二重荧光LAMP区分马立克氏病病毒和网状内皮增生症病毒检测试剂盒及其引物组的制作方法

二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和网状内皮增生症病毒检测试剂盒及其引物组
技术领域
1.本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和网状内皮增生症病毒检测试剂盒及其引物组。


背景技术：

2.马立克氏病(marek's disease,md)是由马立克氏病病毒(marek's disease virus,mdv)引起的以感染鸡、火鸡为主的一种致肿瘤的传染病。网状内皮增生症(reticuloendotheliosis,re)是由网状内皮增生症病毒(reticuloendotheliosis virus，rev)感染禽类的致肿瘤的传染病。这两种病毒不仅引起禽类发生肿瘤，雏禽感染后还能导致后期免疫抑制，其产生的肿瘤凭肉眼难以辨别，并且常常发生混合感染，需要通过实验室手段进行鉴别诊断。目前可以通过检测这两种病毒的基因对mdv和rev进行鉴别诊断。rev为逆转录病毒，在感染过程中将自身rna逆转录为cdna插入宿主dna中，因此检测rev可跳过反转录步骤直接检测其插入到宿主中的dna。
3.传统的检测方法需要使用昂贵的仪器和试剂等。环介导等温扩增技术(loop
‑
mediated isothermal amplimeqication，lamp)是由notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术，该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点，在一些病原微生物的检测中已被广泛运用。在传统的lamp检测方法中，创新性地加入一条fd探针与f1c反向互补，分别在两条引物上标记荧光基团和淬灭基团，反应时随着lamp扩增时的链置换作用被置换下来，探针发出荧光。
4.经查，国内外均未见有建立二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和网状内皮增生症病毒可视化检测试剂盒和方法的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、快速简便的二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和网状内皮增生症病毒检测试剂盒及其引物组。
6.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
7.二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和网状内皮增生症病毒检测引物组，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.14的碱基序列。
8.引物7和引物14为探针，引物7与引物1反向互补，引物7在3’端标记5
‑
fam荧光基团，引物1在5’端标记淬灭基团bhq
‑
1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记cy5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团bhq
‑
3。
9.引物1至引物14的摩尔比为8:8:1:1:4:4:4:8:8:1:1:4:4:4。
10.上述检测引物组在环介导等温扩增中的应用。
11.环介导等温扩增的条件为66℃反应60min，80℃作用5min灭活。
12.二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和网状内皮增生症病毒检测试剂盒，包括引物
1至引物14，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.14的碱基序列。
13.引物7和引物14为探针，引物7与引物1互补，引物7在3’端标记5
‑
fam荧光基团,引物1在5’端标记淬灭基团bhq
‑
1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记cy5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团bhq
‑
3。
14.上述检测试剂盒，还包括以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、bst dna聚合酶、dntps、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、mncl2。
15.引物1至引物14在环介导等温扩增反应体系中的终浓度分别为1.6μmol/l、1.6μmol/l、0.2μmol/l、0.2μmol/l、0.8μmol/l、0.8μmol/l、0.8μmol/l、1.6μmol/l、1.6μmol/l、0.2μmol/l、0.2μmol/l、0.8μmol/l、0.8μmol/l和0.8μmol/l。
16.针对目前mdv和rev检测存在的问题，发明人分别根据mdv meq基因和rev gp90基因的保守序列的6个特异区域设计了二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和网状内皮增生症病毒检测引物组，包括引物1至引物14，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.14的碱基序列，其中引物7和引物14为探针，引物7与引物1反向互补，引物7在3’端标记5
‑
fam荧光基团,引物1在5’端标记淬灭基团bhq
‑
1，引物14与引物8反向互补，引物14在3’端标记cy5荧光基团，引物8在5’端标记淬灭基团bhq
‑
3。反应过程中，由于lamp反应的链置换作用，引物7与引物1，引物14与引物8随着反应进行分开，引物7和引物14被置换下来，荧光基团和淬灭基团分开，在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光(引物7发出绿色荧光；引物14发出红色荧光)，从而实现快速敏感特异的鉴别mdv和rev。
17.据此，通过优化反应体系和条件，发明人还研制了相应试剂盒并建立相应二重荧光lamp方法。该法只需要在66℃的水浴锅中反应60分钟即可完成，能特异的检测mdv和rev，反应后，发出绿色荧光的为mdv，发出红色荧光的为rev，若样品中同时存在mdv和rev，则为黄色荧光。试验证实，本发明检测灵敏度非常高，每个反应体系能检测到100拷贝的mdv和rev dna样品。
18.本发明需要用2套引物，即可扩增mdv meq基因和rev gp90基因，并通过fd探针与f1c引物反向互补，反应过程中，由于lamp反应的链置换作用，引物7与引物1，引物14与引物8随着反应进行分开，引物7和引物14被置换下来，荧光基团和淬灭基团分开，在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光。反应只需要在一个反应管中进行反应，就可以根据反应后在荧光核酸成像仪下的颜色进行读取结果。且通过探针杂合的方法，特异性更高，不受非特异性扩增的影响，也不受引物二聚体扩增的影响。
19.总之，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅和荧光成像仪，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。
附图说明
20.图1是本发明lamp方法检测mdv和rev的特异性结果图，图中：a为浊度仪观测的lamp特异性试验扩增曲线，b为荧光成像仪观测的lamp特异性试验扩增结果；其中1为rev，2为mdv，3为mdv和rev混合，4为j亚群禽白血病病毒，5为禽呼肠孤病毒，6为传染性法氏囊炎病毒，7为鸡传染性贫血病毒，8为阴性对照(水)。
21.图2是本发明lamp方法检测mdv和rev的敏感性结果图，图中：a为浊度仪观测的
lamp扩增敏感性试验扩增曲线，mdv和rev的模板1:1等量加入反应(浓度为总浓度)，其中1为各107拷贝，2为各106拷贝，3为各105拷贝，4为各104拷贝，5为各103拷贝，6为各102拷贝，7为各10拷贝，8为阴性对照(水)。b为荧光成像仪观测的lamp扩增敏感性试验扩增结果，第一排为mdv，第二排为rev，其中1为107拷贝，2为106拷贝，3为105拷贝，4为104拷贝，5为103拷贝，6为102拷贝，7为10拷贝，8为阴性对照(水)；第三排为mdv和rev 1:1等量(浓度为总浓度)，其中1为各107拷贝，2为各106拷贝，3为各105拷贝，4为各104拷贝，5为各103拷贝，6为各102拷贝，7为各10拷贝，8为阴性对照(水)。
22.图3是本发明lamp方法随机检测临床分离mdv和rev的结果图，图中：1
‑
7为随机检测的7份样品，8为阴性对照。
具体实施方式
23.下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中：
24.bst dna聚合酶(全长)购自new england biolabs公司。viral dna/rna kit购自北京全式金生物。
25.mdv，rev，j亚群禽白血病病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒等均为已知病毒，这些病毒为自留存，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
26.实施例1、引物的设计
27.根据genbank中mdv的meq基因序列和rev的gp90基因序列，使用在线软件primer explorer v4(http：//primerexplorer.jp/e/v4
‑
manual/index.html)设计lamp引物。引物由广州invitrogen公司合成，其具体序列见表1。
28.表1 lamp引物序列
[0029][0030]
实施例2、引物在二重荧光lamp区分马立克氏病病毒和网状内皮增生症病毒的应用
[0031]
一、核酸的提取
[0032]
参照viral dna/rna kit dna/rna共提试剂盒说明书，提取mdv，rev,j亚群禽白血病病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒基因组dna和rna。
[0033]
二、优化lamp反应体系、反应条件和试剂盒的构建
[0034]
25μl lamp反应体系：1
‑
4μl dntps(10mmol/l，终浓度为0.4mmol/l
‑
1.6mmol/l)、2.5μl 10
×
bst bumeqmeqer、1μl bst dna聚合酶8u(终浓度为320u/l)、4
‑
7μl甜菜碱betaine(5mmol/l，终浓度为0.8mmol/l
‑
1.4mmol/l)、2
‑
9μl mgso4(25mmol/l，终浓度为2mmol/l
‑
9mmol/l)、1μl引物(mdv
‑
fip 40μmol/l、mdv
‑
bip 40μmol/l、mdv
‑
f3 5μmol/l、mdv
‑
b3 5μmol/l、mdv
‑
lf 20μmol/l、mdv
‑
lb20μmol/l、mdv
‑
fd 20μmol/l、rev
‑
fip 40μmol/l、rev
‑
bip 40μmol/l、rev
‑
f3 5μmol/l、rev
‑
b3 5μmol/l、rev
‑
lf 20μmol/l、rev
‑
lb20μmol/l、rev
‑
fd 20μmol/l)；终浓度为mdv
‑
fip 1.6μmol/l、mdv
‑
bip 1.6μmol/l、mdv
‑
f3 0.2μmol/l、mdv
‑
b3 0.2μmol/l、mdv
‑
lf 0.8μmol/l、mdv
‑
lb 0.8μmol/l、mdv
‑
fd 0.8μmol/l、rev
‑
fip 1.6μmol/l、rev
‑
bip 1.6μmol/l、rev
‑
f3 0.2μmol/l、rev
‑
b3 0.2μmol/l、rev
‑
lf 0.8μmol/l、rev
‑
lb 0.8μmol/l、rev
‑
fd 0.8μmol/l和1μl模板(mdv的基因组dna)，加水至25μl。mdv
‑
fip和mdv
‑
fd，rev
‑
fip和rev
‑
fd反应前先按上述比例混合加热到85℃5min然后缓
慢降到室温。
[0035]
反应条件：温度按60℃、62℃、64℃、66℃、68℃依次递增反应60min，80℃作用5min灭活。
[0036]
分别按照上述的反应体系和反应条件进行摸索，获得下述的最佳反应体系和条件：
[0037]
最佳反应体系如下：25μl lamp反应体系：2μl dntps(10mmol/l，终浓度为0.4mmol/l)、2.5μl 10
×
bst bumeqmeqer、1μl bst dna聚合酶8u(终浓度为320u/l)、5μl甜菜碱betaine(5mmol/l，终浓度为1mmol/l)、3μl mgso4(25mmol/l，终浓度为3mmol/l)、1μl引物(mdv
‑
fip 40μmol/l、mdv
‑
bip 40μmol/l、mdv
‑
f3 5μmol/l、mdv
‑
b3 5μmol/l、mdv
‑
lf 20μmol/l、mdv
‑
lb20μmol/l、mdv
‑
fd 20μmol/l、rev
‑
fip 40μmol/l、rev
‑
bip 40μmol/l、rev
‑
f3 5μmol/l、rev
‑
b3 5μmol/l、rev
‑
lf 20μmol/l、rev
‑
lb20μmol/l、rev
‑
fd 20μmol/l)；终浓度为mdv
‑
fip 1.6μmol/l、mdv
‑
bip 1.6μmol/l、mdv
‑
f3 0.2μmol/l、mdv
‑
b3 0.2μmol/l、mdv
‑
lf 0.8μmol/l、mdv
‑
lb 0.8μmol/l、mdv
‑
fd 0.8μmol/l、rev
‑
fip 1.6μmol/l、rev
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bip 1.6μmol/l、rev
‑
f3 0.2μmol/l、rev
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b3 0.2μmol/l、rev
‑
lf 0.8μmol/l、rev
‑
lb 0.8μmol/l、rev
‑
fd 0.8μmol/l和1μl模板(mdv的基因组dna)，加水至25μl。
[0038]
最佳反应条件：66℃反应60min，80℃作用5min灭活。
[0039]
为便于基层快速检测，可参照上述最佳反应体系装配检测试剂盒，试剂盒包括有关引物和以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、bst dna聚合酶、dntps、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、mncl2。
[0040]
三、特异性检测
[0041]
分别以上述一得到mdv，rev,j亚群禽白血病病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒dna或cdna为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行lamp反应。
[0042]
lamp反应结果的判断：
[0043]
1)使用荧光核酸成像仪：分别使用fam通道和cy5通道成像，若反应产物颜色变为绿色，则说明样品中含有mdv，若反应产物颜色变为红色，则说明样品中含有rev，若反应产物颜色变为黄色，则说明样品中含有mdv和rev，若没荧光显色则说明样品中不含有mdv。
[0044]
结果如图1所示，a图为浊度仪扩增结果，b图为荧光核酸成像仪观察结果。可以看出，a中的1
‑
3有扩增曲线，而禽白血病病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒，和水没有扩增。b中的1呈红色荧光，rev为阳性结果，2呈绿色荧光，mdv为阳性结果，3呈黄色荧光，mdv和rev混合的阳性结果；禽白血病病毒，禽呼肠孤病毒，传染性法氏囊炎病毒，鸡传染性贫血病毒，和水没有荧光，呈阴性结果。
[0045]
四、灵敏度检测
[0046]
将mdv和rev的dna按10倍倍比稀释至107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、10copies/μl和阴性对照(水)为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行lamp反应。
[0047]
结果如图2所示，a图为mdv和rev的浊度仪扩增结果，可以看出1
‑
6有扩增曲线，7
‑
8无扩增曲线。lamp对mdv和rev的dna的最小检测限为102copies。b图为荧光成像仪的检测结果，其中第一排为mdv的敏感性检测结果，可以看出1
‑
6呈绿色荧光，7
‑
8无荧光，对mdv的最
低检测量为102copies。第二排为rev的敏感性检测结果，可以看出1
‑
6呈红色荧光，7
‑
8无荧光，对rev的最低检测量为102copies。第三排为mdv和rev混合的敏感性检测结果，可以看出1
‑
6呈黄色荧光，7
‑
8无荧光，对mdv和rev的最低检测量为102copies。
[0048]
五、对md临床病料的随机检测
[0049]
将临床送检的疑似mdv和rev感染的病料，抽提基因组dna为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行lamp反应。
[0050]
结果如图3所示，4为mdv，2、7为rev，4为mdv和rev混合感染，1、5为阴性，8为阴性对照(水)。