一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法及其应用

本发明属于生物及细胞工程技术领域，涉及一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法及其应用。

背景技术：

多房棘球蚴病又称泡型包虫病(ae)，是一种由多房棘球绦虫的幼虫(多房棘球蚴或泡球蚴)寄生于动物或人体内而致的重要人畜共患寄生虫病。多房棘球蚴早期寄生于中间宿主的肝内，导致局部肝组织病变、增生、纤维化、萎缩、变性和坏死，而临床症状不明显；晚期似肝癌样转移，可转移至肺、脑、乳腺等脏器而被称为“虫癌”，若不及时治疗，10年病死率高达94％，因此泡型包虫病已成为人类致死率最高的慢性感染性疾病之一。泡型包虫病主要分布在北半球，成局部地方性流行趋势，在我国主要分布于新疆、青海、西藏、四川、甘肃和宁夏等西部省区及内蒙古。我国西部牧区野生狐狸、放牧犬和啮齿类动物分布广泛，使得多房棘球绦虫生活史循环链存在复杂性，进一步增加了宿主动物和人传播和感染该病的风险，尤其在一些偏远牧区人群发病率高达10％。

目前主要使用b超、ct、x射线和磁共振(mri)等影像学方法以及酶联免疫吸附实验(elisa)和蛋白质印迹(westernblotting)等免疫学实验对该病进行检测。影像学检查时，ae的一些非典型和体积较小的病灶常与肝癌和肝脓肿等相混淆，而血清学检测则因使用的抗原为粗抗原导致敏感性和特异性较差，常与及其他寄生虫抗原存在交叉反应。

在针对多房棘球蚴病进行的科研工作中，也常常需要能和多房棘球绦虫原头蚴抗原特异性结合的抗体作为研究工具，来确定泡球蚴的定性定位情况。抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体也是进行检测试剂盒研发工作中必不可少的工具。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法及其应用。

1、本发明的目的是提供能分泌抗多房棘球绦虫原头蚴抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

2、本发明的另一目的是提供由上述细胞株分泌的抗多房棘球绦虫原头蚴抗原的特异性单克隆抗体。

3、本发明的另一目的是上述单克隆抗体在多房棘球蚴病诊断和检测上的可能应用。

其技术方案如下：

一种抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、建立细胞株

(1)抗原制备

材料：泡球蚴感染的昆明鼠，培养皿、手术器械、研钵灭菌备用、医用纱布、50ml离心管、5ml离心管、1.5ml离心管、0.9％氯化钠注射液，细胞超声波粉碎仪(宁波新芝jy92-ii)。

步骤：采用泡球蚴感染的昆明鼠颈部脱臼致死。75％乙醇浸泡15min体表消毒。按解剖层次开腹。剪取腹腔内生长良好的泡球蚴组织放入培养皿中加入0.9％氯化钠注射液6ml。用眼科剪小心去除泡球蚴表面的宿主组织和血管，将泡球蚴放入灭菌处理的研钵中。

用研钵杵破碎组织，经医用纱布过滤，去除囊壁和多余杂质。原头蚴过滤进50ml离心管中，加入0.9％氯化钠注射液25ml混匀，自然沉淀去除上清，反复5次，以洗去泡球蚴囊液、囊壁和杂质。取3ml原头蚴装入5ml离心管中，在冰浴条件下，放入超声波细胞破碎仪中600w，超声3s，间隔6s，共超声5min后可见清亮液体。将超声破碎后的悬混液分装进1.5ml离心管内，3500rpm/min，4℃离心10min，收集上清，即为提取的蛋白。用bca蛋白定量试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)测定所获上清蛋白浓度。

(2)免疫小鼠

材料：试验1所准备的原头蚴抗原、选择与所用骨髓瘤细胞同源的balb/c健康雌性小鼠(购自新疆实验动物中心)，鼠龄在6～8周。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(sigma公司)。

步骤：初次免疫：原头蚴抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μl(100μg抗原)/只小鼠，两周后进行第二次免疫。

第二次免疫：取原头蚴抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μl(50μg抗原)/只小鼠，两周后进行第三次免疫。

第三次免疫：取原头蚴抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μl(50μg抗原)/只小鼠。

加强免疫：采上述小鼠尾静脉血离心取血清测效价(用elisa方法检测)，效价达1:80000以上的小鼠融合前三天取原头蚴抗原加强免疫，腹腔注射体积200μl(100μg抗原)/只小鼠。

(3)饲养细胞的制备

材料：balb/c小鼠1只、消毒备用的手术器械、超净工作台，rpmi-1640基础培养液、rpmi-1640完全培养液：rpmi-1640基础培养液40ml加入10ml胎牛血清、100×青霉素-链霉素、100×l-谷氨酰胺(hyclone公司)，50×hat储备液、hat选择培养液：完全培养液49ml加入1ml50倍hat储备液(sigma公司)。

步骤：融合前1d选择一只健康的balb/c鼠安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中，腹部朝上固定于解剖板上。用眼科镊子提起小鼠腹部皮肤，用无菌眼科剪剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露。用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用5ml一次性注射器吸取rpmi-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，反复抽吸几次，用原注射器吸出腹腔内液体，注入15ml离心管中。1000rpm离心5min，弃上清，加入适量hat选择培养液重悬细胞并稀释1×10⁵/ml，放入96孔细胞培养板中，100μl/孔，铺板5块板，放置在37℃，5％co2培养箱中，24h内密切观察细胞生长情况。

(4)骨髓瘤细胞的准备

材料：骨髓瘤细胞(sp2/0细胞)，rpmi-1640基础培养液、rpmi-1640完全培养液：rpmi-1640基础培养液40ml加入10ml胎牛血清、100×青霉素-链霉素、100×l-谷氨酰胺(hyclone公司)，8-氮鸟嘌呤(sigma公司)。

步骤：骨髓瘤细胞选取sp2/0细胞(本实验室液氮冻存)。融合前20～30d，进行sp2/0细胞的复苏。经过8-氮鸟嘌呤(sigma公司)筛选，放入75cm²细胞培养瓶中扩大培养。试验时选取处于对数生长期的、形态良好的、活细胞计数超过95％的骨髓瘤细胞，将其完全吹下，转移到50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，再用rpmi-1640洗涤2次。加rpmi-1640至20ml计数，取2×10⁷个细胞待用。

(5)脾细胞制备

取加强免疫3d后的小鼠一只安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中取出脾脏，去除结缔组织。用rpmi-1640培养液冲洗一次，碾碎，过200目网筛，用10mlrpmi-1640培养液冲洗网筛，制成细胞悬液后转移到50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。加入4℃预冷的0.91％nh4cl，混匀，冰浴静置5min。加入15mlrpmi-1640基础培养液终止nh4cl作用，1000rpm，离心5min，弃上清，再用rpmi-1640基础培养液冲洗2次。用细胞计数器计数，取1×10⁸个脾细胞，悬浮备用。

(6)细胞融合

材料：水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)、离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、滤纸、50ml离心管、5～10mltip头、1ml吸管、细胞计数器(上海医用光学仪器厂)。细胞融合剂peg1500(sigma公司)、rpmi-1640基础培养液、rpmi-1640完全培养液、hat培养液。

步骤：将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例混合在一起，在50ml离心管内用rpmi-1640培养液洗1次，1200rpm离心8min，弃上清。用灭菌滤纸吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。将离心管置于37℃水浴中，90s内加入预热的1ml50％peg溶液，边加边轻晃离心管，静置1min。加预热的rpmi-1640基础培养液，终止peg作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml，边加边轻晃离心管。1000rpm离心10min，弃上清。加适量hat培养液轻轻悬浮细胞。将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔，将培养板置于37℃、5％co2培养箱中培养。

(7)细胞克隆的观察和换液

材料：倒置显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)，rpmi-1640完全培养液，ht选择培养液：49ml完全培养液加入1ml50倍ht储备液(sigma公司)。

步骤：细胞融合后第3d开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、培养液有无污染、饲养细胞的状况。第5开始更换培养液，采用半换液方式，每2～3天换一次hat培养液，观察杂交瘤细胞是否出现。10d后，改用ht培养液，三次克隆后换rpmi-1640完全培养液。

(8)筛选分泌抗体的杂交瘤细胞

在培养后的第8天，按前述细胞克隆的观察结果对5块培养板上所有的有细胞克隆生长的细胞培养孔采用elisa法检测杂交瘤细胞抗体产生的情况。

材料：1)磷酸盐缓冲液(pbs)8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，蒸馏水加至800ml，用1mhcl调ph至7.2，加水到1000ml；2)封闭液(5％脱脂奶粉)：5g脱脂奶粉，蒸馏水加至80ml，充分溶解后，定容到100ml；3)洗涤缓冲液：0.5ml吐温20(tween20)加入到1000ml1×pbs中；4)底物显色a液：1.46g磷酸氢二钠、0.933g柠檬酸、0.75％双氧水0.64ml、蒸馏水加至100ml；5)底物显色b液：tmb(sigma公司)20mg溶于10ml无水乙醇后加90ml水；6)底物显色反应液：底物显色a液，底物显色b液1:1混合；7)终止液(2mh2so4)取浓h2so427.62ml，缓缓加入到473ml的蒸馏水中，混匀即可；8)抗原包被液(0.1m碳酸盐缓冲液)ph9.6：碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93、蒸馏水加至1000ml；9)辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗小鼠igg抗体(sigma公司)；10)酶标仪(tecan公司)设定波长为450nm。

步骤：1)抗原包被：用包被液稀释em-psc抗原至0.2μg/ml，96孔酶标板每孔加入100μl，4℃过夜，次日用pbst洗板3次，每次3min，拍干；2)封闭：用1×pbs配制5％的脱脂乳(封闭液)，每孔加入200μl封闭液，37℃孵育1h，pbst洗板3次，每次3min，拍干；3)加待测样品：无菌条件下取细胞培养板上生长成簇的杂交瘤细胞上清液加入到酶标板中，每孔加入100μl，sp2/0细胞上清液为阴性对照，37℃孵育1h，pbst洗板3次，每次3min，拍干；4)加二抗：将山羊抗小鼠hrp-igg抗体稀释10000倍，100μl/孔，37℃孵育1h，pbst洗板5次，每次3min，拍干；5)显色：加入底物显色反应液，100μl/孔，避光37℃显色10～15min。6)终止：加入终止液，50μl/孔。7)读值：以450nm单波长测定各孔od值。8)判定：以与阴性对照孔od值的比值(p/n)大于2.1作为判断为阳性的临界点。选取阳性孔中高od值孔，对其所对应的细胞培养孔进行细胞的克隆化。

(9)目标杂交瘤细胞的克隆化(采用有限稀释法)

亚克隆前1d制备饲养细胞，制备方法同试验3。将选定的强阳性单个细胞克隆孔中液体吸净，加入新鲜的rpmi-1640基础培养液，反复吹打，将细胞液移至1.5ml离心管内，1000rpm离心5min，进行细胞计数。取四个平皿，将细胞悬液用ht培养基稀释，使其浓度分别为1000个细胞/ml、100个细胞/ml、10个细胞/ml和5个细胞/ml。将1000个细胞/ml和100个细胞/ml分别加入铺好饲养层细胞的96孔板的第1和第2列中，100μl/孔，第1列每孔100个细胞，第2列每孔10个细胞，10个/ml加入第3～7列，100μl/孔，每孔1个细胞，5个/ml加入第8～12列中，100μl/孔，每孔0.5个细胞。置37℃、5％co2细胞培养箱中培养4～5d，用倒置显微镜观察细胞形态，标记96孔板中有细胞的孔及孔内集落个数，每孔补加150μl新鲜的ht培养液。继续培养4～5d后再次观察细胞并标记单克隆细胞孔及孔内集落数。培养至第10～14d，待细胞克隆生长到孔底面积的50％时，即可取上述标记过的杂交瘤细胞孔内的细胞上清进行抗体检测，检测方法同试验8。如此连续克隆化3～4次，直至所有克隆化细胞孔内上清均为阳性时停止，获得了阳性克隆细胞株anti-xjempscag-1c1和anti-xjempscag-1g11。

步骤2、细胞株的扩大培养、冻存及复苏

(1)细胞株的扩大培养

将所获得的阳性细胞从96孔板中取出放入到24孔板中扩大培养，培养液采用完全培养液。

(2)杂交瘤细胞的冻存

材料：细胞冻存液：胎牛血清25ml、rpmi-1640基础培养液20ml、二甲基亚砜5ml混合为细胞冻存液。-80℃冰箱(siemens公司)、液氮、冻存管。

步骤：观察24孔培养板中扩大培养的单克隆杂交瘤细胞，当细胞长满孔底时，选择生长旺盛、形态良好、处于对数生长期的细胞，用完全培养液吹落孔底的细胞，2～3孔收集到离心管中。经3000rpm离心5min，弃上清。加入冻存液制成细胞悬液，分装到冻存管里。标记细胞名称、时间，放入冻存盒内，置于-80℃冰箱，6h后转移至液氮中。

(3)杂交瘤细胞的复苏

细胞株连续传代并定期检测其培养上清，检测方法同实施例1中的试验8，对照传代过程中其分泌能力变化。冻存一个月后自液氮容器中分别各取出一支anti-xjempscag-1c1和anti-xjempscag-1g11细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水的烧杯中，不停摇动使其迅速融化，移至超净工作台，无菌开启冻存管，将细胞悬液悬浮于基础培养液中，1000rpm离心5min洗涤，以5ml完全培养液重悬细胞沉淀，移入细胞培养瓶中，置37℃、5％co2细胞培养箱中培养，验证细胞是否冻存好；同时检测其培养基上清，检测方法同实施例1中的试验8，对照复苏前后分泌能力变化。

步骤3、杂交瘤细胞株抗体亚型测定及染色体核型分析

(1)杂交瘤细胞株抗体亚型测定

材料：piercerapidisotypingkitwithkappaandlambda-mouse试剂盒(sigma公司)、1.5ml离心管。

步骤：取450μl稀释液加入1.5ml高压灭菌过的离心管内，再取50μl细胞上清，混匀。取出piercerapidisotypingkitwithkappaandlambda-mouse试剂盒中的测试板，每个板上滴加150μl稀释好的细胞上清，静置10～15min，观察结果。结果显示，anti-xjempscag-1c1杂交瘤细胞株抗体亚型为igg2b型，轻链为kappa链；anti-xjempscag-1g11杂交瘤细胞株抗体亚型为igg1，轻链为kappa链。

(2)杂交瘤细胞株染色体核型分析

材料：秋水仙素、甲醇、冰醋酸(天津永晟精细化工有限公司)，giemsa染液、中性树胶(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，载玻片、盖玻片，显微镜及成像系统(千欣仪器有限公司)。

步骤：将杂交瘤细胞株在25cm²细胞培养瓶内培养至占瓶底面积80～90％，且细胞形态良好。传代入三个25cm²细胞培养瓶中，放入37℃，5％co2培养箱中培养。18～24h后加入终浓度为0.04μg/ml的秋水仙素，继续培养14h。加入37℃预热的0.075mol/l的氯化钾溶液5ml，混匀，置于37℃恒温水浴锅中水浴30min。加入新鲜配制的固定液1ml，混匀，1000rpm离心10min，弃上清。加入固定液5ml，重悬细胞，室温静置30min后，1000rpm离心10min，弃上清，重复该步骤一次。加入固定液5ml，重悬细胞，密封管口，放置于4℃过夜。次日1000rpm离心10min，视细胞的多少，留下0.5～1ml固定液，重悬细胞。吸取细胞悬液，悬空50～60cm滴在预先于-20℃冰箱冷冻的载玻片上，使其自然扩散，室温干燥。giemsa染色原液按1:10稀释，染片20min。用自来水冲洗染片，干燥，中性树脂封片，烘干。于油镜下选择3个细胞形态完整、单个、染色体分散良好、无重叠的细胞进行观察和染色体计数，求平均染色体数量，并拍照保存。其中anti-xjempscag-1c1杂交瘤细胞株平均染色体个数为91对；anti-xjempscag-1g11杂交瘤细胞株平均染色体个数为86对。

步骤4、单克隆抗体的制备

材料：6～8周balb/c雌性小鼠，液体石蜡，细胞计数板，rpmi-1640基础培养液。

步骤：小鼠致敏：液体石蜡致敏balb/c小鼠，注射体积500μl/只，10天后制备腹水。注射细胞：将处于对数生长期且形态较好的杂交瘤细胞，用新鲜的rpmi-1640基础培养液吹打下来，1000rpm离心5min，弃上清，再用rpmi-1640基础培养液重悬细胞。细胞计数，并将细胞数调至2×10⁶或3×10⁵个，每只小鼠腹腔注射0.5ml。腹水采集：植入细胞后第7d起，每天观察小鼠健康状况与腹部形态，待小鼠腹部有明显膨大，而小鼠濒临死亡之前，收集腹水，3000rpm离心10min，收集上清液，采集到的腹水于-20℃冻存。

本发明所述方法制备的抗体在多房棘球蚴病诊断试剂制备过程中的应用。

本发明所述方法制备的抗体在多房棘球蚴病检测试剂制备过程中的应用。

本发明的有益效果：

本发明为临床和科研机构提供了抗多房棘球绦虫原头蚴抗原的特异性单克隆抗体，它既可用于elisa试验对临床样品进行检测，也可用于免疫组化试验对病理标本进行临床诊断，还可为包虫病研究部门提供便利的研究工具，在多房棘球蚴病的诊断、检测中有广泛的应用价值。

附图说明

图1杂交瘤细胞株的染色体分析对所制备的杂交瘤细胞株在细胞分裂中期进行giemsa染色，显示染色体。a：anti-xjempscag-1c1杂交瘤细胞株平均染色体个数为91对；b：anti-xjempscag-1g11杂交瘤细胞株平均染色体个数为86对，表明两株细胞株均为小鼠骨髓瘤细胞和脾细胞的融合体。

图2杂交瘤细胞株抗体亚型鉴定利用piercerapidisotypingkitwithkappaandlambda-mouse试剂盒(sigma公司)进行单克隆抗体细胞株抗体亚型的鉴定。a：anti-xjempscag-1c1杂交瘤细胞株抗体亚型为igg2b型，轻链为kappa链；b：anti-xjempscag-1g11杂交瘤细胞株抗体亚型为igg1，轻链为kappa链。

图3多房棘球绦虫原头蚴抗原及其他相关虫体抗原的sds-page鉴定其中m：蛋白分子质量标准；1：多房棘球绦虫原头蚴蛋白；2：细粒棘球绦虫原头蚴蛋白；3：脑多头蚴蛋白；4：细颈囊尾蚴蛋白。

图4单克隆抗体westernblotting鉴定制备的单克隆抗体与多房棘球绦虫原头蚴抗原及其他相关虫体抗原反应的westernblotting鉴定。a：anti-xjempscag-1c1杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体与上述抗原反应的westernblotting结果；b：anti-xjempscag-1g11杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体与上述抗原反应的westernblotting结果。其中m：蛋白分子质量标准；1：多房棘球绦虫原头蚴蛋白；2：细粒棘球绦虫原头蚴蛋白；3：脑多头蚴蛋白；4：细颈囊尾蚴蛋白。

图5单克隆抗体elisa检测制备的单克隆抗体与多房棘球绦虫原头蚴抗原及其他相关虫体抗原反应的elisa检测。1～4：anti-xjempscag-1c1杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体与上述抗原反应的elisa结果；5～8：anti-xjempscag-1g11杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体与上述抗原反应的elisa结果；9：sp2/0细胞上清与多房棘球绦虫原头蚴抗原反应的elisa结果；10：pbs与多房棘球绦虫原头蚴抗原反应的elisa结果。其中1、5、9和10列包被不同浓度多房棘球绦虫原头蚴蛋白；2和6列包被不同浓度细粒棘球绦虫原头蚴蛋白；3和7列包被不同浓度脑多头蚴蛋白；4和8列包被不同浓度细颈囊尾蚴蛋白。

图6抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体腹水效价检测单克隆抗体细胞株接种balb/c鼠，获得的腹水经elisa检测，anti-xjempscag-1c1单克隆抗体细胞株效价可达1:640000，anti-xjempscag-1g11单克隆抗体细胞株效价可达1:1280000。

图7免疫组化抗体定位利用上述小鼠体内腹水诱生的单克隆抗体稀释1000倍进行免疫组化试验。a：anti-xjempscag-1c1单克隆抗体与多房棘球绦虫原头蚴反应呈棕色；b：anti-xjempscag-1g11单克隆抗体多房棘球绦虫原头蚴反应呈棕色；c：sp2/0腹水与多房棘球绦虫原头蚴反应不着色。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

本发明通过杂交瘤技术采用balb/c小鼠脾细胞与sp2/0细胞融合建立杂交瘤细胞株。其特征为：由多房棘球绦虫原头蚴抗原免疫刺激后的balb/c小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞株sp2/0细胞融合形成的鼠-鼠杂交瘤细胞，能在体外长期生长和稳定传代，能稳定分泌抗多房棘球绦虫原头蚴抗原的特异性单克隆抗体，其染色体数目及抗体亚型见图1和图2。

本发明由上述细胞通过体外培养法、动物体内诱生腹水法制备单克隆抗体。通过sds-page、westernblotting和elisa检测，发现anti-xjempscag-1c1和anti-xjempscag-1g11单克隆抗体细胞株产生的抗体具有较强的特异性和敏感性(见图3、图4、图5)。anti-xjempscag-1c1抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体细胞株制备的腹水效价可达1:640000，anti-xjempscag-1g11抗多房棘球绦虫原头蚴抗原单克隆抗体细胞株制备的腹水效价可达1:1280000(见图6)。

本发明制备了泡球蚴免疫组化试剂盒。利用上述小鼠体内腹水诱生的单克隆抗体稀释1000倍进行免疫组化试验，其中anti-xjempscag-1c1单克隆抗体与多房棘球绦虫原头蚴反应呈棕色；anti-xjempscag-1g11单克隆抗体与多房棘球绦虫原头蚴反应呈棕色；sp2/0腹水与多房棘球绦虫原头蚴反应不着色(见图7)，说明本单克隆抗体具有较强的特异性。

实施例1-建立细胞株

1.抗原制备

材料：泡球蚴感染的昆明鼠，培养皿、手术器械、研钵灭菌备用、医用纱布、50ml离心管、5ml离心管、1.5ml离心管、0.9％氯化钠注射液，细胞超声波粉碎仪(宁波新芝jy92-ii)。

步骤：采用泡球蚴感染的昆明鼠颈部脱臼致死。75％乙醇浸泡15min体表消毒。按解剖层次开腹。剪取腹腔内生长良好的泡球蚴组织放入培养皿中加入0.9％氯化钠注射液6ml。用眼科剪小心去除泡球蚴表面的宿主组织和血管，将泡球蚴放入灭菌处理的研钵中。

用研钵杵破碎组织，经医用纱布过滤，去除囊壁和多余杂质。原头蚴过滤进50ml离心管中，加入0.9％氯化钠注射液25ml混匀，自然沉淀去除上清，反复5次，以洗去泡球蚴囊液、囊壁和杂质。取3ml原头蚴装入5ml离心管中，在冰浴条件下，放入超声波细胞破碎仪中600w，超声3s，间隔6s，共超声5min后可见清亮液体。将超声破碎后的悬混液分装进1.5ml离心管内，3500rpm/min，4℃离心10min，收集上清，即为提取的蛋白。用bca蛋白定量试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)测定所获上清蛋白浓度。

2.免疫小鼠

材料：试验1所准备的原头蚴抗原、选择与所用骨髓瘤细胞同源的balb/c健康雌性小鼠(购自新疆实验动物中心)，鼠龄在6～8周。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(sigma公司)。

步骤：初次免疫：原头蚴抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μl(100μg抗原)/只小鼠，两周后进行第二次免疫。

第二次免疫：取原头蚴抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μl(50μg抗原)/只小鼠，两周后进行第三次免疫。

第三次免疫：取原头蚴抗原加等体积弗氏不完全佐剂，乳化到滴水不扩散即可，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积200μl(50μg抗原)/只小鼠。

加强免疫：采上述小鼠尾静脉血离心取血清测效价(用elisa方法检测)，效价达1:80000以上的小鼠融合前三天取原头蚴抗原加强免疫，腹腔注射体积200μl(100μg抗原)/只小鼠。

3.饲养细胞的制备

材料：balb/c小鼠1只、消毒备用的手术器械、超净工作台、rpmi-1640基础培养液、rpmi-1640完全培养液：rpmi-1640基础培养液40ml加入10ml胎牛血清、100×青霉素-链霉素、100×l-谷氨酰胺(hyclone公司)，50×hat储备液、hat选择培养液：完全培养液49ml加入1ml50倍hat储备液(sigma公司)。

步骤：融合前1d选择一只健康的balb/c鼠安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中，腹部朝上固定于解剖板上。用眼科镊子提起小鼠腹部皮肤，用无菌眼科剪剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露。用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用5ml一次性注射器吸取rpmi-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，反复抽吸几次，用原注射器吸出腹腔内液体，注入15ml离心管中。1000rpm离心5min，弃上清，加入适量hat选择培养液重悬细胞并稀释1×10⁵/ml，放入96孔细胞培养板中，100μl/孔，铺板5块板，放置在37℃，5％co2培养箱中，24h内密切观察细胞生长情况。

4.骨髓瘤细胞的准备

材料：骨髓瘤细胞(sp2/0细胞)，rpmi-1640基础培养液、rpmi-1640完全培养液：rpmi-1640基础培养液40ml加入10ml胎牛血清、100×青霉素-链霉素、100×l-谷氨酰胺(hyclone公司)，8-氮鸟嘌呤(sigma公司)。

步骤：骨髓瘤细胞选取sp2/0细胞(本实验室液氮冻存)。融合前20～30d，进行sp2/0细胞的复苏。经过8-氮鸟嘌呤(sigma公司)筛选，放入75cm²细胞培养瓶中扩大培养。试验时选取处于对数生长期的、形态良好的、活细胞计数超过95％的骨髓瘤细胞，将其完全吹下，转移到50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，再用rpmi-1640洗涤2次。加rpmi-1640至20ml计数，取2×10⁷个细胞待用。

5.脾细胞制备

取加强免疫3d后的小鼠一只安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中取出脾脏，去除结缔组织。用rpmi-1640培养液冲洗一次，碾碎，过200目网筛，用10mlrpmi-1640培养液冲洗网筛，制成细胞悬液后转移到50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。加入4℃预冷的0.91％nh4cl，混匀，冰浴静置5min。加入15mlrpmi-1640基础培养液终止nh4cl作用，1000rpm，离心5min，弃上清，再用rpmi-1640基础培养液冲洗2次。用细胞计数器计数，取1×10⁸个脾细胞，悬浮备用。

6.细胞融合

材料：水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)、离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、滤纸、50ml离心管、5～10mltip头、1ml吸管、细胞计数器(上海医用光学仪器厂)。细胞融合剂peg1500(sigma公司)、rpmi-1640基础培养液、rpmi-1640完全培养液、hat培养液。

步骤：将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例混合在一起，在50ml离心管内用rpmi-1640培养液洗1次，1200rpm离心8min，弃上清。用灭菌滤纸吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。将离心管置于37℃水浴中，90s内加入预热的1ml50％peg溶液，边加边轻晃离心管，静置1min。加预热的rpmi-1640基础培养液，终止peg作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml，边加边轻晃离心管。1000rpm离心10min，弃上清。加适量hat培养液轻轻悬浮细胞。将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板中，100μl/孔，将培养板置于37℃、5％co2培养箱中培养。

7.细胞克隆的观察和换液

材料：倒置显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)，rpmi-1640完全培养液，ht选择培养液：49ml完全培养液加入1ml50倍ht储备液(sigma公司)。

步骤：细胞融合后第3d开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、培养液有无污染、饲养细胞的状况。第5开始更换培养液，采用半换液方式，每2～3天换一次hat培养液，观察杂交瘤细胞是否出现。10d后，改用ht培养液，三次克隆后换rpmi-1640完全培养液。

8.筛选分泌抗体的杂交瘤细胞

在培养后的第8天，按前述细胞克隆的观察结果对5块培养板上所有的有细胞克隆生长的细胞培养孔采用elisa法检测杂交瘤细胞抗体产生的情况。

材料：1)磷酸盐缓冲液(pbs)8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，蒸馏水加至800ml，用1mhcl调ph至7.2，加水到1000ml；2)封闭液(5％脱脂奶粉)：5g脱脂奶粉，蒸馏水加至80ml，充分溶解后，定容到100ml；3)洗涤缓冲液：0.5ml吐温20(tween20)加入到1000ml1×pbs中；4)底物显色a液：1.46g磷酸氢二钠、0.933g柠檬酸、0.75％双氧水0.64ml、蒸馏水加至100ml；5)底物显色b液：tmb(sigma公司)20mg溶于10ml无水乙醇后加90ml水；6)底物显色反应液：底物显色a液，底物显色b液1:1混合；7)终止液(2mh2so4)取浓h2so427.62ml，缓缓加入到473ml的蒸馏水中，混匀即可；8)抗原包被液(0.1m碳酸盐缓冲液)ph9.6：碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93、蒸馏水加至1000ml；9)辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗小鼠igg抗体(sigma公司)；10)酶标仪(tecan公司)设定波长为450nm。

步骤：1)抗原包被：用包被液稀释em-psc抗原至0.2μg/ml，96孔酶标板每孔加入100μl，4℃过夜，次日用pbst洗板3次，每次3min，拍干；2)封闭：用1×pbs配制5％的脱脂乳(封闭液)，每孔加入200μl封闭液，37℃孵育1h，pbst洗板3次，每次3min，拍干；3)加待测样品：无菌条件下取细胞培养板上生长成簇的杂交瘤细胞上清液加入到酶标板中，每孔加入100μl，sp2/0细胞上清液为阴性对照，37℃孵育1h，pbst洗板3次，每次3min，拍干；4)加二抗：将山羊抗小鼠hrp-igg抗体稀释10000倍，100μl/孔，37℃孵育1h，pbst洗板5次，每次3min，拍干；5)显色：加入底物显色反应液，100μl/孔，避光37℃显色10～15min。6)终止：加入终止液，50μl/孔。7)读值：以450nm单波长测定各孔od值。8)判定：以与阴性对照孔od值的比值(p/n)大于2.1作为判断为阳性的临界点。选取阳性孔中高od值孔，对其所对应的细胞培养孔进行细胞的克隆化。

9.目标杂交瘤细胞的克隆化(采用有限稀释法)

亚克隆前1d制备饲养细胞，制备方法同试验3。将选定的强阳性单个细胞克隆孔中液体吸净，加入新鲜的rpmi-1640基础培养液，反复吹打，将细胞液移至1.5ml离心管内，1000rpm离心5min，进行细胞计数。取四个平皿，将细胞悬液用ht培养基稀释，使其浓度分别为1000个细胞/ml、100个细胞/ml、10个细胞/ml和5个细胞/ml。将1000个细胞/ml和100个细胞/ml分别加入铺好饲养层细胞的96孔板的第1和第2列中，100μl/孔，第1列每孔100个细胞，第2列每孔10个细胞，10个/ml加入第3～7列，100μl/孔，每孔1个细胞，5个/ml加入第8～12列中，100μl/孔，每孔0.5个细胞。置37℃、5％co2细胞培养箱中培养4～5d，用倒置显微镜观察细胞形态，标记96孔板中有细胞的孔及孔内集落个数，每孔补加150μl新鲜的ht培养液。继续培养4～5d后再次观察细胞并标记单克隆细胞孔及孔内集落数。培养至第10～14d，待细胞克隆生长到孔底面积的50％时，即可取上述标记过的杂交瘤细胞孔内的细胞上清进行抗体检测，检测方法同试验8。如此连续克隆化3～4次，直至所有克隆化细胞孔内上清均为阳性时停止，获得了阳性克隆细胞株anti-xjempscag-1c1和anti-xjempscag-1g11。

实施例2-细胞株的扩大培养、冻存及复苏

1.细胞株的扩大培养

将所获得的阳性细胞从96孔板中取出放入到24孔板中扩大培养，培养液采用完全培养液。

2.杂交瘤细胞的冻存

材料：细胞冻存液：胎牛血清25ml、rpmi-1640基础培养液20ml、二甲基亚砜5ml混合为细胞冻存液；-80℃冰箱(siemens公司)、液氮、冻存管。

步骤：观察24孔培养板中扩大培养的单克隆杂交瘤细胞，当细胞长满孔底时，选择生长旺盛、形态良好、处于对数生长期的细胞，用完全培养液吹落孔底的细胞，2～3孔收集到离心管中。经3000rpm离心5min，弃上清。加入冻存液制成细胞悬液，分装到冻存管里。标记细胞名称、时间，放入冻存盒内，置于-80℃冰箱，6h后转移至液氮中。

3.杂交瘤细胞的复苏

细胞株连续传代并定期检测其培养上清，检测方法同实施例1中的试验8，对照传代过程中其分泌能力变化。冻存一个月后自液氮容器中分别各取出一支anti-xjempscag-1c1和anti-xjempscag-1g11细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水的烧杯中，不停摇动使其迅速融化，移至超净工作台，无菌开启冻存管，将细胞悬液悬浮于基础培养液中，1000rpm离心5min洗涤，以5ml完全培养液重悬细胞沉淀，移入细胞培养瓶中，置37℃、5％co2细胞培养箱中培养，验证细胞是否冻存好；同时检测其培养基上清，检测方法同实施例1中的试验8，对照复苏前后分泌能力变化。

实施例3-杂交瘤细胞株抗体亚型测定及染色体核型分析

1.杂交瘤细胞株抗体亚型测定

材料：piercerapidisotypingkitwithkappaandlambda-mouse试剂盒(sigma公司)、1.5ml离心管。

步骤：取450μl稀释液加入1.5ml高压灭菌过的离心管内，再取50μl细胞上清，混匀。取出piercerapidisotypingkitwithkappaandlambda-mouse试剂盒中的测试板，每个板上滴加150μl稀释好的细胞上清，静置10～15min，观察结果。结果显示，anti-xjempscag-1c1杂交瘤细胞株抗体亚型为igg2b型，轻链为kappa链；anti-xjempscag-1g11杂交瘤细胞株抗体亚型为igg1，轻链为kappa链。

2.杂交瘤细胞株染色体核型分析

材料：秋水仙素、甲醇、冰醋酸(天津永晟精细化工有限公司)，giemsa染液、中性树胶(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，载玻片、盖玻片，显微镜及成像系统(千欣仪器有限公司)。

步骤：将杂交瘤细胞株在25cm²细胞培养瓶内培养至占瓶底面积80～90％，且细胞形态良好。传代入三个25cm²细胞培养瓶中，放入37℃，5％co2培养箱中培养。18～24h后加入终浓度为0.04μg/ml的秋水仙素，继续培养14h。加入37℃预热的0.075mol/l的氯化钾溶液5ml，混匀，置于37℃恒温水浴锅中水浴30min。加入新鲜配制的固定液1ml，混匀，1000rpm离心10min，弃上清。加入固定液5ml，重悬细胞，室温静置30min后，1000rpm离心10min，弃上清，重复该步骤一次。加入固定液5ml，重悬细胞，密封管口，放置于4℃过夜。次日1000rpm离心10min，视细胞的多少，留下0.5～1ml固定液，重悬细胞。吸取细胞悬液，悬空50～60cm滴在预先于-20℃冰箱冷冻的载玻片上，使其自然扩散，室温干燥。giemsa染色原液按1:10稀释，染片20min。用自来水冲洗染片，干燥，中性树脂封片，烘干。于油镜下选择3个细胞形态完整、单个、染色体分散良好、无重叠的细胞进行观察和染色体计数，求平均染色体数量，并拍照保存。其中anti-xjempscag-1c1杂交瘤细胞株平均染色体个数为91对；anti-xjempscag-1g11杂交瘤细胞株平均染色体个数为86对。

实施例4-单克隆抗体特异性检测

材料：多房棘球绦虫原头蚴抗原、细粒棘球绦虫原头蚴抗原、脑多头蚴抗原、细颈囊尾蚴抗原、辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗小鼠igg抗体、4-氯-1-萘酚(sigma公司)，酶标仪(tecan公司)设定波长为450nm。

步骤：sds-page和westernblotting检测：1)将多房棘球绦虫原头蚴抗原、细粒棘球绦虫原头蚴抗原、脑多头蚴抗原、细颈囊尾蚴抗原进行sds-page电泳检测；2)转入nc膜；3)封闭：用1×pbs配制5％的脱脂乳(封闭液)，加入装有nc膜的平皿中，4℃孵育过夜，次日用pbst洗膜3次，每次5min；4)加一抗：将1:20稀释的anti-xjempscag-1c1和anti-xjempscag-1g11单克隆抗体细胞株培养上清分别加入装有nc膜的平皿中，37℃孵育1h，pbst洗膜3次，每次5min；5)加二抗：将山羊抗小鼠hrp-igg抗体稀释3000倍加入平皿中，37℃孵育1h，pbst洗膜5次，每次5min；6)显色：加入4-氯-1-萘酚避光显色，出现条带即用蒸馏水终止反应。8)判定：抗体与多房棘球绦虫原头蚴抗原反应，出现特异性条带，与其他虫体抗原不反应。elisa检测：1)抗原包被：用包被液分别将多房棘球绦虫原头蚴抗原、细粒棘球绦虫原头蚴抗原、脑多头蚴抗原、细颈囊尾蚴抗原稀释至20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml，96孔酶标板每孔加入100μl，每种抗原每个浓度做两个平行，4℃过夜，次日用pbst洗板3次，每次3min，拍干；2)封闭：用1×pbs配制5％的脱脂乳(封闭液)，每孔加入200μl封闭液，37℃孵育1h，pbst洗板3次，每次3min，拍干；3)加待测样品：将收集的anti-xjempscag-1c1和anti-xjempscag-1g11单克隆抗体细胞株培养上清各100μl分别加入反应孔中，sp2/0细胞上清为阴性对照，37℃孵育1h，pbst洗5次，每次3min，拍干；4)加二抗：将山羊抗小鼠hrp-igg抗体稀释8000倍，100μl/孔，37℃孵育1h，pbst洗板5次，每次3min，拍干；5)显色：加入tmb底物显色反应液，100μl/孔，室温避光显色10～15min。6)终止：加入终止液，50μl/孔。7)读值：以450nm单波长测定各孔od值。8)判定：检测孔od450值与阴性对照sp2/0细胞上清od450值相比在2倍以上。

实施例5-单克隆抗体的大量制备(腹水制备)

材料：6～8周balb/c雌性小鼠，液体石蜡，细胞计数板，rpmi-1640基础培养液。

步骤：小鼠致敏：液体石蜡致敏balb/c小鼠，注射体积500μl/只，10天后制备腹水。注射细胞：将处于对数生长期且形态较好的杂交瘤细胞，用新鲜的rpmi-1640基础培养液吹打下来，1000rpm离心5min，弃上清，再用rpmi-1640基础培养液重悬细胞。细胞计数，并将细胞数调至2×10⁶或3×10⁵个，每只小鼠腹腔注射0.5ml。腹水采集：植入细胞后第7d起，每天观察小鼠健康状况与腹部形态，待小鼠腹部有明显膨大，而小鼠濒临死亡之前，收集腹水，3000rpm离心10min，收集上清液，采集到的腹水于-20℃冻存。

实施例6-腹水效价检测

材料：同实施例1中的试验8

步骤：1)抗原包被：用包被液稀释em-psc抗原至0.2μg/ml，96孔酶标板每孔加入100μl，4℃过夜，次日用pbst洗板3次，每次3min，拍干；2)封闭：用1×pbs配制5％的脱脂乳(封闭液)，每孔加入200μl封闭液，37℃孵育1h，pbst洗板3次，每次3min，拍干；3)加待测样品：将收集到的腹水按1:80000、1:160000、1:320000、1:640000、1:1280000、1:2560000梯度稀释，sp2/0细胞腹水为阴性对照，按照同样梯度进行稀释，每个梯度各100μl分别加入反应孔中，平行测定两次，37℃孵育1h，pbst洗3次，每次3min，拍干；4)加二抗：将山羊抗小鼠hrp-igg抗体稀释10000倍，100μl/孔，37℃孵育1h，pbst洗板5次，每次3min，拍干；5)显色：加入底物显色反应液，100μl/孔，室温避光显色10～15min。6)终止：加入终止液，50μl/孔。7)读值：以450nm单波长测定各孔od值。8)判定：抗体梯度与sp2/0细胞腹水的阴性对照od450值相比在2倍以上。

实施例7-制备泡球蚴免疫组化试剂盒

材料：小鼠体内诱生的抗多房棘球绦虫原头蚴单克隆抗体、小鼠体内诱生的抗sp2/0腹水、多房棘球绦虫原头蚴，3％过氧化氢、0.01m枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)、0.01mpbs缓冲液(ph7.2)、10％山羊血清封闭液、免疫组化湿盒、辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗小鼠igg、dab显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

步骤：将多房棘球绦虫原头蚴经4％多聚甲醛固定，梯度脱水、透明后，进行常规石蜡包埋，切片，厚度4mm。脱蜡，梯度入水。3％过氧化氢室温10min灭活内源性酶。蒸馏水洗3次，5min/次。抗原修复：将切片浸入0.01m枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)，微波炉加热至沸腾，持续15min。室温下冷却后用pbs(ph7.2)洗3次，5min/次。封闭：滴加10％山羊血清封闭液，室温孵育1h。pbs洗3次，5min/次。滴加制备的单抗：滴加稀释1000倍的腹水，放入湿盒，4℃孵育过夜。次日pbs洗3次，5min/次。滴加即用型二抗：滴加山羊抗小鼠hrp-igg，室温孵育1h。pbs洗3次，5min/次。dab显色：使用dab显色试剂盒。取试剂盒中a试剂1ml加b试剂1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，在5～10min之间。苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。anti-xjempscag-1c1单克隆抗体与多房棘球绦虫原头蚴反应呈棕色，anti-xjempscag-1g11单克隆抗体与多房棘球绦虫原头蚴反应呈棕色，sp2/0腹水与多房棘球绦虫原头蚴反应不着色。说明本发明具有很强的特异性和敏感性。

本发明建立的杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心。其保藏信息如下：保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。保藏日期：2020年10月26日。保藏编号：cctccno：c2020198和cctccno：c2020200。分类命名：杂交瘤细胞株anti-xjempscag-1c1和anti-xjempscag-1g11。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。