用于检测fmr1基因cgg重复数的引物和试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物学诊断领域，具体涉及一种用于fmr1基因cgg重复数检测引物及其试剂盒。
背景技术：2.脆性x综合征(fragile x syndrome,fxs)是一种x染色体连锁不完全显性遗传疾病，是引起先天性智力低下、自闭症障碍最常见的单基因疾病。据统计，发病率男性约1/4000，女性约1/6000，仅次于唐氏综合症。临床表型主要为中度至重度智力低下，其他表现为特殊面容，如招风耳、宽额头，男性可出现大睾丸，女性可出现卵巢早衰等。
3.绝大多数脆性x综合征患者是由于fmr1基因5’端非编码区(cgg)n重复序列异常扩增导致fmrp失活而引起发病。fmrp的主要生物学功能是负性调控自身靶mrna的翻译。fmrp失活引起神经元靶mrna过度翻译，破坏正常的突触可塑性，从而导致脆性x综合征的发生，进而引起不同程度的临床症状。cgg重复数在人群中具有高度多态性，正常重复数为6-44，最常见为30。重复数为55-200为“前突变”，重复数超过200为“全突变”，中间重复数45-54称为“灰色区域”，子代可扩增为前突变。女性前突变携带者无临床表型，但其子代为全突变的风险为94-100％。目前临床上主要通过遗传咨询和产前诊断来降低患儿出生率。
4.根据fmr1基因的特性，目前常见的分子检测方法有southern杂交、甲基化特异性pcr、免疫细胞化学法、实时荧光定量pcr等。但因成本高、实验要求高、体系复杂、周期长等原因限制了大范围应用。本发明的一种fmr1基因cgg重复数检测试剂盒，可有效避免现有技术的缺点，通过pcr扩增检测fmr1基因200以内cgg重复数，从而快速、精准地判断受检者是否为脆性x综合征患者。
技术实现要素：5.本发明的目的在于克服现有检测技术中的缺陷和不足，提供一种用于检测fmr1基因cgg重复数的引物及其试剂盒，可实现快速、简便、准确的检测，有效减少工作量、降低检测成本。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.用于检测fmr1基因cgg重复数的引物，其特征在于：所述引物包括用于扩增包含cgg重复区域、5’侧翼区和3’侧翼区的区域的引物对，其序列为：
8.上游引物f：5’fam-agccccgcacttccaccaccagctcctcca-3’(seq id no:1)
9.下游引物r：5
’‑
gctcagctccgtttcggtttcacttccggt-3’(seq id no:2)。
10.本发明在fmr1基因cgg重复序列的两端设计用于扩增检测目标片段的引物f、r，通过进行一个pcr反应体系扩增cgg重复片段，利用毛细管电泳法检测，可快速确定受检样本的fmr1基因cgg重复数，明确受检者是否为脆性x综合征患者。
11.本发明还提供了一种用于检测fmr1基因cgg重复数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增包含cgg重复区域、5’侧翼区和3’侧翼区的区域的引物对，其序列为：
12.上游引物f：5’fam-agccccgcacttccaccaccagctcctcca-3’(seq id no:1)
13.下游引物r：5
’‑
gctcagctccgtttcggtttcacttccggt-3’(seq id no:2)。
14.进一步地，所述试剂盒还包含dna聚合酶、缓冲溶液、dntps和标准品对照，所述标准品对照包括45、55、100个cgg重复的质粒。
15.进一步地，所述试剂盒包含第一pcr反应液(mix1)和第二pcr反应液(mix2)，所述第一pcr反应液(mix1)的组分为：水：1.8μl；1mm datp：0.75μl；1mm dttp：0.75μl；1mm dctp：0.75μl；5mm 7-deaza-atp：0.05μl；10μm f：0.2μl；10μm r：0.2μl；gc-rich resolution solution：3.5μl；
16.所述第二pcr反应液(mix2)的组分为：水：0.8μl；5
×
gc-rich reaction buffer：2μl；gc-rich enzyme mix：2μl；
17.所述第一pcr反应液和第二pcr反应液分别配置完成后，按如下体系混合：mix1：6.5μl；mix1：3μl；dna：0.5μl。
18.上述pcr反应混合液的扩增条件为：98.5℃预变性10min；98.5℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，14个循环；98.4℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，15个循环，每个循环完成后变性温度升高0.1℃；4℃终延伸。
19.扩增反应结束后，用毛细管电泳法检测反应产物。
20.毛细管电泳检测体系为：hidi：8.5μl；liz-600：0.5μl；pcr产物：1μl。混匀后95℃加热5min，然后冰上冷却2min，放入一代测序仪进行毛细管电泳扫描。检测结果用genemarker hid v1.76软件进行分析，读取片段长度，根据公式计算cgg重复数。公式为：cgg重复数n＝(片段长度-221)/3+4。
21.本发明的有益效果在于：
22.(1)本发明所设计的引物可以特异性扩增fmr1基因5’端非编码区(cgg)n重复序列的片段，实现长片段分析。
23.(2)本发明通过毛细管电泳可直接根据公式(重复数n＝(片段长度-221)/3+4)计算分析cgg重复数，进而快速确定受检样本结果，方法快捷简便，显著提高检测效率。
24.(3)本试剂盒可用于大规模人群筛查，使用96孔板时，加入45、55、100个cgg重复的标准品，可进行板间平行比较，同时确定试剂盒的准确性和精确度。
附图说明
25.图1为本发明实施例2中正常男性样本的cgg重复数检测电泳分析图。
26.图2为本发明实施例3中正常女性样本的cgg重复数检测电泳分析图。
27.图3为本发明实施例4中灰区男性样本的cgg重复数检测电泳分析图。
28.图4为本发明实施例5中灰区女性样本的cgg重复数检测电泳分析图。
29.图5为本发明实施例6中男性前突变患者样本的cgg重复数检测电泳分析图。
30.图6为本发明实施例7中女性前突变携带者样本的cgg重复数检测电泳分析图。
31.图7为本发明实施例8中女性前突变携带者样本的cgg重复数检测电泳分析图。
具体实施方式
32.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明
做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
33.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
34.实施例1 fmr1基因cgg重复数检测引物设计及检测
35.(1)在fmr1基因cgg重复序列的两端设计用于扩增检测目标片段的引物f、r；所述检测cgg重复数的上游引物f的序列如seq id no:1所示，其5’端带fam荧光；下游引物r的序列如seq id no:2所示；具体下表所示：
36.序列号引物(5
’‑3’
)seq id no:1fam-agccccgcacttccaccaccagctcctccaseq id no:2gctcagctccgtttcggtttcacttccggt
37.(2)反应体系：
38.mix1:
39.试剂体系(μl)water1.81mm datp0.751mm dctp0.751mm dttp0.755mm 7-deaza-atp0.0510um seq1(fmr1-f)0.210um seq2(fmr1-r)0.2gc-rich resolution solution3.5(单独加)
40.mix2:
41.试剂体系(μl)water0.85xgc-rich reaction buffer2gc-rich enzyme mix0.2
42.上述反应液分别配置完成后，按如下体系混合：mix1：6.5μl；mix1：3μl；dna：0.5μl。
43.(3)pcr扩增：
44.将pcr反应管放入pcr仪，按下表设定反应条件：
[0045][0046]
(4)毛细管电泳检测：反应体系如下表：
[0047]
试剂体系(ul)hidi8.5liz-6000.5pcr产物1
[0048]
以上混合物混匀后95℃加热5min，然后冰上冷却2min，放入一代测序仪进行毛细管电泳扫描。
[0049]
(5)结果判定：检测结果用genemarker hid v1.76软件进行分析，读取片段长度，一般为左侧次高峰，根据公式计算cgg重复数。公式为：cgg重复数n＝(片段长度-221)/3+4。
[0050]
实施例2正常男性样本cgg重复数检测
[0051]
(1)dna提取：在本人同意或其监护人知情条件下，采集其外周血。采用市售基因组dna提取试剂盒，提取样本外周血基因组dna。
[0052]
(2)使用实施例1的引物及其试剂盒准备pcr反应体系，通过对样本fmr1基因cgg重复序列进行pcr扩增，pcr反应体系包含第一pcr反应液(mix1)和第二pcr反应液(mix2)，所述第一pcr反应液(mix1)的组分为：水：1.8μl；1mm datp：0.75μl；1mm dttp：0.75μl；1mm dctp：0.75μl；5mm 7-deaza-atp：0.05μl；10μm f：0.2μl；10μm r：0.2μl；gc-rich resolution solution：3.5μl；
[0053]
所述第二pcr反应液(mix2)的组分为：水：0.8μl；5
×
gc-rich reaction buffer：2μl；gc-rich enzyme mix：2μl；
[0054]
所述第一pcr反应液和第二pcr反应液分别配置完成后，按如下体系混合：mix1：6.5μl；mix1：3μl；dna：0.5μl。
[0055]
pcr扩增条件为：98.5℃预变性10min；98.5℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，14个循环；98.4℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，15个循环，每个循环完成后变性温度升高0.1℃；4℃终延伸。
[0056]
(3)反应结束后，采用abi3500dx毛细管电泳仪检测反应产物。反应体系为：hidi：8.5μl；liz-600：0.5μl；pcr产物：1μl。混匀后95℃加热5min，冰上冷却2min，上机检测。
[0057]
(4)样本cgg重复数检测结果如图1所示，目的片段长度为297.2bp，该样本检测结果重复数为29，为正常样本。
[0058]
实施例3正常女性样本cgg重复数检测
[0059]
(1)dna提取：在本人同意或其监护人知情条件下，采集其外周血。采用市售基因组dna提取试剂盒，提取样本外周血基因组dna。
[0060]
(2)使用实施例1的引物及其试剂盒准备pcr反应体系，通过对样本fmr1基因cgg重复序列进行pcr扩增，pcr反应体系包含第一pcr反应液(mix1)和第二pcr反应液(mix2)，所述第一pcr反应液(mix1)的组分为：水：1.8μl；1mm datp：0.75μl；1mm dttp：0.75μl；1mm dctp：0.75μl；5mm 7-deaza-atp：0.05μl；10μm f：0.2μl；10μm r：0.2μl；gc-rich resolution solution：3.5μl；
[0061]
所述第二pcr反应液(mix2)的组分为：水：0.8μl；5
×
gc-rich reaction buffer：2μl；gc-rich enzyme mix：2μl；
[0062]
所述第一pcr反应液和第二pcr反应液分别配置完成后，按如下体系混合：mix1：6.5μl；mix1：3μl；dna：0.5μl。
[0063]
pcr扩增条件为：98.5℃预变性10min；98.5℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，14个循环；98.4℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，15个循环，每个循环完成后变性温度升高0.1℃；4℃终延伸。
[0064]
(3)反应结束后，采用abi3500dx毛细管电泳仪检测反应产物。反应体系为：hidi：8.5μl；liz-600：0.5μl；pcr产物：1μl。混匀后95℃加热5min，冰上冷却2min，上机检测。
[0065]
(4)样本cgg重复数检测结果如图2所示，目的片段长度为297.1bp和317.7bp，该样本检测结果重复数为29和36，为正常样本。
[0066]
实施例4灰区男性样本cgg重复数检测
[0067]
(1)dna提取：在本人同意或其监护人知情条件下，采集其外周血。采用市售基因组dna提取试剂盒，提取样本外周血基因组dna。
[0068]
(2)使用实施例1的引物及其试剂盒准备pcr反应体系，通过对样本fmr1基因cgg重复序列进行pcr扩增，pcr反应体系包含第一pcr反应液(mix1)和第二pcr反应液(mix2)，所述第一pcr反应液(mix1)的组分为：水：1.8μl；1mm datp：0.75μl；1mm dttp：0.75μl；1mm dctp：0.75μl；5mm 7-deaza-atp：0.05μl；10μm f：0.2μl；10μm r：0.2μl；gc-rich resolution solution：3.5μl；
[0069]
所述第二pcr反应液(mix2)的组分为：水：0.8μl；5
×
gc-rich reaction buffer：2
μl；gc-rich enzyme mix：2μl；
[0070]
所述第一pcr反应液和第二pcr反应液分别配置完成后，按如下体系混合：mix1：6.5μl；mix1：3μl；dna：0.5μl。
[0071]
pcr扩增条件为：98.5℃预变性10min；98.5℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，14个循环；98.4℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，15个循环，每个循环完成后变性温度升高0.1℃；4℃终延伸。
[0072]
(3)反应结束后，采用abi3500dx毛细管电泳仪检测反应产物。反应体系为：hidi：8.5μl；liz-600：0.5μl；pcr产物：1μl。混匀后95℃加热5min，冰上冷却2min，上机检测。
[0073]
(4)样本cgg重复数检测结果如图3所示，目的片段长度为350.6bp，该样本检测结果重复数为47，为灰区样本。
[0074]
实施例5灰区女性样本cgg重复数检测
[0075]
(1)dna提取：在本人同意或其监护人知情条件下，采集其外周血。采用市售基因组dna提取试剂盒，提取样本外周血基因组dna。
[0076]
(2)使用实施例1的引物及其试剂盒准备pcr反应体系，通过对样本fmr1基因cgg重复序列进行pcr扩增，pcr反应体系包含第一pcr反应液(mix1)和第二pcr反应液(mix2)，所述第一pcr反应液(mix1)的组分为：水：1.8μl；1mm datp：0.75μl；1mm dttp：0.75μl；1mm dctp：0.75μl；5mm 7-deaza-atp：0.05μl；10μm f：0.2μl；10μm r：0.2μl；gc-rich resolution solution：3.5μl；
[0077]
所述第二pcr反应液(mix2)的组分为：水：0.8μl；5
×
gc-rich reaction buffer：2μl；gc-rich enzyme mix：2μl；
[0078]
所述第一pcr反应液和第二pcr反应液分别配置完成后，按如下体系混合：mix1：6.5μl；mix1：3μl；dna：0.5μl。
[0079]
pcr扩增条件为：98.5℃预变性10min；98.5℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，14个循环；98.4℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，15个循环，每个循环完成后变性温度升高0.1℃；4℃终延伸。
[0080]
(3)反应结束后，采用abi3500dx毛细管电泳仪检测反应产物。反应体系为：hidi：8.5μl；liz-600：0.5μl；pcr产物：1μl。混匀后95℃加热5min，冰上冷却2min，上机检测。
[0081]
(4)样本cgg重复数检测结果如图4所示，目的片段长度为311.4bp和353.4bp，该样本检测结果重复数为34和48，为灰区样本。
[0082]
实施例6男性前突变患者样本cgg重复数检测
[0083]
(1)dna提取：在本人同意或其监护人知情条件下，采集其外周血。采用市售基因组dna提取试剂盒，提取样本外周血基因组dna。
[0084]
(2)使用实施例1的引物及其试剂盒准备pcr反应体系，通过对样本fmr1基因cgg重复序列进行pcr扩增，pcr反应体系包含第一pcr反应液(mix1)和第二pcr反应液(mix2)，所述第一pcr反应液(mix1)的组分为：水：1.8μl；1mm datp：0.75μl；1mm dttp：0.75μl；1mm dctp：0.75μl；5mm 7-deaza-atp：0.05μl；10μm f：0.2μl；10μm r：0.2μl；gc-rich resolution solution：3.5μl；
[0085]
所述第二pcr反应液(mix2)的组分为：水：0.8μl；5
×
gc-rich reaction buffer：2μl；gc-rich enzyme mix：2μl；
[0086]
所述第一pcr反应液和第二pcr反应液分别配置完成后，按如下体系混合：mix1：6.5μl；mix1：3μl；dna：0.5μl。
[0087]
pcr扩增条件为：98.5℃预变性10min；98.5℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，14个循环；98.4℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，15个循环，每个循环完成后变性温度升高0.1℃；4℃终延伸。
[0088]
(3)反应结束后，采用abi3500dx毛细管电泳仪检测反应产物。反应体系为：hidi：8.5μl；liz-600：0.5μl；pcr产物：1μl。混匀后95℃加热5min，冰上冷却2min，上机检测。
[0089]
(4)样本cgg重复数检测结果如图5所示，目的片段长度为412.4bp，该样本检测结果重复数为68，为男性前突变患者。
[0090]
实施例7女性前突变携带者样本cgg重复数检测
[0091]
(1)dna提取：在本人同意或其监护人知情条件下，采集其外周血。采用市售基因组dna提取试剂盒，提取样本外周血基因组dna。
[0092]
(2)使用实施例1的引物及其试剂盒准备pcr反应体系，通过对样本fmr1基因cgg重复序列进行pcr扩增，pcr反应体系包含第一pcr反应液(mix1)和第二pcr反应液(mix2)，所述第一pcr反应液(mix1)的组分为：水：1.8μl；1mm datp：0.75μl；1mm dttp：0.75μl；1mm dctp：0.75μl；5mm 7-deaza-atp：0.05μl；10μm f：0.2μl；10μm r：0.2μl；gc-rich resolution solution：3.5μl；
[0093]
所述第二pcr反应液(mix2)的组分为：水：0.8μl；5
×
gc-rich reaction buffer：2μl；gc-rich enzyme mix：2μl；
[0094]
所述第一pcr反应液和第二pcr反应液分别配置完成后，按如下体系混合：mix1：6.5μl；mix1：3μl；dna：0.5μl。
[0095]
pcr扩增条件为：98.5℃预变性10min；98.5℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，14个循环；98.4℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，15个循环，每个循环完成后变性温度升高0.1℃；4℃终延伸。
[0096]
(3)反应结束后，采用abi3500dx毛细管电泳仪检测反应产物。反应体系为：hidi：8.5μl；liz-600：0.5μl；pcr产物：1μl。混匀后95℃加热5min，冰上冷却2min，上机检测。
[0097]
(4)样本cgg重复数检测结果如图6所示，目的片段长度为299.7bp和444.4bp，该样本检测结果重复数为30和78，为女性前突变携带者。
[0098]
实施例8女性前突变携带者样本cgg重复数检测
[0099]
(1)dna提取：在本人同意或其监护人知情条件下，采集其外周血。采用市售基因组dna提取试剂盒，提取样本外周血基因组dna。
[0100]
(2)使用实施例1的引物及其试剂盒准备pcr反应体系，通过对样本fmr1基因cgg重复序列进行pcr扩增，pcr反应体系包含第一pcr反应液(mix1)和第二pcr反应液(mix2)，所述第一pcr反应液(mix1)的组分为：水：1.8μl；1mm datp：0.75μl；1mm dttp：0.75μl；1mm dctp：0.75μl；5mm 7-deaza-atp：0.05μl；10μm f：0.2μl；10μm r：0.2μl；gc-rich resolution solution：3.5μl；
[0101]
所述第二pcr反应液(mix2)的组分为：水：0.8μl；5
×
gc-rich reaction buffer：2μl；gc-rich enzyme mix：2μl；
[0102]
所述第一pcr反应液和第二pcr反应液分别配置完成后，按如下体系混合：mix1：
6.5μl；mix1：3μl；dna：0.5μl。
[0103]
pcr扩增条件为：98.5℃预变性10min；98.5℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，14个循环；98.4℃变性5s，56℃退火4min，69℃延伸6min，15个循环，每个循环完成后变性温度升高0.1℃；4℃终延伸。
[0104]
(3)反应结束后，采用abi3500dx毛细管电泳仪检测反应产物。反应体系为：hidi：8.5μl；liz-600：0.5μl；pcr产物：1μl。混匀后95℃加热5min，冰上冷却2min，上机检测。
[0105]
(4)样本cgg重复数检测结果如图7所示，目的片段长度为299.6bp和554.6bp，该样本检测结果重复数为30和115，为女性前突变携带者。
[0106]
以上所述的实验结果，仅为表示本发明的实际应用效果，因此不应以此实验结果限制本发明的范围。