一种牙龈卟啉单胞菌的取样方法及其应用与流程

本发明涉及一种微生物培养
技术领域：
，尤其涉及一种牙龈卟啉单胞菌的取样方法及其应用。
背景技术：
：牙龈卟啉单胞菌是一种革兰氏阴性、产黑色素的专性厌氧拟杆菌，经常在牙周疾病患者的口腔中检出，因此被认为是牙周疾病最重要的可疑致病菌之一。近年研究表明，其存在也与全身多系统疾病关系密切。流行病学研究表明，牙龈卟啉单胞菌可在牙周袋、龈沟、齿间、舌面、牙龈等部位检出，唾液、口腔脱落细胞中也有存在。此外，牙龈卟啉单胞菌存在多种克隆株，不同国家、地区和种族个体分离的牙龈卟啉单胞菌菌株间的生物学性状存在一定的差异，同一个体在不同牙周状态时，其牙周袋内存在的同种细菌可能属于不同毒力的克隆型。在我国，对牙龈卟啉单胞菌的研究多集中在该菌标准菌株(atcc33277)与致病的关系，而对中国人群口腔中牙龈卟啉单胞菌临床菌株的生物学特性的研究则少有报道。目前，主要从慢性牙周炎、根尖周炎等患者中对口腔牙龈卟啉单胞菌进行取样，常采用纸尖吸附法、龈下刮治器收集法。纸尖吸附法使用最为普及，常使用无菌滤纸条插入牙周袋内，利用纸条吸附作用，获得龈下菌斑或龈沟液；龈下刮治器收集法一般选取患者磨牙区牙周袋最深位点取样，用无菌挖匙去除龈上菌斑，然后用无菌龈下刮治器收集牙龈底部的龈沟液或菌斑。这两种取样方法有以下局限性：(1)均需要特定器材的辅助；(2)要深入牙周袋内取样，对于牙周袋不明显的个体，可操作性不强；(3)操作中需要拨开牙龈使取样部位充分暴露，易造成受试者的不适；(4)对炎症部位的操作，会加剧牙龈出血，从而加剧感染。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一种牙龈卟啉单胞菌的取样方法，以解决现有技术中取样受牙周袋状态限制、取样繁琐、需要特定器材辅助以及增加患者感染风险等问题。本发明的第一个目的采用如下技术方案实现：一种牙龈卟啉单胞菌的取样方法，包括以下步骤：取出tsb液体培养基进行厌氧预平衡处理；取出无菌牙线棒；将无菌牙线棒的牙线嵌入人的牙缝间，在牙龈处往返拉动至少两次；取出牙线，将牙线的纤维线剪掉并浸入已经过厌氧预平衡处理的tsb液体培养基中；采用无菌枪头吹打数次浸有纤维线的tsb液体培养基，完成取样。进一步地，将所述牙线嵌入人的第三磨牙和第四磨牙之间的牙缝中进行取样。进一步地，将所述牙线在牙龈处往返拉动2～4次。进一步地，将牙线的纤维线剪掉并浸入100～200μl已经过厌氧预平衡处理的tsb液体培养基中。进一步地，其特征在于，将所述牙线嵌入健康人或者牙周炎患者的牙缝间进行取样。进一步地，对所述tsb液体培养基进行厌氧预平衡处理的厌氧条件为85％n2、5％h2和10％co2。进一步地，所述tsb液体培养基由重量组分为30份的tsb和5份的酵母提取物加入到1l的无菌水中配制而成。本发明的第二个目的在于提供一种上述的牙龈卟啉单胞菌的取样方法在原代分离筛选牙龈卟啉单胞菌方面的应用。相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明通过采用无菌牙线棒从人体的牙缝中直接取样，也就是直接在牙缝中往返拉动至少两次牙线即可，不受牙周袋状态的限制，也不需要特定器材的予以辅助，在取样过程中不用拨开牙龈使取样部位充分暴露。因此，本发明提供的牙龈卟啉单胞菌的取样方法简单、快捷，不依赖特殊设备器材，无创无痛，不会加剧牙龈出血，也不会增加感染风险，并且也能够从健康个体中取到样本，样本即采即用。附图说明图1是分别采用本发明提供的牙龈卟啉单胞菌的取样方法和纸尖吸附法对牙周病患者进行取样获得的细菌进行实时荧光定量pcr的结果图；图2是采用本发明提供的牙龈卟啉单胞菌的取样方法对健康个体进行取样获得的细菌进行实时荧光定量pcr检测的结果图。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。实施例一：在本实施例中，分别采用本发明提供的牙龈卟啉单胞菌的取样方法和纸尖吸附法对牙周病患者进行取样，并通过实时荧光定量pcr进行验证。具体步骤如下：1、采用本发明提供的牙龈卟啉单胞菌的取样方法进行取样：取无菌牙线棒一支，使牙线嵌入牙周病患者第三和第四磨牙牙缝间，在近牙龈处来回拉动3～4次，取出牙线，在超净工作台内用无菌眼科剪剪断两头，使牙线的纤维线浸入至已经过厌氧条件(85％n2、5％h2和10％co2)预平衡的100～200μltsb液体培养基中，无菌枪头吹打数次，使牙线上的细胞及微生物尽可能多地洗脱到培养基中，制成原始样本悬液。其中，tsb液体培养基由按重量组分计为30份的tsb和5份的酵母提取物加入至1l无菌水配制而成。2、取2～4μl原始样本悬液，标记为pr-1，进行菌液qpcr检测，验证原始样本悬液中是否含有牙龈卟啉单胞菌，并将剩余的样本悬液放入-80℃保存；3、qpcr检测，具体步骤如下：3.1、配制qpcr反应体系(总20μl)：成分体积(μl)细菌dna2～4上游引物0.5下游引物0.5taqman荧光探针(10μm)0.2aceqpcrprobemastermix(2×)10depc水4.8～6.8其中：上游引物：5’-accttacccgggattgaaatg-3’下游引物：5’-caaccatgcagcacctacatagaa-3’探针：5’-fam-atgactgatggtgaaaaccgtcttcccttc-tarma-3’其中，aceqpcrprobemastermix(vazyme，q112-03)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；所有引物和探针序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。3.2、qpcr扩增：将配制好的qpcr反应体系瞬时离心后，于bioradcfx96tm实时pcr系统上进行实时荧光定量pcr扩增分析。qpcr反应条件设置为：95℃，10min；95℃，10s，60℃，60s(采集信号)；40个循环。4、采用纸尖吸附法进行取样：将滤纸尖轻轻插入慢性牙周病患者牙周袋内，停留30s以上，将吸取龈沟液的纸尖转移至1.5ml无菌管中，标记为pa-1。5、qpcr检测：qpcr反应体系(总20μl)：成分体积(μl)细菌dna1～2上游引物0.5下游引物0.5taqman荧光探针(10μm)0.2aceqpcrprobemastermix(2×)10depc水6.8～7.8其中，引物、探针以及qpcr反应条件均与步骤3中的相同，在此不再详述。本步骤的qpcr扩增反应与步骤3的qpcr扩增反应在一个实时pcr仪上同时进行。6、结果分析：qpcr扩增完成后，利用cfxmaestrotmsoftware软件分析扩增结果。结果如图1所示，其中齿缝牙龈处表示采用本发明提供的取样方法取样得到的菌液进行qpcr扩增反应的曲线图，龈沟液表示采用纸尖吸附法取样得到的菌液进行qpcr扩增反应的曲线图，从图中可以看出，采用两种方法获得的菌液，牙龈卟啉单胞菌扩增的ct值接近，定量结果相似，由此可知，齿缝牙龈处存在的牙龈卟啉单胞菌的量与龈沟液中牙龈卟啉单胞菌的含量相当，本发明提供的牙龈卟啉单胞菌的取样方法可应用于牙龈卟啉单胞菌原代分离培养的取样。本发明通过采用无菌牙线棒从人体的牙缝中直接取样，也就是直接在牙缝中往返拉动至少两次牙线即可，不受牙周袋状态的限制，也不需要特定器材的予以辅助，在取样过程中不用拨开牙龈使取样部位充分暴露。因此，本发明提供的牙龈卟啉单胞菌的取样方法简单、快捷，不依赖特殊设备器材，无创无痛，不会加剧牙龈出血，也不会增加感染风险，并且也能够从健康个体中取到样本，样本即采即用。实施例二：在本实施例中，采用本发明提供的牙龈卟啉单胞菌的取样方法对健康个体进行取样，并通过实时荧光定量pcr进行验证。具体步骤如下：1、取无菌牙线棒一支，使牙线嵌入健康受试者第三磨牙和第四磨牙的牙缝中，在近牙龈处来回拉动3～4次，取出牙线，在超净工作台内用无菌眼科剪剪断两头，使纤维线浸入至已经过厌氧条件(85％n2、5％h2和10％co2)预平衡的100～200μltsb液体培养基中，采用无菌枪头吹打数次，使牙线上的细胞及微生物尽可能多地洗脱到培养基中，制成原始样本悬液，标记为pr-h1。2、取2～4μl原始样本悬液，进行菌液qpcr检测，验证原始样本悬液中是否含有牙龈卟啉单胞菌，并将剩余的样本悬液放入-80℃保存；3、qpcr检测：qpcr反应体系以及qpcr反应条件均与实施例一中步骤3的qpcr反应体系和反应条件相同，在此不再详述。4、结果分析：qpcr扩增完成后，利用cfxmaestrotmsoftware软件分析扩增结果，如图2所示，牙龈卟啉单胞菌扩增为阳性，且定量结果大约为1×105copies/ml。因此，采用本方法可以无创无痛且快速地得到含有牙龈卟啉单胞菌的样本。使牙龈卟啉单胞菌的研究对象不止局限于牙周炎患者，更拓宽到包括健康人在内的所有成年人群，为进一步大范围开展牙周炎致病菌，在相关癌种癌前病变中的作用研究，以及口腔厌氧致病菌与肿瘤发生关系的基础研究提供强有力的手段。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。当前第1页12