一株潘多拉菌PandoraeapnomenusaS2-2菌株及其应用

本发明涉及微生物降解技术领域，更具体地，涉及一株潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株及其应用。

背景技术：

随着工业现代化的飞速发展，自然环境也不可避免受到了工业各种废弃物的污染，多氯联苯(polychlorinatedbiphenyls,pcbs)就是其中之一。早在1881年德国科学家sehmid和sehult首次在实验室合成pcbs，1929年美国最早开始生产pcbs，随后各国开始了多氯联苯的商业化、规模化生产，广泛应用工农业生产。pcbs具有化学惰性、热稳定性、低导电性和阻燃性等多种优良性质，且高度疏水性不溶于水和多种有机溶剂，广泛用于制造液压油、阻燃剂、密封剂和增塑剂，以多种商品形式在世界范围内流通。在pcbs大量生产、应用的同时，逐渐在环境和生物体内累积，危险性也逐渐开始显露。上世纪30年代已经有人提出关于pcbs的潜在风险，直到1968年日本爆发的“米糠油事件”、“美国孟山都事件”严重危害了社会公共安全，才真正引起人们的重视。

目前应用较多的降解多氯联苯污染治理方法主要有物理修复方法，化学修复方法和生物修复方法。其中，物理修复技术如吸附、沉淀和填埋，但并未从根本上消除pcbs，此外，通过添加表面活性剂来增强多氯联苯的溶解性，进一步更好的洗脱多氯联苯，以及通过微离子等电子体和微波辐射的技术，利用高能电子打断化学物质的化学键，从而达到瞬间分解污染物质的效果，但昂贵的离子设备限制了该技术的推广使用。化学方法处理pcbs反应快，目前常用的有焚烧法、氧化法、还原法、光解催化法和电解法等，能够彻底消除pcbs污染，但是反应条件较为苛刻，处理装置设备投资大，不能广泛应用。生物修复治理多氯联苯污染的方法，由于其更加绿色、环保、且成本低，在彻底消除环境污染的同时也对环境生态功能发挥着重要作用，逐渐成为环境治理的热门技术。授权公告号为cn102618457b的中国发明专利提供了一种生长速度快、培养方法简单、能高效、稳定降解多氯联苯的红球菌wb-1，不仅可在溶液中降解多氯联苯，还可以降解土壤中的多氯联苯残留，降解效率高达80～90％。但是，迄今为止应用此类微生物修复多氯联苯污染场地的工程案例仍然较少。其根本原因是多氯联苯降解菌资源不够丰富。微生物所能降解的多氯联苯的种类是有限的，而且降解效率也有高低之分，环境中常见的多氯联苯有60～90种，依靠一两株降解菌是无法将其全部降解的。

因此，今后仍需从环境中不断筛选多氯联苯降解菌，以积累更多优良的降解菌，从而为生物强化技术提供充足的微生物资源，同时也能为高效工程菌的构建提供基因资源。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有多氯联苯降解菌种类有限的问题，提供一株具有多氯联苯降解能力的潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株。

本发明的第二个目的在于提供所述潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株在降解多氯联苯或修复多氯联苯污染的自然环境方面的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于降解多氯联苯的方法。

本发明的第四个目的是提供所述潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株在制备降解多氯联苯的微生物制剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种用于降解多氯联苯的微生物制剂。

本发明的第六个目的是提供所述微生物制剂在降解多氯联苯或修复多氯联苯污染的自然环境方面的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一株潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株，其特征在于，所述菌株于2020年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏号为gdmccno：61284。

具体地，所述菌株的16srdna的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明从红树林底泥中分离纯化，筛选得到上述菌株，通过将所述潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株进行4-氯联苯降解试验，结果发现，pandoraeapnomenusas2-2菌株对c1(5mg/l)、c2(10mg/l)、c3(20mg/l)、c4(40mg/l)和c5(60mg/l)五组不同浓度的的4-氯联苯的降解率分别达到97.12％、99.54％、99.44％、99.66％和99.72％，随着4-氯联苯浓度的增加降解率逐渐升高，表明该菌株对pcbs具有良好的降解效果。

因此，本发明提供所述潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株在降解多氯联苯或修复多氯联苯污染的自然环境方面的应用。

优选地，所述多氯联苯的浓度为5～60mg/l。

最优选地，所述多氯联苯为4-氯联苯。

本发明还提供一种用于降解多氯联苯的方法，将潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株和/或其菌液接种到多氯联苯污染物中。

本发明还提供所述所述潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株在制备降解多氯联苯的微生物制剂中的应用。

本发明还提供一种用于降解多氯联苯的微生物制剂，所述药剂包含潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株和/或其菌液。

上述微生物制剂在降解多氯联苯或修复多氯联苯污染的自然环境方面的应用也应在本发明的保护范围内。

优选地，所述菌液为pandoraeapnomenusas2-2菌株经过发酵所得培养液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株及其应用，所述菌株于2020年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏号为gdmccno：61284。本发明研究表明，pandoraeapnomenusas2-2菌株具有高效降解多氯联苯的作用，pandoraeapnomenusas2-2菌株作为一种有效、绿色的多氯联苯污染降解菌，对于多氯联苯环境污染的修复，具有很好的潜力和应用前景。

附图说明

图1为mm30培养基菌落形态照片。

图2为lb培养基菌落形态照片。

图3为s2-2菌的革兰氏染色镜检照片。

图4为s2-2菌的扫描电镜图片。

图5为s2-2降解pcbs在不同时期的残留量。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1菌株s2-2的筛选

(1)选择性分离培养基的配制：

mixture44溶液(mg/100ml)：na2b4o7·10h2o17.7，cuso4·5h2o39.2，cacl2·6h2o20.1，znso4·7h2o1095，edta250，加入100-150μl浓h2so4，以防止产生沉淀。

微量金属盐溶液(mg/100ml)：edta0.5，caco31，feso4·7h2o0.5，mgso4·7h2o10，mnso4·h2o10，mixture4410ml。

大量元素溶液(g/l)：(nh4)2so41，kh2po43，na2po6，微量金属盐溶液0.5ml，调节ph7.1(通过滴加稀hcl与naoh进行调节)。

mm30液体培养基：(nh4)2so4g/l、1kh2po43g/l、na2po46g/l、微量金属盐溶液0.5ml、ph7.1(配制mm30培养基时，再加入维生素b120.0002mg/l促进诱导微生物脱氯。)

mm30固体培养基：mm30液体培养基中加入1.8％的琼脂，经高压蒸汽灭菌(121℃，0.1mpa)20min后，倒入培养皿中，待冷却凝固后加入联苯或多氯联苯溶液吹干备用。

lb培养基：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、ph7.0。

(2)菌株的筛选

(2-1)向mm30液体培养基加入联苯母液使其终浓度为200mg/l，静置使有机溶剂挥发后加入新鲜的红树林底泥样品适量，于30℃，180rpm恒温摇床中培养5～7d。

(2-2)取较为澄清菌悬液1ml加入bp浓度为200mg/l的mm30培养基中，将联苯作为唯一碳源进行传代，一次传代5～7次。

(2-3)取100μl菌液连续梯度稀释后均匀涂布于bp浓度为200mg/l的mm30固体培养基，于37℃培养箱倒置培养48～72h，挑取不同形态的菌落划线于含有联苯的mm30固体培养基中继续纯化培养直至获得单个菌落。

(2-4)将获得的单一菌株使用特异性引物(pcba1、pcba4、pcba5)进行扩增，引物序列如表1所示，加样体系如表2所示，pcr扩增程序如表3所示，凝胶电泳检查，将出现目的大小片段的菌株进转接于以pcb3(4-氯联苯)为唯一碳源的mm30液体培养基中继续传代5～7次。

(2-5)蘸取菌液划线接种于pcb3为唯一碳源的mm30固体培养基，倒置培养48～72h，获得单一菌落。

表1引物序列

表2加样体系

表3pcr扩增程序

实施例2菌株s2-2鉴定

1、传统的生物学鉴定

(1)菌株s2-2的外观特征

在传代过程中，在mm30培养基上生长较为缓慢，s2-2在接种后72h左右形成肉眼可见的针尖大小的偏透明菌落，如图1所示。

在lb固体培养基上，s2-2在72h-96h后呈现肉眼可见的半透明球形菌落，如图2所示。

图3为s2-2的革兰氏染色显微镜图(放大倍数1000x)，s2-2是革兰氏阴性菌株，观察到粉红色的长杆状，多排列成链状或y字形。

图4为s2-2的扫描电镜图，在电镜下分别在5k倍和45k倍数下观察菌株形态，发现s2-2在电镜下是细长的杆状细菌，有的稍有弯曲，菌株宽在0.3μm左右，长度在0.5～0.9μm之间，s2-2在45k倍数下看到正在分裂的细长杆状菌体，稍有弯曲(红色箭头)。

(2)菌株s2-2的生化特征测定

观察菌株在不同含碳、含氮化合物培养基中的生长状况，以及菌株对不同碳源、氮源的分解利用情况及其代谢产产物，本试验使用新型生化鉴定管(环凯微生物，070060新型生化鉴定管)进行生化鉴定。

如表4所示，s2-2可以发酵葡糖糖产气，但是无法利用代谢蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖和肌醇4种糖源，在赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶生化鉴定中，s2-2对照管与试验管均变为蓝绿色，该现象可能是菌株在生长过程中产生某种碱性物质而导致。

表4

2、分子生物学鉴定

(1)菌株s2-2基因测序

分离得到的菌株在lb肉汤培养基中培养36～48h，生长较为旺盛，本试验采取水提法抽提拟降解菌dna，具体提取步骤如下：

吸取1.5ml菌液于离心管中，1200rpm/min离心5min，弃上清液，加入无菌水1ml震荡混匀后再次离心清洗，重复以上操作2次；

2次清洗结束后，弃上清，加入100μl无菌水震荡混匀，沸水浴10min，再冰浴5min，再次离心，上清液即溶出的细菌dna，将dna送广州生工生物科技有限公司测序，并将测定得到的部分序列与genebank数据中进行同源性比较。

(2)鉴定结果

s2-2的16srdna的核苷酸序列如seqidno:1所示，s2-2与nz_cp009553.3(pandoraeapnomenusastraindsm16536)同源性高达99.09％，可以认为同属潘多拉菌属，因此本发明筛选获得的降解菌鉴定为潘多拉菌(pandoraeapnomenusa)。

该菌株已于2020年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，菌种保藏号为gdmccno：61284，分类命名为pandoraeapnomenusas2-2，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

实施例3ps2-2对pcb3(4-氯联苯)降解体系的验证

(1)试剂

试验所用无机盐培养基为mm30无机盐液体培养基，pcb3(4-氯联苯)单品标准品。

(2)pcb3(4-氯联苯)降解验证体系

降解验证实验发生于体积为50ml的黑盖广口螺纹三角瓶中，反应体积为5ml。本降解试验设置pcb3为5个浓度梯度，分别为c1(5mg/l)、c2(10mg/l)、c3(20mg/l)、c4(40mg/l)和c5(60mg/l)，首先在降解体系中加入mm30无机盐液体培养基，再加入pcb3母液，待溶剂挥发完毕后以10％的接种量加入已制备好的降解菌菌液，于30℃，180rpm转速摇床培养，分别在接种后0、24、48、72、96h检测其pcb3的残留量，验证并观察其降解效果。

(3)pcbs定量检测

pcbs疏水性极强，难溶于水等极性溶液，而易溶于有机溶剂。所以降解体系溶液中pcbs的提取至关重要，为充分提取体系中的pcbs，本试验检测前加入破乳剂进行处理：

向降解体系中加入2ml已除水的正己烷，加入2g(nh4)2so4做为破乳剂，涡旋震荡1min后，于120×g转速下离心2min，尽可能萃取到溶液体系中的多氯联苯；

取出玻璃瓶，用干燥的玻璃滴管将上层有机相转移至干燥的玻璃离心管中，再向原玻璃瓶中加入1ml正己烷，重复上述震荡、离心步骤，将上层液体转移至玻璃离心管中；

加入少量无水硫酸钠干燥出去水分，用干燥玻璃滴管吸取上层液体转移到新的干燥玻璃离心管中，吸取适量于进样小瓶中，4℃保存，准备gc-uecd上样。

本试验通过外标法直接比较进行多氯联苯的定量检测。单位色谱峰面积代表的底物物质的量不同，数据处理时通过比较降解体系样品色谱图峰面积与标准品峰面积，根据二者峰面积比，结合已知标准品pcb3标准品浓度，进而计算出降解体系液体中pcb3的浓度，计算公式如下：

apcb3：为降解体系中添加的pcb3的峰面积；

apcb3标准：为购买的pcb3标准品的峰面积；

cpcb3标准：pcb3标准品的浓度(10ng/μl)。

(4)s2-2对pcb3(4-氯联苯)的降解能力

图5和表5为不同降解时期pcbs的残留量，可以看出，s2-2菌株在c1(5mg/l)、c2(10mg/l)、c3(20mg/l)、c4(40mg/l)和c5(60mg/l)五组pcb3(4-氯联苯)浓度下，降解率分别为98.23％、98.85％、99.65％、99.71％和99.75％，菌株s2-2在24h后，只有c5组残留率较高接近40％，其与4组均低于10％，48h后c5组残留量骤降，与c3、c4组残留率接近均低于1％，而c1组24～48h内只有少量降解，残留率还停留在6％左右，从72h后所有浓度组降解残留量均较为接近，且c5组达到最低，最终5个浓度组降解率在1％左右，c3、c4和c5三个组pcbs残留量低于0.35％。

表5s2-2降解体系中pcbs不同时期的残余浓度

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广东海洋大学

<120>一株潘多拉菌pandoraeapnomenusas2-2菌株及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1452

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

gcggggggcatgccttacacatgcagtcgaacggcagcacgggtgcttgcacctggtggc60

gagtggcgaacgggtgagtaatacatcggaacgtaccttgtagtgggggatagctcggcg120

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