一种稳定不析出的胆硫乳琼脂平板的制作方法

1.本发明涉及一种微生物鉴定用平板，特别涉及一种稳定不析出的胆硫乳琼脂平板。


背景技术：

2.沙门氏菌是一类广泛存在于肉制品、蛋类，水产品，奶制品等常见食物中的革兰氏阴性杆菌，主要通过食物和饮水经口感染，引起急性胃肠炎、剧烈头痛、呕吐、腹泻等临床症状。志贺氏菌是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。在我国每年由沙门氏菌、志贺氏菌感染引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首位,因此在日常食物以及进出口食物中，沙门氏菌、志贺氏菌的检测是非常重要的检测项目。
3.我国微生物检验标准gb/t4789.4
‑
2003、sn/t2206.3
‑
2009等均推荐胆硫乳琼脂作为分离沙门氏菌、志贺氏菌的选择性培养基。sn/t2206.3
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2009使用的胆硫乳琼脂(dhl)组成为：蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、牛胆盐1.0g、硫代硫酸钠2.2g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g或5g/l水溶液6ml、琼脂18.0g～20.0g、蒸馏水1000ml，ph7.3。gb/t4789.28
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2003规定的dhl琼脂成分为蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、去氧胆酸钠1.0g、硫代硫酸钠2.3g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g、琼脂18.0g～20.0g、蒸馏水1000ml，ph7.3。
4.即用型琼脂平板是一种预制的琼脂平板，不需要经过配制过程、直接现取现用，方便、快捷、节省人力物力财力等各种优势，是微生物检验产品发展的趋势。胆硫乳琼脂中含有蛋白胨、牛肉浸粉、乳糖、蔗糖、胆盐、硫代硫酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸铁铵、中性红、琼脂等多种成分。由于该配方中糖、胆盐、硫代硫酸钠等种类较多，配制的平板在储存过程中容易在平板表面析出盐晶，影响平板的外观及使用。目前国内生产的胆硫乳琼脂平板均只有3个月保质期，且在保质期内平板表面出现盐晶，无法满足长期储存的需求。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种稳定的胆硫乳琼脂平板。
6.本发明所采取的技术方案是：
7.本发明的第一个方面，提供：
8.组合物在制备胆硫乳琼脂平板稳定剂中的应用，所述组合物选自乳酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘氨酸和聚乙烯吡咯烷酮中的至少2种。
9.在一些实例中，所述组合物为乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠。
10.在一些实例中，乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠的质量比为(10～30)：(2～6)。
11.在一些实例中，乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠的质量比为20：5。
12.在一些实例中，所述组合物为甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠。
13.在一些实例中，甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠的质量比为(15～30)：(1～3)。
14.在一些实例中，甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠的质量比为20：1。
15.本发明的第二个方面，提供：
16.一种稳定的胆硫乳琼脂平板，其添加有本发明第一个方面所述的组合物。
17.在一些实例中，每1000ml培养基中添加有乳酸钠0.1～0.3g，十二烷基苯磺酸钠0.02～0.06g。
18.在一些实例中，每1000ml培养基中添加有乳酸钠0.2g，十二烷基苯磺酸钠0.05g。
19.在一些实例中，每1000ml培养基中添加有甘氨酸0.75～1.5g，十二烷基苯磺酸钠0.02～0.06g。
20.在一些实例中，每1000ml培养基中添加有甘氨酸1g，十二烷基苯磺酸钠0.05g。
21.在一些实例中，每1000ml培养基中含有蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3g、酵母粉3g、氯化钠5g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、胆盐3.0g、硫代硫酸钠2.0g、柠檬酸钠2g、柠檬酸铁铵1g、中性红0.03g、琼脂14g。
22.在一些实例中，每1000ml培养基中含有蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、牛胆盐1.0g、硫代硫酸钠2.2g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g，琼脂18.0g～20.0g，余量为水。
23.在一些实例中，每1000ml培养基中含有蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、去氧胆酸钠1.0g、硫代硫酸钠2.3g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g、琼脂18.0g～20.0g，余量为水。
24.本发明的有益效果是：
25.本发明的一些实例，配置出的平板，在储存期内不会出现点状或针状盐晶，且平板的保水性能好，储存6个月后，生物学性能依旧可以达标。解决了胆硫乳琼脂平板储存过程中容易析出盐晶，影响平板的外观及使用的问题。
26.本发明的一些实例，通过对胆硫乳琼脂平板的配方进行优化，可以得到稳定性更好的胆硫乳琼脂平板。
具体实施方式
27.下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
28.对比例1：
29.sn/t2206.3
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2009使用的胆硫乳琼脂(dhl)，组成为：蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、牛胆盐1.0g、硫代硫酸钠2.2g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g，琼脂18.0gg、蒸馏水1000ml，ph7.3。
30.对比例2：
31.gb/t4789.28
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2003规定的dhl琼脂，成分为：蛋白胨20.0g、牛肉膏粉3.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、去氧胆酸钠1.0g、硫代硫酸钠2.3g、柠檬酸钠1.0g、柠檬酸铁铵1.0g、中性红0.03g、琼脂18.0g、蒸馏水1000ml，ph7.3。
32.对比例3：
33.一种稳定不析出的胆硫乳琼脂平板，每1000ml培养基中含有蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3g、酵母粉3g，氯化钠5g，乳糖10.0g、蔗糖10.0g、胆盐3.0g、硫代硫酸钠2.0g，柠檬酸钠2g,柠檬酸铁铵1g,中性红0.03g,琼脂14g，ph7.3。
34.对比例4
35.同对比例3，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇，1000ml培养基的添加量为聚乙烯吡咯烷酮0.5g，聚乙二醇0.01g，余量为水。
36.对比例5
37.同对比例3，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为聚乙二醇和甘氨酸，1000ml培养基的添加量为聚乙二醇0.02g，甘氨酸0.5g。
38.实施例1
39.同对比例3，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠，1000ml培养基的添加量为乳酸钠0.2g，十二烷基苯磺酸钠0.05g。
40.实施例2
41.同对比例3，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠，1000ml培养基的添加量为甘氨酸1g，十二烷基苯磺酸钠0.05g。
42.实施例3
43.同对比例3，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酸，1000ml培养基的添加量为聚乙烯吡咯烷酮0.5g，甘氨酸0.5g。
44.实施例4
45.同实施例1，不同之处在于乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠的添加量分别为0.1g和0.06g。
46.实施例5
47.同实施例1，不同之处在于乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠的添加量分别为0.15g和0.04g。
48.实施例6
49.同实施例1，不同之处在于乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠的添加量分别为0.3g和0.02g。
50.实施例7
51.同对比例1，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠，其添加量(每1000ml培养基)为乳酸钠0.3g、十二烷基苯磺酸钠0.03g。
52.实施例8
53.同对比例2，不同之处在于还添加了稳定剂，稳定剂为乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠，其添加量为乳酸钠0.1g、十二烷基苯磺酸钠0.04g。
54.下面结合实验，进一步说明本发明一些实例的胆硫乳琼脂平板性能。
55.平板性能测试：
56.1材料
57.1.1菌株
58.鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)atcc14028，福氏志贺氏菌(shigella falfella)cmcc(b)51572，粪肠球菌(enterococcus faecalis)atcc29212，由本实验室保存的商品化菌株。这些菌株可以使用其他公知的菌株替换。
59.1.2培养基及试剂
60.胰酪胨大豆琼脂培养基平板(简称tsa平板)由广东环凯微生物科技有限公司提
供。
61.2方法
62.2.1平板外观性能评价
63.2.1.1胆硫乳琼脂平板制备：按实施例中配方以及标准配方按比例进行称量，调整ph值，煮沸溶解，冷却至50℃倾注平板，备用。
64.2.1.2将制备好的胆硫乳琼脂平板进行包装，各平板均置于同一冷库，2～8℃中储存，分别在0d、15d、30d、60d、120d、180d取样，观察平板表面析出情况。
65.2.2培养基生物学性能评价
66.生长率试验：
67.采用定量方法进行。将鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌2株菌的新鲜斜面培养物制成约103cfu/ml的菌悬液。分别取上述各菌液0.1ml用全自动螺旋接种仪分别接种于待测平板，鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌的菌液同时接种参比培养基tsa平板，37
±
1℃培养18
‑
24小时。每种平板进行3个重复。观察各株菌在培养基上的生长情况，并对其进行菌落计数。按下列公式计算生长率p
r
。
68.p
r
＝n
s
/n0，
69.n
s
：待测培养基平板上得到的平均菌落数；n0：参比培养基平板上获得的平均菌落数。
70.选择性测试：
71.将粪肠球菌制成108cfu/ml～109cfu/ml浓度菌悬液，用1μl接种环取菌悬液1环，在待测平板及参照培养基平板表面划六条平行直线，37
±
1℃培养18
‑
24小时；培养后按以下方法对培养基计算生长指数g。
72.1)每条有比较稠密菌落生长的划线则g为1，每个培养皿上最多为6分；
73.2)如果仅一半的线有菌落生长，则g为0.5；
74.3)如果划线上没有菌落生长或生长量少于划线的一半，则g为0。
75.记录每个平板的得分总和便得到g值。
76.3结果
77.3.1平板外观性能评价
78.测试方法，目测，少量盐晶指平板表面≤10％的面积有肉眼可见的盐晶；大量盐晶指平板表面≥80％面积有肉眼可见的盐晶；介于二者之间的，计为部分盐晶。实验结果见下表。
[0079][0080][0081]
注：“n”表示无析出；“+”表示析出少量盐晶；“++”表示析出部分盐晶；“+++”表示析出大量盐晶。
[0082]
结果表明：
[0083]
1)乳酸钠、十二烷基苯磺酸钠、甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮中的两种，特别是乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠组合、甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠组合、甘氨酸和聚乙烯吡咯烷酮组合使用，均有提高胆硫乳琼脂平板作用，其中乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠组合的效果最佳，甘氨酸和十二烷基苯磺酸钠组合次之，甘氨酸和聚乙烯吡咯烷酮组合的效果较弱；
[0084]
2)聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇组合、聚乙二醇和甘氨酸组合，未显示出提高胆硫乳琼脂稳定性的效果；
[0085]
3)乳酸钠和十二烷基苯磺酸钠作为稳定剂添加在胆硫乳琼脂平板内，可以显著提高现有胆硫乳琼脂平板的稳定性；
[0086]
4)通过对胆硫乳琼脂平板的配方进行进一步优化，可以获得稳定性更佳的胆硫乳琼脂平板。
[0087]
3.2生物学
[0088]
将实施例1所述平板，与新配制的胆硫乳琼脂平板(对比例3)进行比较，结果如下：
[0089][0090]
综上所述：仅有实施案例1所述的胆硫乳琼脂平板的保质期最长，6个月后其外观未发生变化，平板表面未见杂质或盐晶，且6个月后生物学效果与新配制的平板相当，培养基的性能良好，为延长即用型成品培养基的保质期提供了新途径。