一种鸡早期胚胎提取方法及图谱制作的方法

本发明涉及一种鸡早期胚胎提取方法及图谱制作的方法。
背景技术：
：鸡是一种在体内受精，体外孵化的家禽。母鸡受精后产下的受精卵需在体外适应的温度，光照，湿度等条件才能由胚胎孵化为鸡雏。鸡早期胚胎的一系列正常阶段分为46个时期(hh46)(aseriesofnormalstagesinthedevelopmentofthechickembryo.jmorphol.1951jan；88(1):49-92.)，其中孵化的前三天包括了20个hh分期，为鸡早期胚胎发育的关键时期。制作发育图谱，有利于人们了解鸡胚胎发育各时期的生理特点，在生物医学上具有一定的借鉴意义，胚胎的正常发育决定孵化率以及鸡雏的健康程度，所以在农业畜牧生产中研究早期胚胎具有重要的意义。然而鸡胚胎发育是在体外的蛋壳环境内完成的，且早期鸡胚胎较小，胚胎发育区域有较多附着物，这为研究鸡早期胚胎发育造成困难。此前，一项国外的研究(improvedmethodforchickwhole-embryocultureusingafilterpapercarrier.devdyn.2001mar；220(3):284-9.)在琼脂-白蛋白的培养皿上用三层滤纸将其剪成三叶草形状并贴于蛋黄和蛋白上，再通过滤纸吸水性将早期胚胎取下，再进行处理。该技术能成功提取早期胚胎，具有一定成功率。滤纸环提取鸡早期胚胎的方法操作繁琐，对于滤纸厚度规格，提取人员的技术能力有一定要求；提取到的早期胚胎会附着卵黄颗粒蛋白等物质；在卵黄粘稠，卵黄膜透薄的情况下，容易造成提取失败，无法分离胚胎细胞，组织和器官；制作图谱时成像清晰度略差。近期的一项专利表明(发明创造名称：一种鸡胚胎提取物，中国公开号n106138101b,2019-09-17)通过种蛋去壳后将鸡胚胎干燥，粉碎来提取鸡胚胎提取物，该方法能提取到鸡胚胎较全的胚胎发育物，但是对于鸡早期胚胎的细胞、组织和器官的分离明显不适用。探索，寻找一种简单，高效，准确的提取鸡早期胚胎的方法显得尤为重要。技术实现要素：基于以上不足之处，本发明提供一种鸡早期胚胎提取的方法，克服了因为鸡蛋品质不同所造成蛋黄液影响早期胚胎提取较难的问题。本发明的目的是这样实现的：一种鸡早期胚胎提取的方法，如下：在蛋壳尖端剪一个开口，随后将胚胎内含物倾斜倒出至培养皿中，所述的培养皿中盛有温度为2-4℃平衡盐溶液；将鸡胚盘调整位置置于液面，持续冰浴，使用镊子刺入胚盘外缘以固定蛋黄，随后使用剪刀沿胚盘外缘切割，切割完成后，使用镊子将卵黄膜及胚盘拉出切割下的卵黄区域，随后使用镊子将胚盘外层的卵黄膜和蛋白层分离，此时胚盘已经完整分离，利用镊子将存有胚胎的完整胚盘拉置于载玻片上，随后将载玻片取出；所述的平衡盐溶液：称取1.000gnacl试剂至容器中，加ddh2o溶解定容至100ml，分别称取1.165gna2hpo4，0.165gkh2po4，0.01gcacl2，倒入容器中溶解，调节ph值到7.2，调渗透压至285mosm,最后细胞滤器过滤分装，放至2-4℃保存使用。本方法还具有如下技术特征：将种蛋内容物倒入盛有平衡盐溶液的培养皿中，所述的平衡盐溶液液面刚好淹没蛋黄。本发明的另一目的是提供一种鸡早期胚胎图谱，根据鸡早期胚胎发育的不同时期的孵化时间将鸡胚胎采用如上所述的一种鸡早期胚胎提取的方法取出，使用虫针固定姿态，调整固定时间及脱水时间在体式显微镜下拍照观察，制成图谱。本方法还具有如下技术特征：1、根据如上图谱将hh1-hh10阶段的胚胎置于载玻片，滴加质量浓度4％的多聚甲醛pfa，室温固定10min，将多余液体吸走，在体视显微镜下拍照各时期胚胎，做成图谱。2、根据如上图谱将hh11-hh20阶段的胚胎置于载玻片，滴加质量浓度4％的多聚甲醛pfa，室温固定30min，使用蒸馏水洗涤两次，将多余液体吸走，在体视显微镜下拍照各时期胚胎，做成图谱。3、根据如上图谱将hh21-hh35阶段的胚胎置于载玻片，滴加质量浓度4％的多聚甲醛pfa，室温固定2-3天，随后放置质量浓度75％乙醇中常温脱水1天，使用蒸馏水洗涤两次，将多余液体吸走，在体视显微镜下拍照各时期胚胎，做成图谱。本发明的有益效果及优点：本方法与滤纸环提取鸡早期胚胎方法相比，一方面节省成本，不需要前期的琼脂-白蛋白培养基的制作，降低生化试剂毒副作用；另外一方面提取成本低、效率高。采用本方法提取的鸡早期胚胎细胞、组织、器官活性较高，有利于鸡胚胎肝脏细胞，心脏组织的提取、分离和纯化，为鸡胚胎各组织器官细胞培养提供基础来源。早期胚胎图谱的制作成功说明了冰平衡盐溶液提取鸡早期胚胎是有效的，并且我们使用虫针固定鸡各个时期的胚胎，利于图谱制作。附图说明图1为本发明的鸡早期胚胎提取的方法流程图；图2为通过本发明的方法提取到的鸡早期胚胎发育图谱hh1-15阶段。具体实施方式下面根据说明书附图举例对本发明做进一步的说明：实施例1所需材料：种蛋、平衡盐溶液、眼科镊子、剪刀、大培养皿、载玻片、冰盆。准备工作：将平衡盐溶液置于2-4℃冰箱内，预冷30min，将已预冷好的平衡盐溶液100ml倒入大培养皿内(保证液面高度足以没过蛋黄)。提取种蛋胚胎数量过多时需要更换鸡早期胚胎提取平衡盐溶液。平衡盐溶液制作(100ml)：用分析天平称取1.000gnacl至250ml烧杯中，加ddh2o溶解定容至100ml，分别称取1.165gna2hpo4，0.165gkh2po4，0.01gcacl2，倒入烧杯，使用磁力搅拌器搅拌溶解，调节ph值到7.2，调渗透压至285mosm.最后细胞滤器过滤分装到50mlep管。放至2-4℃保存使用。如图1所示，一种鸡早期胚胎提取的方法，如下：使用剪刀将种蛋锐端敲碎，将锐端剪开2.5x2.5cm2大小，将胚胎内含物倾斜45°倒入盛有预冷好的平衡盐溶液的大培养皿中，将鸡胚盘调整位置置于液面，持续冰浴20秒，蛋黄与蛋白清晰可见，使用镊子剥离蛋白暴露出蛋黄，调整蛋黄方向，使得胚盘区朝向操作者。左手持眼科镊子，刺入蛋黄以固定胚盘，右手持剪刀，沿胚盘外沿垂直刺入蛋黄膜剪开一个开口后迅速抽出剪刀，随后60°刺入开口沿胚盘外沿切割蛋黄膜，此时左手镊子随着开口放大，不断沿顺时针旋转蛋黄以便快速剪掉胚盘。分离胚盘区后，迅速抽出镊子及剪刀，此时蛋黄液因处于低温环境流出较少，蛋黄膜形态未发生严重变形。利用镊子将剪下的胚盘拉出，如有黏附的蛋黄膜和蛋白则立即使用剪刀进行修剪。胚盘表面附着蛋白膜，将胚盘翻面，使用眼科镊子的尖端在胚盘边缘挑开蛋白膜，拉住胚盘缓慢分离，然后将胚盘翻面，此时为胚盘的正常方向，用无菌载玻片，伸入冰平衡溶液液面，将胚盘拉至载玻片。将胚胎置于载玻片，滴加平衡盐溶液覆盖整个胚胎，在显微镜下分离所需组织或器官。实施例2根据鸡早期胚胎发育的不同时期的孵化时间将鸡胚取出，采用如实施例1所述的一种鸡早期胚胎提取的方法，使用虫针固定姿态，调整固定时间及脱水时间在体式显微镜下拍照观察，制成图谱。依据表1：制作hh1-hh10分期阶段的胚胎图谱胎：用上述方法提取hh1-hh10的时期胚胎置于载玻片，滴加质量浓度4％的多聚甲醛pfa，室温固定10min，将多余液体吸走，在体视显微镜下拍照各时期胚胎，使用制图软件将各时期从hh1到hh10时期图片排列组合，做成图谱。制作hh11-hh20分期阶段的胚胎图谱胎：用上述方法提取hh11-hh20的时期胚胎置于载玻片，滴加质量浓度4％的多聚甲醛pfa，室温固定30min，使用蒸馏水洗涤两次，其他方法同上。制作hh21-hh35分期阶段的胚胎图谱胎：用上述方法提取hh21-hh35的时期胚胎置于载玻片，将胚胎提取后浸泡质量浓度4％多聚甲醛pfa2-3天，随后放置质量浓度75％乙醇中常温脱水1天，其他方法同上。表1.各hh分期对应的孵化时间hh分期孵化时间/hhh分期孵化时间/hhh分期孵化时间/h101752-64337.5-8d26-71865-69348d312-131968-72358-9d418-192070-723610d519-22213.5d3711d623-25223.5d3812d723-26233.5-4d3913d826-29244d4014d929-33254.5d4115d1033-38264.5-5d4216d1140-45275d4317d1245-49285.5d4418d1348-52296d4519-20d1450-53306.5d4620-21d1550-55317d1651-56327.5d当前第1页12