一种提取神经突触体的方法与流程

1.本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种提取神经突触体的方法。


背景技术：

2.突触是神经元之间功能联系和信号传导的关键部位，其将数十亿的神经元连接到神经元和神经胶质环路中，构成信息处理和驱动行为的基础，在调节人的学习、记忆以及思考方式中发挥关键作用。若突触在结构和功能上损伤，可能会导致大脑功能障碍疾病。
3.原位杂交技术揭示了在神经元树突、轴突和突触中存在大量的rna，且rna具有多样性，并且大量研究已经证明了某些蛋白在这些部位存在局部翻译。但在神经元与神经元之间，转录和翻译的特征及机制尚不清楚，仍需进行大量研究工作，如基因转录水平分析等，但目前对突触、树突及轴突部位rna提取的技术尚不成熟，限制了相关研究的的发展。
4.神经突触体(synaptodendrosome，sd)指突触小体及其夹断的突触末端和相连的树突片段，包括富集在突触小体周围并且由与突触形成和功能相关的特定的蛋白组成的亚细胞结构(特别是包含部分轴突、树突及突触前膜、突触后膜和突触链接复合体部分)，是树突中局部原位rna的潜在来源。目前，常用的神经突触体的提取方法是蔗糖、ficoll或percoll密度梯度超速冷冻离心法(rao a,steward o.evaluation of rnas present in synaptodendrosomes:dendritic,glial,and neuronal cell body contribution[j].journal of neurochemistry,1993,61(3):835-844.nagy a,delgado-escueta a v.rapid preparation of synaptosomes from mammalian brain using nontoxic isoosmotic gradient material(percoll)[j].journal of neurochemistry,2010,43(4):1114-1123.kanhema t,dagestad g,et al.dual regulation of translation initiation and peptide chain elongation during bdnf-induced ltp in vivo:evidence for compartment-specific translation control[j].journal of neurochemistry,2010,99(5):1328-1337.)。上述方法均是针对一般蛋白表达水平检测，会引起rna的降解，从得到的神经突触体中提取的rna不能满足精确或定量的基因表达研究实验如生物芯片、基因表达矩阵分析、高通量测序或qrt-pcr等。
[0005]
综上所述，提供一种操作简便且可改善rna降解的提取神经突触体的方法，从而能够从其中获得高质量的总rna，对于突触研究领域具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种提取神经突触体(synaptodendrosome，sd)的方法，所述方法能够有效提取到神经突触体，且保持了神经突触体内rna的完整性，提取时间短，操作简便。
[0007]
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008]
本发明提供一种提取神经突触体的方法，所述提取神经突触体的方法包括以下步骤：
[0009]
(1)于2～8℃，将动物组织加入到组织匀浆缓冲液中进行研磨和过滤处理，得到组织匀浆；
[0010]
(2)一次离心，于2～8℃，依次将密度梯度为30％～40％的组织匀浆-optiprep溶液、密度梯度为24％～26％的optiprep溶液、密度梯度为14％～16％的optiprep溶液、密度梯度为11.5％～13.5％的optiprep溶液和密度梯度为8％～10％的optiprep溶液加入到离心管中，离心，得到一次离心液；
[0011]
(3)二次离心，于2～8℃，取一次离心液中神经突触体层，并加入到缓冲液中进行稀释，获得混合液，依次将密度梯度为20％～26％的percoll溶液、密度梯度为14％～16％的percoll溶液、密度梯度为9％～11％的percoll溶液、密度梯度为5％～7％的percoll溶液和混合液加入到离心管中，离心，得到二次离心液；
[0012]
(4)于2～8℃，取二次离心液中神经突触体层，加入缓冲液进行稀释，离心，收集沉淀，得到所述神经突触体。
[0013]
本发明的提取神经突触体的方法，全程控制在2～8℃进行操作，能够有效保持神经突触体中细胞活度，避免了rna的降解，通过控制离心时离心液的密度梯度分布能够高效快速地获取神经突触体，缩短了提取时间，从而获得具有高活性和rna完整性的神经突触体。
[0014]
优选地，步骤(2)所述离心(即一次离心)的转速为800～1200rpm，包括但不限于900rpm、1000rpm或1100rpm。
[0015]
优选地，步骤(2)所述离心的时间为10～30min，包括但不限于12min、14min、16min、18min、20min、25min、26min或28min。
[0016]
本发明中，控制一次离心的转速为800～1200rpm，时间为10～30min，能够高效去除组织匀浆中较大的组织和脑膜。
[0017]
优选地，步骤(1)所述组织匀浆缓冲液、步骤(3)所述缓冲液和步骤(4)所述缓冲液中含有rna酶抑制剂。
[0018]
优选地，所述rna酶抑制剂的浓度为4～40u/ml，包括但不限于5u/ml、8u/ml、10u/ml、12u/ml、20u/ml、25u/ml、30u/ml、32u/ml、34u/ml、36u/ml或38u/ml。
[0019]
本发明中，使用rna酶抑制剂能够有效缓解rna被rna酶降解。
[0020]
优选地，步骤(3)所述稀释的倍数为≥1.5倍，包括但不限于2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。
[0021]
本发明中，将一次离心得到的神经突触体层稀释至1.5倍以上，有助于二次离心时高效分离纯化神经突触体。
[0022]
优选地，步骤(1)所述动物组织包括鼠脑组织。
[0023]
优选地，步骤(1)所述组织匀浆缓冲液(homogenization buffer，hb)包括蔗糖、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇和氟化钠。
[0024]
优选地，所述蔗糖在所述组织匀浆缓冲液中的浓度为300～340mm，包括但不限于305mm、310mm、320mm、330mm、335mm或338mm。
[0025]
优选地，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液在所述组织匀浆缓冲液中的浓度为5～15mm，包括但不限于6mm、8mm、10mm、12mm或14mm。
[0026]
优选地，所述乙二胺四乙酸在所述组织匀浆缓冲液中的浓度为0.5～3mm，包括但
不限于0.6mm、0.8mm、1.0mm、1.5mm、2.5mm或2.8mm。
[0027]
优选地，所述二硫苏糖醇在所述组织匀浆缓冲液中的浓度为1～3mm，1.2mm、1.6mm、2mm、2.4mm或2.8mm。
[0028]
优选地，所述氟化钠在所述组织匀浆缓冲液中的浓度为0.1～0.5mm，包括但不限于0.2mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm或0.45mm。
[0029]
优选地，步骤(1)所述组织匀浆缓冲液、步骤(3)所述缓冲液和步骤(4)所述缓冲液中还包括蛋白酶抑制。
[0030]
优选地，步骤(1)步骤所述研磨的转速为1000～1500rpm，包括但不限于1100rpm、1200rpm、1300rpm或1400rpm。
[0031]
优选地，步骤(1)所述过滤的过滤器规格为25～35μm，包括但不限于23μm、28μm、30μm、32μm或34μm。
[0032]
优选地，步骤(1)所述过滤的过滤器包括尼龙过滤器。
[0033]
优选地，步骤(2)所述组织匀浆-optiprep溶液加入离心管前还需和组织匀浆缓冲液混合。
[0034]
优选地，所述组织匀浆-optiprep溶液和所述组织匀浆缓冲液的体积比为(1～1.5):2，包括但不限于1.1:2、1.2:2、1.3:2、1.4:2或1.45:2。
[0035]
优选地，步骤(2)所述optiprep溶液中还包括组织匀浆缓冲液(hb)。
[0036]
优选地，按表1所示配制optiprep溶液。
[0037]
表1
[0038]
密度梯度(％)optiprep(ml)hb(ml)8～100.32～0.43.6～3.6811.5～13.50.46～0.543.46～3.5414～160.56～0.643.36～3.4424～260.96～1.042.96～3.04
[0039]
优选地，步骤(2)所述神经突触体层包括一次离心液中由上至下的第1层分层组织和/或第2层分层组织。
[0040]
优选地，步骤(3)所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
[0041]
优选地，步骤(3)所述神经突触体层和缓冲液的体积比为1:(1～3)，包括但不限于1:1.5、1:1.8、1:2或1:2.5。
[0042]
优选地，步骤(3)所述percoll溶液还包括组织匀浆缓冲液或杜氏磷酸盐缓冲液。
[0043]
优选地，按表2所示配制percoll溶液。
[0044]
表2
[0045]
密度梯度(％)percoll(ml)hb/dpbs(ml)5～70.2～0.353.65～3.89～110.36～0.443.56～3.6414～160.56～0.643.36～3.4420～260.8～1.042.96～3.2
[0046]
优选地，步骤(3)所述离心的转速为2400～3600rpm，包括但不限于2500rpm、2800rpm、3000rpm、3400rpm或3500rpm。
[0047]
优选地，步骤(3)所述离心的时间为8～12min，包括但不限于9min、10min或11min。
[0048]
优选地，步骤(4)所述神经突触体层包括二次离心液中由上至下第3层分层组织和/或第4层分层组织。
[0049]
优选地，步骤(4)所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
[0050]
优选地，步骤(4)所述离心的转速为480～720rpm，包括但不限于490rpm、500rpm、550rpm、600rpm、650rpm、700rpm或710rpm。
[0051]
优选地，步骤(4)所述离心的时间为2～7min，包括但不限于3min、4min、5或6min。
[0052]
作为优选的技术方案，所述提取神经突触体的制备方法包括以下步骤：
[0053]
(1)于2～8℃，取动物组织加入到组织匀浆缓冲液中，于1000～1500rpm进行研磨，并使用25～35μm的尼龙过滤器进行过滤，得到组织匀浆；
[0054]
(2)一次离心，于2～8℃，依次将密度梯度为30％～40％的组织匀浆-optiprep溶液、密度梯度为24％～26％的optiprep溶液、密度梯度为14％～16％的optiprep溶液、密度梯度为11.5％～12.5％的optiprep溶液和密度梯度为8％～10％的optiprep溶液加入到离心管中，800～1200rpm离心10～30min，得到一次离心液；
[0055]
(3)二次离心，于2～8℃，取一次离心液中由上至下的第1层分层组织和/或第2层分层组织，并加入到含有4～40u/ml rna酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液中稀释≥1.5倍，获得混合液，依次将密度梯度为20％～26％的percoll溶液、密度梯度为14％～16％的percoll溶液、密度梯度为9％～11％的percoll溶液、密度梯度为5％～7％的percoll溶液和混合液加入到离心管中，2400～3600rpm离心8～12min，得到二次离心液；
[0056]
(4)于2～8℃，取二次离心液中由上至下第3层分层组织和/或第4层分层组织，加入含有4～40u/ml rna酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液，480～720rpm离心2～7min，收集沉淀，得到所述神经突触体。
[0057]
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
[0058]
(1)本发明的提取神经突触体的方法，全程控制在2～8℃进行操作，能够有效保持神经突触体中细胞活度，避免了rna的降解，通过控制离心时离心液的密度梯度分布能够高效快速地获取神经突触体，缩短了提取时间，从而获得具有较高rna完整性的神经突触体；
[0059]
(2)本发明的提取神经突触体的方法提取得到的突触体中含有正确的生物标志物蛋白，且总rna完整性高，在神经突触体领域中具有广阔的发展前景。
附图说明
[0060]
图1为提取神经突触体流程图；
[0061]
图2为梯度离心示意图；
[0062]
图3为各层组织生物标志物蛋白表达结果；
[0063]
图4a为样品电泳图；
[0064]
图4b为样品峰图。
具体实施方式
[0065]
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非
对本发明的限定。
[0066]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
[0067]
实施例1
[0068]
本实施例对小鼠脑组织神经突触体进行提取，提取流程如图1所示，具体过程包括以下步骤：
[0069]
(1)在取组织前准备好以下试剂及材料：depc水；2.5m的蔗糖溶液(将蔗糖溶解在depc水中)；等渗percoll溶液(1体积2.5m的蔗糖溶液加入到9体积的100％percoll中)；组织匀浆缓冲液(homogenization buffer，hb)，按表3所示配制。
[0070]
表3
[0071][0072][0073]
(2)实验开始前于2～8℃预冷所有器械、试剂和耗材(不包含麻醉剂和注射针头)，在通风厨中，无菌条件下进行异氟烷麻醉鼠后，断颈，解剖取脑组织(cortex)迅速放进2ml含有4u/ml的rna酶抑制剂(rnase inhibitor，ri)和蛋白酶抑制剂预混液(proteinase inhibitor cocktail，pic)的hb溶液中，于1200rpm，在冰上反复上下研磨18次，直到组织研磨充分，用30μm的尼龙过滤器过滤研磨后的组织，获得组织匀浆(homogenate lysate，hom)。
[0074]
(3)第一步梯度离心，于2～8℃，将组织匀浆与optiprep溶液混合成35％的混合液(35％opti-prep with homogenate)，并按表4所示配制梯度离心溶液(hb中还含有4u/ml的ri和1片/7ml的pic)，35％opti-prep with homogenate为1.3ml，加入前与2ml hb混合，并根据图2加样，于4℃、10000
×
g离心10min，得到一次离心液。
[0075]
表4
[0076]
密度梯度(％)optiprep(ml)hb(ml)90.363.6412.50.53.5150.63.42513
[0077]
(4)第二步梯度离心，如图1所示，抽取一次离心液中由上至下的第1层分层组织(c1b1)和第2层分层组织(c1b2)，置于新的15ml离心管中，加入2倍体积的含有4u/ml的ri和1片/7ml的pic的pbs溶液，用步骤(1)等渗percoll按表5所示配制梯度离心溶液并按照图2所示加样，于4℃、32000
×
g离心9min，得到二次离心液。
[0078]
表5
[0079]
密度梯度(％)percoll(ml)hb/dpbs(ml)60.243.76100.43.6150.63.4230.923.08
[0080]
(5)于2～8℃，如图1所示取二次离心液中由上至下第3层分层组织(c2b3)和第4层分层组织(c2b4)，并加入含有4～40u/ml rna酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的pbs溶液，于4℃、6000
×
g离心5min，重复2次，收集沉淀，得到所述神经突触体(sd)，置于-80℃保存。
[0081]
试验例1
[0082]
本试验例根据已发表文章([1]westmark pr,westmark cj,jeevananthan a,malter js.preparation of synaptoneurosomes from mouse cortex using a discontinuous percoll-sucrose density gradient.j vis exp.2011sep 17；(55):3196.[2]kiebler ma,l
ó
pez-garc
í
a jc,leopold pl.purification and characterization of rat hippocampal ca3-dendritic spines associated with mossy fiber terminals.febs lett.1999feb 19；445(1):80-6.)，验证本次sd提取过程中，每个层带的蛋白是否和已发表文章相一致，采用细胞成分特异性抗体图1所示的c1b1、c1b2、c1b3、c1b4、c2b1、c2b2、c2b3、c2b4和hom进行标记，细胞成分特异性抗体为星形胶质细胞标志物gfap、神经突触小泡糖蛋白synaptophysin、神经元特异性核蛋白neun、突触后致密复合体的组装和功能相关的支架蛋白psd95和神经元特异性标志物β
ⅲ‑
tubulin，使用免疫印迹(western blot，wb)方法进行sd分离纯度分析，结果如图3所示，结果与已发表文章相一致，说明本发明提取的sd是正确的。
[0083]
试验例2
[0084]
为进一步验证本发明提取的sd是否满足转录组分析要求，本试验例提取所获得的sd中的总rna。
[0085]
使用trizon法提取sd中总rna，详细过程按invitrogen公司的trizol
tm
reagent的使用说明进行，获得sd中总rna，并对其进行完整性分析，以全脑组织(hom)的总rna为对照，分析实验进行1次技术重复，即分别对两个sd样品(sd1和sd2)和两个全脑组织样品(hom1和hom2)进行总rna完整性分析，图4a中，sd1和sd2两个样品有28s和18s有两个清晰条带，并且无杂带，与hom1和hom2结果相近；图4b中，四个样品峰图基线比较平整，28s和18s区峰值明显，峰图峰面积无显著差异。如表6所示，四个样品的rna完整性评分(rna integrity number，rin)均在8.5以上。综合上述表明sd中样品提取的rna保持了较高的完整性，本发明可以高效的提取sd且有效保护其总rna。
[0086]
表6
[0087][0088][0089]
综上所述，本发明的提取神经突触体的方法能够高效提取神经突触体，并能有效保护神经突触体中总rna的完整性，在神经突触体研究领域中具有广阔的发展前景。
[0090]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。