本发明涉及氨基酸发酵领域，尤其是一种l-赖氨酸的发酵方法。
背景技术：
l-赖氨酸是八种必需氨基酸之一，广泛应用于饲料工业，食品和医药行业中，其中约90％用于饲料添加剂。与其他必需氨基酸相比，谷物中l-赖氨酸含量最低，所以其可以用于平衡饲料中氨基酸比例，提高体内对谷类蛋白质的吸收。在食品行业中，l-赖氨酸主要用于食品营养强化剂，除臭剂和着色剂等。在医药行业方面，l-赖氨酸是合成激素、酶、抗体及各种氨基酸输液的原料。
在常规的l-赖氨酸发酵中，由于发酵初期的培养基浓度过高，产生对菌体过高的渗透压，使菌体生长缓慢,发酵周期延长。发酵中后期，发酵液中营养物质消耗不均，营养物质不平衡，可能缺少或积累某种营养，导致菌体活力下降，生长变慢过早衰亡，产酸效率低，副产物也会随之增加，发酵周期延长，经济效益降低。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种l-赖氨酸的发酵方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种l-赖氨酸的发酵方法，具体步骤如下：
(1)将-80℃保存的保菌管内的l-赖氨酸生产菌接种在斜面培养基上活化；
(2)将斜面培养基上的菌体接种到一级种子摇瓶中培养；
(3)将一级种子液接入5l发酵罐内进行二级种子培养；
(4)将二级种子液接入发酵培养基，发酵罐内进行发酵培养。
优选的，上述l-赖氨酸的发酵方法，所述步骤(1)中l-赖氨酸生产菌为谷氨酸棒杆菌。
优选的，上述l-赖氨酸的发酵方法，所述步骤(1)中斜面培养基：牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl2.5g/l，kh2po41g/l，mgso47h2o0.5g/l，琼脂粉25g/l；培养条件为32℃恒温培养12h。
优选的，上述l-赖氨酸的发酵方法，所述步骤(2)中采用的一级种子培养基为：葡萄糖25g/l，玉米浆15g/l，酵母粉5g/l，尿素5g/l，(nh4)2so45g/l，k2hpo410g/l，mgso47h2o0.5g/l，kh2po44g/l，vh0.2mg/l，vb11.5mg/l，vb3、5、7、12各0.3mg/l，半胱氨酸0.5g/l。
优选的，上述l-赖氨酸的发酵方法，所述步骤(2)中进行一级种子培养的方法为：将斜面上的菌体接种于三个1l的摇瓶，摇瓶中各含有一级种子培养基100ml，用氨水调控ph7.0-7.2，摇床220rpm/min，32℃恒温培养8-9h，od600达到20左右。
优选的，上述l-赖氨酸的发酵方法，所述步骤(3)中采用的二级种子培养基为：玉米浆15g/l，(nh4)2so48g/l，nacl2.5g/l，mgso47h2o4g/l，kh2po45g/l，feso4120mg/l，mnso4120mg/l，右旋泛酸钙(vb5)9mg/l，vb14.5mg/l，vb3、5、7、12各0.3mg/l，vh1.8mg/l。
优选的，上述l-赖氨酸的发酵方法，所述步骤(3)中进行二级种子培养的方法为：将三个100ml的一级种子液和100ml的80％葡萄糖接入5l发酵罐，罐内装有2.6l种子培养基。发酵全程控制发酵温度32℃，溶氧30-50％，ph7.0，当溶氧低于30％时提高转速和风量，培养至od600≥25，种龄21-23h。
优选的，上述l-赖氨酸的发酵方法，所述步骤(4)中所述发酵培养基为：玉米浆20g/l，豆粕水解液20ml/l，(nh4)2so430g/l，mgso47h2o1.2g/l，kh2po42g/l，feso410mg/l，mnso412mg/l，右旋泛酸钙(vb5)18mg/l，vb3、5、7、12各0.5mg/l，vb118mg/l，znso40.6mg/l，vh0.8mg/l。
优选的，上述l-赖氨酸的发酵方法，所述步骤(4)中进行发酵培养的方法为：将种子液放出至剩余800ml，发酵培养基按4:6的比例，40％作为发酵底料定容2.1l，加入到发酵罐内；60％配成发酵浓缩液，定容300ml，从发酵开始后2h开始流加至发酵结束前4h，发酵全程控制发酵温度32℃，溶氧30-50％，ph7.0，当溶氧低于30％时提高转速和风量。
优选的，上述l-赖氨酸的发酵方法，所述步骤(4)的发酵罐内流加糖为含量80％的葡萄糖、流加45g/l的硫酸铵溶液和硫胺，具体方法为：残糖降到0.5g/l开始流加80％葡萄糖使整个发酵过程残糖控制在5-8g/l；氨氮降到0.1％开始流加硫酸铵溶液和硫胺使氨氮含量控制在0.1-0.15％。
优选的，上述l-赖氨酸的发酵方法，所述步骤(4)中所述发酵浓缩液可以根据菌体生长情况确定流加时间和流加速度，若菌体生长旺盛，发酵液od600增长速度降低，可提前开始流加。发酵后期若菌体生长缓慢，可适当加快流加速度。所述发酵浓缩液从发酵开始2h开始流加，直至发酵结束前4h，流加时间可根据发酵过程中菌体生长情况调节。
有益效果：
上述l-赖氨酸的发酵方法，采用营养分割发酵和高密度发酵相结合的方式，发酵培养基按4：6的比例，40％作为发酵底料，60％配成发酵浓缩液，在发酵开始后2h开始流加至发酵结束前4h，通过降低初始发酵培养基浓度，防止营养过于丰富对菌体渗透压过大，对菌体生长产生抑制；发酵2h开始的营养分割发酵弥补菌体生长过程中营养的不足和不平衡，从而提高菌体活力，提高发酵液中菌体密度，将菌体量提高约20％，将发酵周期从44h缩短至40h，降低成本；发酵过程中平衡的营养补充会使代谢流更多地流向l-赖氨酸，转化率从70％提升至73％，有效减少乙酸，丙氨酸等副产物生成，l-赖氨酸产量从223g/l提高到261g/l。
具体实施方式
实施例1
一种发酵生产l-异亮氨酸的方法，具体方法如下：
(1)将-80℃保存的保菌管内的l-赖氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌接种在斜面培养基上活化，32℃恒温培养12h。
(2)将斜面上的菌体接种于3个1l的三角瓶，其中含有一级种子培养基100ml，用氨水调节ph7.0-7.2，摇床220rpm/min，32℃恒温培养8-9h，od600达到20左右。
(3)将三个100ml的一级种子液和100ml的80％葡萄糖接入5l发酵罐，罐内装有2.6l种子培养基，发酵全程控制发酵温度32℃，溶氧30-50％，ph7.0，当溶氧低于30％时提高转速和风量。培养至od600≥25，种龄21-23h。
(4)将种子液放出至剩余800ml，发酵培养基按4:6的比例，40％作为发酵底料定容2.1l，加入到发酵罐内；60％配成发酵浓缩液，定容300ml，从发酵开始后2h开始流加至发酵结束前4h。发酵全程控制发酵温度32℃，溶氧30-50％，ph7.0，当溶氧低于30％时提高转速和风量。
发酵罐流加糖为含量80％的葡萄糖；流加45g/l的硫酸铵溶液和硫胺。残糖降到0.5g/l开始流加80％葡萄糖，整个发酵过程糖控制在5-8g/l；氨氮降到0.1％开始流加硫酸铵和硫胺，氨氮含量控制在0.1-0.15％。
上述培养基配方如下：
斜面培养基：牛肉膏10g/l；蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l；nacl2.5g/l；kh2po41g/l；mgso47h2o0.5g/l；琼脂粉25g/l。
一级种子培养基：葡萄糖25g/l；玉米浆15g/l；酵母粉5g/l；尿素5g/l；(nh4)2so45g/l；k2hpo410g/l；mgso47h2o0.5g/l；kh2po44g/l；vh0.2mg/l；vb11.5mg/l；vb3、5、7、12各0.3mg/l；半胱氨酸0.5g/l。
二级种子培养基：玉米浆15g/l；(nh4)2so48g/l；nacl2.5g/l；mgso47h2o4g/l；kh2po45g/l；feso4120mg/l；mnso4120mg/l；vb14.5mg/l；vb3、5、7、12各0.3mg/l；vh1.8mg/l。
发酵培养基：玉米浆20g/l，豆粕水解液20ml/l；(nh4)2so430g/l；mgso47h2o1.2g/l；kh2po42g/l；feso410mg/l；mnso412mg/l；右旋泛酸钙(vb5)18mg/l；vb3、5、7、12各0.5mg/l；vb118mg/l；znso40.6mg/l；vh0.8mg/l。
对比例1
一种发酵生产l-异亮氨酸的方法，菌种和各级培养基配方同上述实施例1，具体方法如下：
(1)将-80℃保存的保菌管内的l-赖氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌b253(专利申请号201910393041.4/公开号cn110129247a)接种在斜面培养基上活化，32℃恒温培养12h。
(2)将斜面上的菌体接种于三个1l的摇瓶，摇瓶中各含有一级种子培养基100ml，用氨水调控ph7.0-7.2，摇床220rpm/min，32℃恒温培养8-9h，od600达到20左右。
(3)将三个100ml的一级种子液和100ml的80％葡萄糖接入5l发酵罐，罐内装有2.6l种子培养基。发酵全程控制发酵温度32℃，溶氧30-50％，ph7.0，当溶氧低于30％时提高转速和风量。培养至od600≥25，种龄21-23h。
(4)将种子液放出至剩余800ml，发酵培养基定容2.1l加入到发酵罐内。发酵罐流加糖为含量80％的葡萄糖；流加45g/l的硫酸铵溶液和硫胺。残糖降到0.5g/l开始流加80％葡萄糖，整个发酵过程糖控制在5-8g/l；氨氮降到0.1％开始流加硫酸铵和硫胺，氨氮含量控制在0.1-0.15％。
实施例1与对比例1的发酵对比数据见表1.
表1
从表1中可以看出实施例1比对比例1的最终菌体量和最高菌体量分别提高了15％和18％，这说明营养分割策略解决了发酵前期培养基过度丰富的问题，解除了高渗透压对菌体的抑制。解决了发酵中后期营养物质的不足和不平衡问题，提高了菌体活力和菌体密度。
发酵过程中平衡的营养补充还会使代谢流更多地流向l-赖氨酸，糖酸转化率从70％提升至73％，从而将发酵周期从44h缩短到40h，且产量提升了17.04％。
综上，本发明所述发酵生产l-异亮氨酸的方法采用营养分割发酵策略，可以弥补发酵中后期菌体由于生长代谢造成的营养消耗不均和营养不足和不平衡的缺点，从而提高菌体活力，提高发酵液中菌体密度，将发酵菌体量提高约20％,从而缩短发酵周期，降低成本；发酵过程中平衡的营养补充会使代谢流更多地流向l-赖氨酸，有效减少乙酸，丙氨酸等副产物生成，l-赖氨酸产量从223g/l提高到261g/l。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。