-8.0范围内，培养至酶活增长缓慢或不再增长，菌体开始部分自溶时放罐。
[0015]
上述培养过程所使用培养基如下：
[0016]
种子培养基(g/l)：酵母膏8.0-11.0，蛋白胨8.0-11.0，nacl 4.0-6.0，kh2po40.9-1.5，na2co
3 9.0-12.0(分开灭菌)，ph7.5-8.0，121℃灭菌20min。
[0017]
种子罐培养基(g/l)：豆饼粉25.0-35.0，葡萄糖15.0-25.0，蛋白胨12.0-16.0，kh2po
4 1.0-1.5，ph7.5-8.0，121℃-124℃，0.11-0.12mpa条件下，灭菌35min。
[0018]
发酵罐培养基(g/l)：豆饼粉18.0-25.0，淀粉9.0-10.0，麸皮9.0-10.0，nacl4.0-6.0，mgso
4 0.4-0.5，kh2po
4 0.4-0.5g，feso
4 0.01-0.02，ph7.5-8.0，121℃-124℃，0.11-0.12mpa条件下，灭菌35min。
[0019]
补料培养基(g/l)：豆饼粉25.0-35.0，淀粉液化液120-140，kh2po
4 0.4-0.5g，ph7.5-8.0，121℃-124℃，0.11-0.12mpa条件下，灭菌35min。
[0020]
提取与精制工艺：收集放罐后的发酵液，加入0.2％-0.3％的防腐剂、3-5％磷酸氢二钠和1-3％％氯化钙进行絮凝，再加入2-4％珍珠岩助滤剂，板框压滤后得到澄清酶液。用10000分子量超滤膜对所述澄清酶液进行超滤，得到超滤液。在所述超滤液中加入质量百分比40％稳定剂、0.5％防腐剂和5％氯化钠，完全溶解后调节ph值至8.0，然后用硅藻土精滤除菌，即得到碱性纤维素酶液体酶制剂。
[0021]
所述稳定剂为质量比2:1:1的葡萄糖、甘油和山梨醇，所述防腐剂为质量比为1:1的山梨酸钾和苯甲酸钠。
[0022]
本发明制备的碱性纤维素酶，酶学特性如下：
[0023]
(1)最适作用ph范围为6.0-10.5，最适ph为9.0；
[0024]
(2)最适作用温度范围为45-70℃，最适温度为55℃；
[0025]
(3)温度稳定性：在ph9.0的条件下，在不同水浴温度中保温1h。该酶在65℃条件下能够维持90％以上的酶活力，在75℃条件下处理1h后，仍保留60％以上的酶活力；
[0026]
(4)ph稳定性：在不同ph条件下，55℃保温1h。该酶在ph为5.5-10.5条件下，能够维持90％以上的酶活力，在ph12.0的条件下，仍保留75％的酶活力。
[0027]
有益效果：
[0028]
本发明通过对原始菌株进行ntg诱变筛选获得高产耐热碱性纤维素酶菌株ac-77，其所产碱性纤维素酶具有组分较单一、稳定性好、可耐受高温、ph值适用范围广等优点。
[0029]
诱变菌株ac-77摇瓶发酵产碱性纤维素酶的能力显著提高，酶活力达到76.1u/ml，比出发菌株提高了2.25倍。该酶具有较强的耐碱性和耐热性，在ph5.5-10.5范围内能够维持90％以上的酶活力，且在ph12.0的条件下，仍可保留75％的酶活力；在65℃条件下处理1h仍能维持90％以上的酶活力，在75℃时，仍保留60％以上的酶活力。
[0030]
同时，通过分析酶系发现，诱变菌株ac-77所产纤维素酶具有更高的耐碱性内切酶活性及更低的滤纸及外切纤维素酶活性，其滤纸酶活性(0.1u/ml)、外切纤维素酶活性(0.03u/ml)及β-葡萄糖苷酶活性(未测到)均较低，因此，在使用时不会对棉纤维造成破坏性损伤，在制浆造纸、天然纤维素织物的水洗整理以及洗涤剂等行业中具有潜在的应用价值。
附图说明：
[0031]
图1不同反应ph下相对酶活变化曲线；
[0032]
图2不同反应温度下相对酶活变化曲线；
[0033]
图3酶的热稳定性相对酶活曲线；
[0034]
图4酶的ph稳定性相对酶活曲线。
具体实施方式：
[0035]
通过具体实施例对本发明作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本发明实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本发明原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本发明保护的范围。
[0036]
实施例1菌株的诱变
[0037]
将出发菌株接种到种子培养基中，37℃，200r/min，培养24h，得到待诱变菌悬液。
[0038]
将菌悬液置于无菌离心管中，于8000r/min离心10min分离沉淀菌体，弃上清，用生理盐水洗涤-沉淀菌体2次，然后用缓冲液重悬菌体，并加入ntg母液，使得ntg最终浓度为0.5g/l。在37℃，100r/min往复震荡条件下，诱变20min。同时做对照试验，以缓冲液代替ntg母液，其它处理相同。
[0039]
诱变结束，用缓冲液离心洗涤3次，重悬菌体后取菌悬液200μl做梯度稀释，取100μl涂布于筛选平板a(培养基a)上，37℃倒置培养48h左右，计算致死率。
[0040]
种子培养基(g/l)：酵母膏10，蛋白胨10，nacl 5，kh2po
4 1，na2co
3 10(分开灭菌)，ph7.5，121℃灭菌20min。
[0041]
培养基a(g/l)：酵母膏5，蛋白胨10，cmc-na 20，nacl 5，琼脂粉15，其余为水，ph7.5，121℃灭菌20min。
[0042]
实施例2菌株的筛选
[0043]
利用透明圈筛选与常规活力测定方法相结合，筛选高产菌株。
[0044]
初筛：分离筛选生长旺盛的菌落，用牙签转移到固体筛选平板b(培养基b)上，37℃倒置培养，待菌长出后往培养皿中覆盖适量1mg/ml的刚果红溶液，染色15min后弃去染液，加入适量1mol/l的nacl溶液洗涤，15min后倒掉nacl溶液。产纤维素酶(cmc酶)的菌落周围会出现清晰的透明圈，透明圈的大小可以反应出酶活力的高低。将筛选透明圈大的菌株，利用平板划线法进行分离纯化，反复3次后，挑取单菌落接种到斜面培养基a中，37℃培养24h后于4℃冰箱中保藏。
[0045]
菌株摇瓶产酶复筛：将斜面培养基上的菌株接种到种子培养基中，37℃，200r/min摇床培养24h，按3％接种量转接至发酵摇瓶中，每株做5个重复，37℃，200r/min摇床培养48h，将发酵液在4℃、8000r/min条件下离心10min，收集上清液测定cmc酶活力。
[0046]
最终，通过ntg诱变筛选得到一株命名为ac-77的高产菌株，其cmc酶活力可达到76.1u/ml，比出发菌株23.4u/ml提高了2.25倍。
[0047]
培养基b(g/l)：kh2po
4 2、nh4no
3 1.4、mg(no3)
2 0.3、cacl
2 0.3、nano30.005、mn(no3)
2 0.016、zncl
2 0.017mg、cocl
2 0.002mg、cmc-na 20、琼脂粉15，其余为水，ph7.5，121℃灭菌20min。
[0048]
斜面培养基(g/l)：酵母膏5，蛋白胨10，cmc-na 10，nacl 5，琼脂粉20，其余为水，ph7.5，121℃灭菌20min。
[0049]
种子培养基(g/l)：酵母膏10，蛋白胨10，nacl 5，kh2po
4 1，na2co
3 10(分开灭菌)，其余为水，ph7.5，121℃灭菌20min。
[0050]
摇瓶发酵培养基(g/l)：cmc-na 10，豆饼粉20，淀粉10，nacl 5，kh2po41，na2co
3 10(分开灭菌)，其余为水，ph7.5，121℃灭菌20min。
[0051]
实施例3高产菌株ac-77的稳定性传代试验
[0052]
将突变菌株ac-77进行传代实验，以第一代菌株的摇瓶发酵酶活力为100％，计算相对酶活力。由表1可以看出，该菌株连续传代10次产酶能力变化不大，具有良好的传代稳定性。
[0053]
表1.菌株ac-77遗传稳定性实验结果
[0054] 摇瓶酶活力(u/ml)相对酶活力(％)n176.1100n277.1101n375.199n476.6101n572.395n678.0102n778.0102n873.396n973.296n1079.9105
[0055]
实施例4芽孢杆菌(bacillus sp.)ac-77发酵产酶
[0056]
1.种子培养
[0057]
培养基质量体积百分比组成如下：
[0058]
(1)斜面培养基(g/l)
[0059]
酵母膏5，蛋白胨10，cmc-na 10，nacl 5，琼脂粉20，ph7.5，121℃灭菌20min。
[0060]
(2)液态培养基(g/l)
[0061]
酵母膏10，蛋白胨10，nacl 5，kh2po
4 1，na2co
3 10(分开灭菌)，其余为水，ph7.5，121℃灭菌20min。
[0062]
(3)培养条件
[0063]
斜面：37℃培养24h；
[0064]
液体种子：37℃培养24h，摇床转速200r/min；
[0065]
2.种子罐扩大培养
[0066]
培养基质量体积百分比组成如下：
[0067]
(1)种子罐培养基(g/l)
[0068]
豆饼粉30，葡萄糖20，蛋白胨15，kh2po
4 1.2，ph7.5。
[0069]
(2)种子罐灭菌工艺条件
[0070]
121℃-124℃，0.11-0.12mpa条件下，灭菌35min。
[0071]
(3)种子罐培养工艺条件
[0072]
将摇瓶种子按照体积比10％的接种量转接到种子罐中继续培养12h，控制罐压0.05-0.08mpa，培养温度37℃，搅拌转速200r/min，ph控制7.5-8.0。
[0073]
(4)种子罐移种条件
[0074]
菌体染色深、粗壮，无杂菌。
[0075]
3.液态发酵
[0076]
(1)发酵罐培养基(g/l)
[0077]
豆饼粉20，淀粉10，麸皮10，nacl 5，mgso
4 0.4g，k2hpo
4 0.5，feso
4 0.01，ph7.5。
[0078]
(2)发酵罐灭菌工艺条件
[0079]
121℃-124℃，0.11-0.12mpa条件下，灭菌35min。
[0080]
(3)发酵罐发酵工艺条件
[0081]
将扩大培养后的种子液按照体积比10％的接种量接入到发酵罐培养基中，控制罐压0.05-0.08mpa，培养温度37℃，转速500r/min，ph 7.5-8.0，溶氧20％-30％。
[0082]
4.补料
[0083]
(1)补料培养基(g/l)
[0084]
豆饼粉30，淀粉液化液140，k2hpo
4 0.5，ph7.5。
[0085]
(2)补料培养基灭菌工艺条件
[0086]
121℃-124℃，0.11-0.12mpa条件下，灭菌35min。
[0087]
(3)补料方法
[0088]
当溶氧降至最低再回升至20％时，开始补料，控制溶氧在20％-30％之间。发酵过程通过协调补加补料培养基、液氨、磷酸来控制发酵液ph，使其维持在7.5-8.0范围内。
[0089]
5.放罐
[0090]
培养至发酵液酶活增长缓慢或不再增长，菌体开始部分自溶时放罐。
[0091]
6.提取与精制
[0092]
收集放罐后的发酵液(酶活力为160u/ml)，加入0.2％的防腐剂、4％磷酸氢二钠和2％氯化钙进行絮凝，再加入3％珍珠岩助滤剂，利用板框进行压滤，得到澄清酶液。用10000分子量超滤膜对所述澄清酶液进行超滤，得到超滤液。在所述超滤液中加入质量百分比40％稳定剂、0.5％防腐剂和5％氯化钠，完全溶解后调节ph值至8.0，最后用硅藻土精滤除菌，即得到碱性纤维素酶液体酶制剂(酶活力为103u/ml)。所述稳定剂为质量比2:1:1的葡萄糖、甘油和山梨醇，所述防腐剂为质量比为1:1的山梨酸钾和苯甲酸钠。
[0093]
实施例5芽孢杆菌(bacillus sp.)ac-77生产性能验证
[0094]
按照实施例4芽孢杆菌(bacillus sp.)ac-77发酵产酶方法，进行50l发酵罐产酶性能验证实验，发酵周期100-110h，共计6批次，每次实验设定3个平行罐，最终酶活力取平均值，如表2所示。试验结果表明，该菌株不仅高产碱性纤维素酶而且其发酵水平具有良好的稳定性。
[0095]
表2高产碱性纤维素酶菌株的发酵产酶情况
[0096]
发酵批次发酵周期(h)发酵液酶活力(u/ml)110316021051543100169410416251081596106167
[0097]
实施例6碱性纤维素酶(cmc酶)活力测定
[0098]
cmc酶活力测定方法：以ph9.0甘氨酸-naoh溶液为缓冲液，利用1％cmc-na溶液为底物，以dns比色法测定酶解后还原糖的生成量，表示酶的活力。取25ml刻度具塞试管，加入2ml用ph9.0缓冲溶液配制的cmc-na溶液，置于水浴(55
±
1℃)中预热5分钟。加0.5ml适当稀释的待测酶液，用漩涡混匀器混匀，盖塞，置于水浴中，准确计时，反应30分钟后取出。迅速加入dns试剂3ml，摇匀。沸水浴显色10分钟，取出，迅速冷却至室温，用水定容至25ml。空白先加dns再加酶液，其余步骤相同。在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，以空白管(对照液)调仪器零点，测定吸光度值。每个样品测定3次重复，取平均值。
[0099]
在此条件下，每分钟水解底物产生1μmol葡萄糖的酶量定义为一个酶活单位，用u/ml表示。
[0100]
实施例7碱性纤维素酶的最适作用ph范围
[0101]
分别用醋酸－醋酸钠(ph4.0-5.0)、nah2po
4-na2hpo4(ph5.5-8.0)、甘氨酸-naoh(ph8.5-12.0)组成的缓冲体系，以0.5为间隔，配制不同ph值的缓冲液，用相应缓冲液配制不同ph的底物溶液，取实施例4所制备的ac-77碱性纤维素酶成品，在55℃水浴条件下分别测定不同ph条件下的酶活力，以确定最适反应ph。以最高酶活力(103u/ml)为100％，绘制不同ph条件下相对酶活力变化曲线。如图1所示，最适反应ph为9.0，且在ph6.0-10.5范围内能够维持90％以上的酶活性，作用范围广，可应用于中性和碱性条件。
[0102]
实施例8碱性纤维素酶的最适作用温度范围
[0103]
取实施例4所制备的ac-77碱性纤维素酶成品，在ph9.0的条件下中，分别在30-80
℃范围内，以5℃为间隔，在不同水浴温度条件下测定酶活力，以确定最适反应温度。以最高酶活力(103u/ml)为100％，绘制不同温度条件下相对酶活力变化曲线。如图2所示，最适反应温度为55℃，且在45-70℃之间，可以维持80％以上的酶活性，具有较好的耐热性。
[0104]
实施例9碱性纤维素酶的热稳定性
[0105]
取实施例4所制备的ac-77碱性纤维素酶成品，在ph9.0的条件下，以5℃为间隔，分别在30℃-80℃下保温1h，冷却后，在55℃、ph9.0条件下测定酶活力。以初始酶活力为100％，绘制热稳定性曲线。如图3所示，该酶在65℃条件下处理1h后能够维持90％以上的酶活力，在75℃条件下处理1h后，仍保留60％以上的酶活力，具有较高的热稳定性。
[0106]
实施例10碱性纤维素酶的ph稳定性
[0107]
取实施例4所制备的ac-77碱性纤维素酶成品，在55℃条件下，分别在ph4.0-12.0的缓冲液中保温1h，冷却后，在55℃、ph9.0条件下测定酶活力。以初始酶活力为100％，绘制ph稳定性曲线。如图4所示，该酶在ph为5.5-10.5条件下，能够维持90％以上的酶活力，在ph12.0的条件下，55℃保温1h仍保留75％的酶活力，具有较强的耐碱性。
[0108]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。