一种提高可得然胶产量和凝胶强度的方法与流程

1.本发明属于生物发酵和食品添加剂生产技术领域，涉及一种提高可得然胶产量和凝胶强度的方法，具体是在发酵培养基中添加feso4提高可得然胶产量和凝胶强度。


背景技术：

2.可得然胶(curdlan)是由单一的d-葡萄糖在c1和c3位置上以β-1，3-糖苷键连接而成的无分支的均一多糖聚合物。该多糖结构允许其在不同温度下形成性质完全不同的凝胶，可得然胶具有独特的热凝胶性和良好的生物活性，在食品、医药、生物材料等领域具有重大的应用前景。
3.可得然胶作为一种新型的食品添加剂，可为肉制品、面制品等食品中适量添加的辅料。由于可得然胶具有加热成胶的特性，在食品行业具有很大的应用潜力，例如根据可得然胶的热成型性，在面条和豆腐中添加适量的可得然胶，可以防止面条软烂，增加弹性，再例如在冰淇淋和馅心中添加可得然胶，其作为一种稳定剂，可以提高保型性。
4.可得然胶在医学领域的应用也是研究的热点之一。可得然胶在医学领域中可被用于药物载体，可得然胶羧甲基化可以提高溶解性，抗肿瘤活性得到提高，将可得然胶制备成纳米颗粒，包裹药物，可以延长药物的稳定性，可得然胶硫酸化后具有一定的抗病毒，抗凝血作用。
5.可得然胶在其他领域的应用，作为鱼饲料的粘合剂，提高饲料的利用效率，在建筑领域可得然胶可以添加进混凝土中，提高混凝土的流动性，降低分离性。可得然胶还可以有效去除中药中的重金属成分，应用于中药开发领域中。
6.由于生产工艺的差异性，不同可得然胶的聚合度也不同。平均聚合度是其能否具有凝胶特性的决定性因素：平均聚合度越高，可得然分子在一定温度下所能形成的微纤维的体积越大，凝胶强度越高，胶体品质越好。
7.目前，国内可得然胶的相关专利主要为菌种选育，发酵过程优化及其应用等方面。有关无机盐对可得然胶产量和性质的影响的研究较少。


技术实现要素：

8.为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种通过在可得然胶的发酵培养基中添加feso4来提高可得然胶产量和凝胶强度的方法。本发明发现通过添加适量的无机盐feso4可以提高可得然胶产量和可得然胶凝胶强度。该无机盐用量低，易获得，方法简单，提高可得然胶产量和凝胶强度效果显著。该方法可应用于可得然胶发酵过程，提高可得然胶的产量和品质。
9.本发明提供了一种含feso4的发酵培养基，所述培养基的组分及含量为：60～120g/l蔗糖、1～3g/l kh2po4、1～3g/l(nh4)2hpo4、0.5-2g/l mgso4·
7h2o、2～6g/l酵母粉、1-3g/l碳酸钙，feso4的浓度为发酵培养基的0.01％～0.04％(w/v)，ph值为6.8-7.2。
10.优选地，所述发酵培养基的组分及含量为：90g/l蔗糖、2g/l kh2po4、2g/l(nh4)2hpo4、1g/l mgso4·
7h2o、4g/l酵母粉、2g/l碳酸钙，feso4的浓度为0.02％(w/v)，ph值为7.0。
11.本发明还提供了一种含feso4的种子培养基，所述培养基的组分及含量为：10～20g/l蔗糖、0.1～0.2g/l kh2po4、0.5～1.0g/l(nh4)2hpo4、0.05-0.15g/l mgso4·
7h2o，1-3g/l碳酸钙，ph值为6.8-7.2。
12.优选地，所述种子培养基的组分及含量为：20g/l蔗糖、1.5g/l kh2po4、5g/l(nh4)2hpo4、1g/l mgso4·
7h2o，3g/l碳酸钙，ph值为7.0。
13.本发明还提供了所述含有feso4的发酵培养基在制备可得然胶中的应用。
14.本发明还提供了一种利用所述的发酵培养基制备可得然胶的方法，所述制备方法包括以下步骤：
15.(1)种子活化：将含种子的冻存液快速解冻后倒入种子培养基中，摇床培养，得到一级种子；取一级种子，以一定接种量接种于种子培养基，培养18小时，得到二级种子；
16.(2)接种发酵：接种前将无机盐母液过滤除菌，按比例稀释后加入基础发酵培养基；将二级种子以一定接种量接种，摇床振荡培养；
17.(3)可得然胶制备：向步骤(2)培养得到的发酵液中加入浓度为2.4％(w/v)的naoh溶液，搅拌后静置30min，离心取上清，并向其中加3m hcl，调ph至7.0；然后使用蒸馏水、95％乙醇洗涤过滤，然后于60℃烘干，即为可得然胶产品。
18.步骤(1)中，所述种子为根瘤菌菌株rhizobium sp.atcc 31749。
19.步骤(1)中，所述种子培养基的组分及含量为：10～20g/l蔗糖、0.1～0.2g/l kh2po4、0.5～1.0g/l(nh4)2hpo4、0.05-0.15g/l mgso4·
7h2o、1-3g/l碳酸钙，ph值为6.8-7.2。
20.优选地，所述种子培养基的组分及含量为：20g/l蔗糖、1.5g/l kh2po4、5g/l(nh4)2hpo4、1g/l mgso4·
7h2o、3g/l碳酸钙，ph值为7.0。
21.步骤(1)中，所述摇床培养的温度为28℃-32℃；优选地，为30℃。
22.步骤(1)中，所述摇床培养的时间为16h-20h；优选地，为18h。
23.步骤(1)中，所述接种量为1％-3％；优选地，为2％。
24.步骤(2)中，所述无机盐母液的稀释比例为10％-20％；优选地，为10％。
25.步骤(2)中，所述无机盐为feso4。
26.步骤(2)中，所述二级种子接种量为5％-15％；优选地，为10％。
27.步骤(2)中，所述摇床培养的温度为28℃-32℃；优选地，为30℃。
28.步骤(2)中，所述摇床培养的时间为96h-144h；优选地，为144h。
29.步骤(3)中，所述发酵液和naoh溶液的质量比为1.2％-3.6％；优选地，为2.4％。
30.步骤(3)中，所述搅拌操作的时间为10min-20min；优选地，为15min。
31.步骤(3)中，所述离心操作的转速为9000rpm-10000rpm；优选地，为10000rpm。
32.步骤(3)中，所述离心操作的时间为20min-30min；优选地，为20min。
33.步骤(3)中，所述离心操作的温度为20℃-25℃；优选地，为25℃。
34.在一个具体实施方案中，所述可得然胶的制备方法具体包括如下步骤：
35.(1)种子活化：将在-80℃甘油保藏管中的含种子的冻存液快速解冻后倒入种子培养基中，在30℃、250rpm摇床中培养16小时，得到一级种子。取一级种子，以5％接种量接种
于种子培养基，培养18小时，得到二级种子。
36.所述种子为根瘤菌菌株rhizobium sp.atcc 31749。
37.(2)接种发酵：接种前将无机盐母液过滤除菌，按比例稀释后加入基础发酵培养基。将二级种子以10％接种量接种，每组六个三角瓶，在30℃、250rpm摇床条件下振荡培养144h。
38.(3)可得然胶制备：取200ml发酵液，搅拌加入浓度为2.4％(w/v)的naoh溶液200ml，搅拌15min，静置30min，25℃、9000rpm离心20min，取上清，向其中缓慢流加3m hcl并搅拌，调ph至7.0。使用80目滤布蒸馏水过滤洗涤，重复洗涤两次。加入95％乙醇，再次过滤洗涤，取出产物于60℃过夜烘干。使用磨粉仪将产物磨粉，并使用60目筛网过筛，即可得到可得然胶产品。
39.本发明的有益效果包括：本发明通过向发酵培养基中添加feso4提高可得然胶产量和凝胶强度，综合无机盐对可得然胶产量和性质的影响，在培养基中添加0.01％的feso4可得然胶产量提高24％，凝胶强度提高28％；添加0.02％的feso4可得然胶产量提高30％，凝胶强度提高42％；添加0.04％的feso4可得然胶产量提高8％，凝胶强度提高10％。产量和凝胶强度提高可以降低可得然胶的发酵成本，有利于可得然胶的进一步推广。
附图说明
40.图1是本发明添加不同浓度feso4的2％凝胶的成品外观图。从左到右添加的feso4的浓度分别为0、0.01％、0.02％、0.04％。
具体实施方式
41.结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
42.本发明提供了一种添加无机盐促进根瘤菌产可得然胶凝胶强度增强的培养基及其应用方法。本发明所述一种添加无机盐促进根瘤菌产可得然胶凝胶强度增强的培养基及其应用方法已通过较佳实施案例进行描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
43.本发明中，可得然胶的性质可以通过质构仪分析2％浓度的可得然胶凝胶获得，主要测定参数有凝胶强度和质地剖面分析(texture profile analysis,tpa)参数。通过检测在30℃、250rpm摇床条件下培养144小时后发酵液的可得然胶产量，原液凝胶强度和破裂位移以表征无机盐对可得然胶发酵过程的影响；通过质构仪测定2％浓度凝胶的凝胶强度以及质地剖面分析测定，以表征无机盐对可得然胶产物品质的影响。再对品质良好的可得然胶样品进行分子量测定，进一步检测可得然胶产物的品质。
44.实施例1(对照实施例)无feso4培养基发酵生产可得然胶
45.种子培养基组分及含量：
46.蔗糖20g/l，kh2po41.5g/l，(nh4)2hpo45 g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，碳酸钙3g/l；
47.发酵培养基组分及含量：
48.蔗糖90g/l，kh2po42g/l，(nh4)2hpo42 g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，酵母粉4g/l，碳酸钙
2g/l；
49.种子活化：
50.将在-80℃甘油保藏管中含有根瘤菌菌株rhizobium sp.atcc 31749的冻存液快速解冻后倒入种子培养基中，在30℃、250rpm摇床中培养16小时，得到一级种子。取一级种子，以2％接种量接种于种子培养基，培养18小时，得到二级种子。
51.接种发酵：
52.将二级种子以10％接种量接种，每组六个三角瓶，在30℃、250rpm摇床条件下振荡培养144h。
53.可得然胶产量测定：
54.发酵液于9000r/min离心10min，去上清，固形物用2倍体积95％乙醇清洗(玻璃棒充分振荡混匀后，静置15min)，9000r/min，离心10min去上清液，将沉淀于65℃烘箱烘干至恒重，称重计算产量。
55.可得然胶制备：
56.取200ml发酵液，搅拌加入浓度为2.4％(w/v)的naoh溶液200ml，搅拌15min，静置30min，25℃、9000rpm离心20min，取上清，向其中缓慢流加3m hcl并搅拌，调ph至7.0。
57.使用80目滤布蒸馏水过滤洗涤，重复洗涤两次。加入95％乙醇，再次过滤洗涤，取出产物于60℃过夜烘干。
58.完全烘干后使用磨粉仪将产物磨粉，并使用60目筛网过筛后，即得可得然胶产品。
59.2％精品凝胶强度测定：
60.采用国标gb 28304-2012的方法制备2％的可得然胶凝胶。准确称取0.3g可得然胶样品溶于15ml蒸馏水中，用高速匀浆机8000r/min分散5min，将分散液转入18mm
×
180mm的试管中，并用循环水式真空泵抽气4min后置于95℃水浴锅中加热10min，冷水浴。
61.将制成的2％凝胶按照国标要求取其距底部20-35mm的部位平切，在切凝胶时尽量保持切面平整。然后用质构仪通过穿刺法进行凝胶强度和破裂位移的测定，测定探头为型号p/5的不锈钢圆柱探头。测试参数为测前速度：4.17mm/s，测中速度：4.17mm/s，测后速度：4.17mm/s，测试距离：10mm，形变量：10％，触发类型：自动，感应力：10g。
62.在探头下降过程中，凝胶破裂时探头所受到的力值为其凝胶强度值，单位为g/cm2；凝胶从开始到破裂时的探头穿进位移为其破裂位移，单位为mm。
63.2％凝胶的质地剖面分析(tpa)分析：
64.将制成的2％的凝胶取其距底部5-10mm的部位平切，用质构仪采用二次咀嚼法进行tpa的质构分析。
65.分子量测定：
66.精准称量3-5mg样品于制样管中，放置在100℃的磁力搅拌器中水浴4小时。待冷却后经0.22μm微孔滤膜过滤两次，放入凝胶渗透色谱仪中进行检测。
67.实施例2含feso4浓度为0.01％的培养基发酵生产可得然胶
68.发酵培养基组分及含量：
69.蔗糖90g/l，kh2po42g/l，(nh4)2hpo42 g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，酵母粉4g/l，碳酸钙2g/l，feso4的浓度为发酵培养基的0.01％(w/v)；
70.种子培养基的组分和含量同实施例1。
71.种子活化：同实施例1。
72.接种发酵：接种前将无机盐母液过滤除菌，按0.01％比例稀释后加入基础发酵培养基。将二级种子以10％接种量接种，每组六个三角瓶，在30℃、250rpm摇床条件下振荡培养144h。
73.可得然胶产量测定：同实施例1。
74.可得然胶制备：同实施例1。
75.2％精品凝胶强度测定：同实施例1。
76.2％凝胶的质地剖面分析(tpa)分析：同实施例1。
77.分子量测定：同实施例1。
78.实施例3含feso4浓度为0.02％的培养基发酵生产可得然胶
79.发酵培养基组分及含量：
80.蔗糖90g/l，kh2po42g/l，(nh4)2hpo42 g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，酵母粉4g/l，碳酸钙2g/l，feso4的浓度为发酵培养基的0.02％(w/v)；
81.种子培养基的组分和含量同实施例1。
82.种子活化：同实施例1。
83.接种发酵：接种前将无机盐母液过滤除菌，按0.02％比例稀释后加入基础发酵培养基。将二级种子以10％接种量接种，每组六个三角瓶，在30℃、250rpm摇床条件下振荡培养144h。
84.可得然胶产量测定：同实施例1。
85.可得然胶制备：同实施例1。
86.2％精品凝胶强度测定：同实施例1。
87.2％凝胶的质地剖面分析(tpa)分析：同实施例1。
88.分子量测定：同实施例1。
89.实施例4含feso4浓度为0.04％的培养基发酵生产可得然胶
90.发酵培养基组分及含量：
91.蔗糖90g/l，kh2po42g/l，(nh4)2hpo42 g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，酵母粉4g/l，碳酸钙2g/l，feso4的浓度为发酵培养基的0.04％(w/v)；
92.种子培养基的组分和含量同实施例1。
93.种子活化：同实施例1。
94.接种发酵：接种前将无机盐母液过滤除菌，按0.04％比例稀释后加入基础发酵培养基。将二级种子以10％接种量接种，每组六个三角瓶，在30℃、250rpm摇床条件下振荡培养144h。
95.可得然胶产量测定：同实施例1。
96.可得然胶制备：同实施例1。
97.2％精品凝胶强度测定：同实施例1。
98.2％凝胶的质地剖面分析(tpa)分析：同实施例1。
99.分子量测定：同实施例1。
100.本发明实施例1-4中，添加了不同浓度的feso4溶液制备获得的各凝胶样品的相关测试结果如下表1所示：
101.表1不同浓度feso4对可得然胶发酵产量、凝胶强度及tpa分析参数的影响
[0102][0103]
根据上表的测试结果可以看到，当在培养基中添加0.01％的feso4，可得然胶产量提高24％，凝胶强度提高28％；添加0.02％的feso4，可得然胶产量提高30％，凝胶强度提高42％；添加0.04％的feso4，可得然胶产量提高8％，凝胶强度提高10％。由此，可以得出，本发明通过向发酵培养基中添加feso4，可以提高可得然胶产量和凝胶强度。
[0104]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。