1.本公开涉及微生物降解抗生素残留技术领域，具体地，涉及一种固定化菌藻微球及其制备方法。
背景技术：2.磺胺类抗生素是含对氨基苯磺酞胺结构的抗生素，由于其具有化学性质稳定、使用简便、抗菌谱广等特点，目前不仅作为人用药物，也被广泛应用于畜牧业、兽医临床等领域。该类药物使用后，在动物肉、奶、蛋等食品中的残留严重甚至威胁人体健康，能引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性。
3.目前，利用微生物降解去除环境中的抗生素越来越受到环境工作者的广泛关注，成为生物去除方法的主要研究热点之一。许多国家的科技工作者都开展了磺胺类抗生素高效降解菌的分离和鉴定工作，枯草芽孢杆菌、木糖氧化无色杆菌、草酸青霉菌、桔青霉菌、米曲霉菌等都被证明具有磺胺类抗生素的降解功能。但是，目前生物处理法降解磺胺类抗生素最大的弊端是会产生耐药性菌和超级细菌，这些细菌如果不经处理流入环境中，会使人类降低甚至丧失对抗生素的敏感性，清除这些降解菌成为一个难题。
4.因此，亟需开发一种快速、高效、环保的磺胺类抗生素降解方法，以获得最大程度的磺胺类抗生素降解效果，在抗生素生物降解理论与方法的研究上具有重要的科学意义与应用前景。
技术实现要素：5.本公开提供了一种固定化菌藻微球及其制备方法，该菌藻微球可以快速、高效去除环境中的磺胺类抗生素。
6.为了实现上述目的，本公开第一方面提供了一种固定化菌藻微球，所述微球中含有枯草芽孢杆菌、微藻、载体和交联剂；所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为cgmcc no.12317；所述载体为海藻酸钠和明胶，所述交联剂为氯化钙溶液。
7.本公开第二方面提供了一种第一方面所述的固定化菌藻微球的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：
8.s1、将枯草芽孢杆菌接种到愈创木酚固体培养基中，平板培养后转入lb固体培养基中进行恒温震荡培养至对数期，得到菌液，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为cgmcc no.12317；
9.s2、将微藻接种至tap培养基中培养至对数期，得到微藻培养液；
10.s3、将海藻酸钠、明胶和水混合，得到载体溶液；
11.s4、所述菌液和所述微藻培养液混合均匀，得到混合菌藻溶液；将混合菌藻溶液加入到所述载体溶液中，混合均匀后滴定至氯化钙溶液中进行交联，然后进行清洗，得到固定化菌藻微球。
12.本公开第三方面提供了第一方面所述的固定化菌藻微球在去除环境中的磺胺类
抗生素中的应用。
13.本公开第四方面提供了保藏编号为cgmcc no.12317的枯草芽孢杆菌在去除环境中的磺胺类抗生素中的应用。
14.本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
15.附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
16.图1是菌藻体系对磺胺类抗生素降解菌的机理。
具体实施方式
17.以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
18.一方面，本公开提供了一种固定化菌藻微球，所述微球中含有枯草芽孢杆菌、微藻、载体和交联剂；所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为cgmcc no.12317；所述载体为海藻酸钠和明胶，所述交联剂为氯化钙溶液。
19.根据本公开，其中，以微球总质量为基准，所述枯草芽孢杆菌的含量为10
8-109cfu/g，所述微藻的含量为1.2-1.5重量％，所述海藻酸钠的含量为3-4重量％，所述明胶的含量为1-1.2重量％，所述氯化钙的含量为0.9-2重量％。
20.根据本公开，其中，所述微藻和所述枯草芽孢杆菌的生物量比为1：1.5-2.5。
21.所述微藻和所述枯草芽孢杆菌的相对生物量以od值表示，所述微藻的od值按照公式计算(104/ml)＝1557od
680-34.176，所述枯草芽孢杆菌的od值按照公式计算(109/ml)＝34.041od
600-0.1227。
22.根据本公开，其中，所述微藻为小球藻(gy-h4 chlorella sp.)、羊角月藻(gy-d33,selenastrum capricornutum)和斜生栅藻(gy-d13,scendesmus obliquus)中的至少一种。
23.另一方面，本公开提供了第一方面所述的固定化菌藻微球的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：
24.s1、将枯草芽孢杆菌接种到愈创木酚固体培养基中，平板培养后转入lb固体培养基中进行恒温震荡培养至对数期，得到菌液，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为cgmcc no.12317；
25.s2、将微藻接种至tap培养基中培养至对数期，得到微藻培养液；
26.s3、将海藻酸钠、明胶和水混合，得到载体溶液；
27.s4、将所述菌液和所述微藻培养液混合均匀，得到混合菌藻溶液；将混合菌藻溶液加入到所述载体溶液中，混合均匀后滴定至氯化钙溶液中进行交联，然后进行清洗，得到固定化菌藻微球。
28.根据本公开，其中，所述菌液的浓度为1.0
×
10
8-1.0
×
109cfu/ml；所述微藻培养液的浓度为6.0
×
10
7-8.0
×
107cfu/ml；所述载体溶液中海藻酸钠的浓度为0.03-0.05g/ml，所述明胶的浓度为0.01-0.012g/ml；所述氯化钙溶液的浓度为0.009-0.02g/ml。
29.根据本公开，其中，所述愈创木酚培养基，其成分包括：牛肉膏、蛋白胨、nacl、cuso4、愈创木酚和琼脂；所述lb固体培养基，其成分包括：胰蛋白胨、酵母粉、nacl和琼脂；所述tap培养基，其成分包括h2nc(ch2oh)3、nh4cl、mgso4、cacl2、k2hpo4、kh2po4、na2edta、znso4、h3bo3、mncl2、feso4、cocl2、cuso4、(nh4)6mo7o
24
和ch3cooh。
30.根据本公开，其中，所述愈创木酚固体培养基中牛肉膏的浓度为4-6g/l，蛋白胨的浓度为9-11g/l，nacl的浓度为4-6g/l，cuso4的浓度为0.030-0.034g/l，愈创木酚的浓度为0.3-0.5g/l，琼脂的浓度为19-21g/l；所述lb固体培养基中胰蛋白胨的浓度为9-11g/l，酵母粉的浓度为4-6g/l，nacl的浓度为9-11g/l，琼脂的浓度为19-21g/l；所述tap培养基浓度为h2nc(ch2oh)3的浓度为2.0
×
10-2
mol/l，nh4cl的浓度为7.0
×
10-3
mol/l，mgso4的浓度为8.30
×
10-4
mol/l，cacl2的浓度为4.50
×
10-4
mol/l，k2hpo4的浓度为1.65
×
10-3
mol/l，kh2po4的浓度为1.05
×
10-3
mol/l，na2edta的浓度为1.34
×
10-4
mol/l，znso4的浓度为1.36
×
10-4
mol/l，h3bo3的浓度为1.84
×
10-4
mol/l，mncl2的浓度为4.00
×
10-5
mol/l，feso4的浓度为3.29
×
10-5
mol/l，cocl2的浓度为1.23
×
10-5
mol/l，cuso4的浓度为1.00
×
10-5
mol/l，(nh4)6mo7o
24
的浓度为9.28
×
10-7
mol/l，ch3cooh的浓度为1.67
×
10-2
mol/l。
31.再一方面，本公开提供了第一方面所述的固定化菌藻微球在去除环境中的磺胺类抗生素中的应用。
32.再一方面，本公开提供了保藏编号为cgmcc no.12317的枯草芽孢杆菌在去除环境中的磺胺类抗生素中的应用。
33.下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
34.实施例1
35.1.磺胺类抗生素降解菌株的筛选及其酶活性研究
36.1.1菌株的筛选
37.1.1.1培养基成分配方
38.富集培养基成分：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl 5g/l，不同浓度的盐酸；lb固体培养基成分：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，琼脂20g/l；0.04％愈创木酚固体培养基成分：牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 5g/l，cuso
4 0.032g/l，愈创木酚0.4g/l，琼脂20g/l；无机培养基成分：nacl 1.0g/l，k2hpo
4 0.5g/l，kh2po
4 0.5g/l，mgso
4 0.2g/l。
39.1.1.2磺胺类抗生素降解菌株的筛选
40.取cgmcc no.12316的地衣芽孢杆菌、cgmcc no.12317的枯草芽孢杆菌、cgmcc no.12318的枯草芽孢杆菌的菌液各1ml，分别添加到250ml的三角瓶中，然后添加100ml磺胺类抗生素含量为200mg/l的液体富集培养基中，30℃，150r/min摇床黑暗培养3d，得菌液ⅰ；菌液ⅰ取0.1ml涂布于lb平板上培养24h后观察菌落生长情况，确定在磺胺类抗生素含量为200mg/l的液体富集培养基中有菌存在；观察平板上菌落生长，取菌液ⅰ5ml添加到100ml磺胺类抗生素含量为400mg/l的液体富集培养基中，30℃，150r/min摇床黑暗培养3d，得菌液ⅱ；菌液ⅱ稀释到适当的浓度在板上涂板培养24h后观察菌落生长，然后取菌液ⅱ5ml添加到100ml磺胺类抗生素含量为600mg/l的液体富集培养基中30℃，150r/min摇床黑暗培养3d，得菌液ⅲ；依此方法使磺胺类抗生素浓度逐步上升即分别为200mg/l、400mg/l、600mg/l、800mg/l、1000mg/l、1200mg/l、1400mg/l、1600mg/l、1800mg/l、2000mg/l以获得耐高浓度磺胺类抗生素菌株；将2000mg/l富集培养基稀释到合适的浓度，取0.1ml液体涂布在lb固体
培养基上，挑取单菌落并划线纯化，证明cgmcc no.12317的地衣芽孢杆菌可以在高浓度磺胺类抗生素下存活，而cgmcc no.12316的地衣芽孢杆菌和cgmcc no.12318的枯草芽孢杆菌无法在高浓度磺胺类抗生素条件下存活。
41.1.2产漆酶菌株的筛选及检测
42.配置含有0.04％愈创木酚固体培养基；将cgmcc no.12316的地衣芽孢杆菌、cgmcc no.12317的枯草芽孢杆菌、cgmcc no.12318的枯草芽孢杆菌的菌株接种在0.04％愈创木酚固体培养基中，于30℃培养3d，观察菌落是否出现红色显色圈，出现显色的菌株有cgmcc no.12316的地衣芽孢杆菌、cgmcc no.12317的枯草芽孢杆菌，而cgmcc no.12318的枯草芽孢杆菌不出现显色。
43.将同时培养4d的固体平板中的细菌cgmcc no.12316的地衣芽孢杆菌、cgmcc no.12317的枯草芽孢杆菌、cgmcc no.12318的枯草芽孢杆菌的菌株刮置无菌水中，加入相应体积的0.6mol/l abts(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸)，0.1mol/l柠檬酸溶液，0.2mol/l磷酸二氢钠溶，36℃水浴5min，观察是否有颜色变化。愈创木酚平板培养，显色的菌株有cgmcc no.12316的地衣芽孢杆菌和cgmcc no.12317的枯草芽孢杆菌；细菌产漆酶检测，其中cgmcc no.12317的枯草芽孢杆菌是既具有磺胺类抗生素降解功能并同时可以产漆酶的菌株。
44.2、光密度与藻类相关指标的对应关系
45.2.1建立微藻的生长曲线
46.建立小球藻、羊角月藻、斜生栅藻三种藻的生长曲线。确定三种藻类生长周期包括适应期、对数增长期、稳定期、衰亡期。对数增长期的藻类生长速率最快、代谢旺盛、酶系活跃、活藻类细胞数和总体藻类细胞数大致接近、细胞的化学组成形态理化性质也基本一致，选择进入对数生长期20小时后的藻类用于制备菌藻微球。
47.2.2建立光密度与藻细胞浓度的关系
48.将培养至稳定期的藻类细胞稀释成不同倍数，并通过血球计数板在显微镜下统计藻密度，其对应的藻细胞光密度值的测定采用紫外分光光度法，从而建立藻密度与光密度之间的线性关系。光密度值的波长由紫外分光光度计进行光谱扫描，选取波峰位置最高为最优波长。在可见光范围内，三种藻的吸光度均在675nm处有明显的吸收波峰，且相对稳定，最终选定675nm为测定3种藻类生物量的最佳吸收波长。随着藻细胞增加，光密度值相应变大，3种藻细胞的光密度值与其生物量呈显著正线性相关关系(r2》0.99)，说明可以用光密度值来表达对应的藻生物量，即(104/ml)＝1557od
680-34.176
49.2.3cgmcc no.12317的枯草芽孢杆菌的生长曲线的建立
50.将少量cgmcc no.12317的枯草芽孢杆菌接种到一定体积的、适宜的新鲜lb液体培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量，随着菌株浓度增加，光密度值相应变大，说明可以用光密度值来表达对应的枯草芽孢杆菌生物量，即(109/ml)＝34.041od
600-0.1227。
51.3、固定化体系的构建
52.称取4g海藻酸钠和1g明胶放置于有100ml蒸馏水的烧杯中，封口膜封口，121℃，30min灭菌；交联溶液(1％氯化钙)：称取5g氯化钙放置于有500ml蒸馏水大容量烧杯中，121℃，30min；将海藻酸钠明胶溶液放在36℃水浴锅。其中，小球藻按照公式计算(万/ml)＝
1557od680-34.176添加；菌液是枯草芽孢杆菌株在平板培养后刮至无菌蒸馏水，摇至均匀，测定od值后，按照公式(109/m l)＝34.041od600-0.1227添加；以数量级为1：2的小球藻和菌液比例。搅拌均匀，滴定至冷却后的氯化钙溶液中，期间轻微摇动，避免小球粘连；滴定完成后，小球固定24小时后，用无菌水在超净台中清洗。
53.4、利用固定化体系降解磺胺类抗生素的方法
54.向无机培养基(47.5ml)中加入2.5ml磺胺类抗生素溶液(1mg/ml)和固定好的菌藻微球；将培养基放在30℃，180r/min，在光照情况下培养，0d，2d，4d，6d，8d取样，测磺胺类抗生素降解量。
55.实施例2
56.1、羊角月藻(gy-d33,selenastrum capricornutum)固定化体系的构建
57.称取4g海藻酸钠和1g明胶放置于有100ml蒸馏水的烧杯中，封口膜封口，121℃，30min灭菌；交联溶液(1％氯化钙)：称取5g氯化钙放置于有500ml蒸馏水大容量烧杯中，121℃，30min；将海藻酸钠明胶溶液放在36℃水浴锅。其中，羊角月藻按照公式计算(万/ml)＝1557od
680-34.176添加；菌液是地衣芽孢杆菌株在平板培养后刮至无菌蒸馏水，摇至均匀，测定od值后，按照公式(109/ml)＝34.041od
600-0.1227添加；以数量级为1：2的羊角月藻和菌液比例。搅拌均匀，滴定至冷却后的氯化钙溶液中，期间轻微摇动，避免小球粘连；滴定完成后，小球固定24小时后，用无菌水在超净台中清洗。
58.2、利用固定化体系降解磺胺类抗生素
59.向无机培养基(47.5ml)中加入2.5ml磺胺类抗生素溶液(1mg/ml)和固定好的菌藻微球；将培养基放在30℃，180r/min，在光照情况下培养，在0d，2d，4d，6d，8d取样，测磺胺类抗生素降解率，结果如表1所示。
60.实施例3
61.1、斜生栅藻(gy-d13,scendesmus obliquus)固定化体系的构建
62.称取4g海藻酸钠和1g明胶放置于有100ml蒸馏水的烧杯中，封口膜封口，121℃，30min灭菌；交联溶液(1％氯化钙)：称取5g氯化钙放置于有500ml蒸馏水大容量烧杯中，121℃，30min；将海藻酸钠明胶溶液放在36℃水浴锅。其中，斜生栅藻按照公式计算(万/ml)＝1557od
680-34.176添加；菌液是地衣芽孢杆菌株在平板培养后刮至无菌蒸馏水，摇至均匀，测定od值后，按照公式(109/ml)＝34.041od
600-0.1227添加；以数量级为1：2的斜生栅藻和菌液比例。搅拌均匀，滴定至冷却后的氯化钙溶液中，期间轻微摇动，避免小球粘连；滴定完成后，小球固定24小时后，用无菌水在超净台中清洗。
63.2、利用固定化体系降解磺胺类抗生素
64.向无机培养基(47.5ml)中加入2.5ml磺胺类抗生素溶液(1mg/ml)和固定好的菌藻微球；将培养基放在30℃，180r/min，在光照情况下培养，在0d，2d，4d，6d，8d取样，测磺胺类抗生素降解率，结果如表1所示。
65.对比例1
66.按照实施例1的方法制备菌藻微球，唯一不同的是本实验中采用的菌株为枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌的保藏编号为cgmcc no.12318。向无机培养基(47.5ml)中加入2.5ml磺胺类抗生素溶液(1mg/ml)和固定好的菌藻微球；将培养基放在30℃，180r/min，在光照情况下培养，在0d，2d，4d，6d，8d取样，将每个样品稀释10倍后，测磺胺类抗生素降解
量。
[0067] 0d2d4d6d8d实施例1024.5％58.1％73.3％95.1％实施例2022.5％57.0％70.5％92.9％实施例3023.4％57.6％72.4％94.1％对比例100.9％14.8％28.3％35.2％
[0068]
结果表明，本公开中制备的固定化复合体系可以快速降低污染水体中的磺胺类抗生素浓度，8天可以将50ppm浓度的磺胺类抗生素降低百分之八十以上，该复合体系可以达到快速去除水体中磺胺类抗生素污染的目的。
[0069]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0070]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0071]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。