一种香橼多糖及其提取方法与应用

本发明属于天然产物的提取与纯化工艺领域，具体涉及一种香橼多糖及其提取方法与应用。

背景技术：

香橼(学名：citrusmedical.)，又名枸橼或枸橼子，属芸香科柑橘属枸橼类果树，是三大古老柑橘品种之一，在中国已经有近两千余年的栽培历史，主产地为台湾、福建、广东、广西、云南等中国南部省区。同时，越南、老挝、缅甸、印度等也有广泛栽培。香橼是一种药食同源果树，具有较高的抗溃疡病特性，栽培管理方式简单，产量高，是一种经济价值较高的水果。

目前，香橼果实中功能性成分的研究以精油提取为主，且精油提取以冷榨为主，在工业利用中产生了大量了果渣。香橼为柑橘类果实，其果渣含有大量可利用的果胶即植物多糖，目前，对于香橼果渣并没有有效的处理手段，有研究采用响应面法优化果皮中酸解醇沉法提取工艺，但该方法需要酸性高温条件(ph2.0，85.0℃)，对生产设备要求较高，需要具备耐腐蚀性能，因此，在实际应用中会增加成本。也有采用离子交换树脂分离柱进行分离纯化的方法，但离子交换树脂价格昂贵，使其仅能局限于实验室小规模研究。

因此，亟待进一步开发香橼果肉或果渣中的有益活性物质及其相应的提取纯化工艺，以增加香橼果的可回收价值，促进环保循环产业发展。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种香橼多糖；

本发明的另一目的在于提供一种香橼多糖的提取方法；

本发明的另一目的在于提供上述香橼多糖或上述制备方法制备得到的香橼多糖在增强免疫力中的应用；

本发明的另一目的在于提供一种药物。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种香橼多糖，该香橼多糖的结构式如式i所示：

上述香橼多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸构成，是一种酸性多糖，上述香橼多糖的主链连接方式为→3,4)-α-l-rhap-(1→4)-α-d-galap-(1→，端基α-l-araf-(1→5)-α-l-araf-(1→通过→3,4)-α-l-rhap-(1→的o-4键连接在主链上。

进一步地，上述香橼多糖中，各单糖组成及摩尔比例为：鼠李糖(rha)：阿拉伯糖(ara)：半乳糖醛酸(gala)＝6～8：28～32：14～16。

更进一步地，上述香橼多糖中，各单糖组成及摩尔比例为：鼠李糖(rha)：阿拉伯糖(ara)：半乳糖醛酸(gala)＝1：4：2。

本发明的第二个方面，提供：

一种香橼多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)浸提香橼果，去除色素和小分子杂质；

(2)80～85℃水提步骤(1)所得香橼果，得到水提液；

(3)对步骤(2)所得水提液进行醇提，即得。

进一步地，上述香橼果包括任意形态的香橼果肉、香橼果皮和香橼果渣。

更进一步地，本发明实施例中上述香橼果为香橼果渣粉，颗粒大小可过50目筛。

进一步地，上述提取方法步骤(1)中的浸提的浸提剂包括乙醇，浸提剂与香橼果的体积比为(4～5)：1，浸提时间为22～26h，其中，乙醇浓度优选为95％。

更进一步地，上述浸提剂与香橼果的体积比为4：1，浸提时间为24h。

上述浸提步骤的目的在于除去色素等小分子化合物的干扰，提高后续提取的提取率和产物纯度。

进一步地，上述提取方法步骤(2)中的水体时间为2h，重复3次，以提高提取率。

进一步地，上述提取方法还包括在步骤(2)后进行浓缩处理，将水提液浓缩至原体积的一半。

进一步地，上述提取方法步骤(3)中的醇提中的提取剂包括乙醇；乙醇的终浓度为20～80％。

更进一步地，本发明实施例中醇提中的提取剂为乙醇。

更进一步地，本发明实施例中醇提的具体步骤为：

在上述提取方法步骤(2)中得到的水提液中缓慢加入95％乙醇至终浓度为20％，边加边搅拌，将混合物于4℃环境下静置24h，过滤，上层凝胶干燥得到香橼多糖(粗提物)。

进一步地，上述提取方法还包括在步骤(3)之后进行纯化处理；其中，该纯化处理包括以下步骤：

(1)取上述提取方法步骤(3)所得产物，进行脱蛋白处理；

(2)加入醇溶液进行醇沉，得到中间产物1；

(3)将步骤(2)上述中间产物1过纤维素柱，用0～1mol/lnacl溶液洗脱，收集组分，透析，得到中间产物2；

(4)用流动相溶解步骤(3)得到的中间产物2，离心取上清，过凝胶柱，即得纯化后的香橼多糖。

更进一步地，上述纯化处理步骤(1)中的脱蛋白处理的试剂包括sevage试剂，该sevage试剂包括氯仿和正丁醇，以体积比计，氯仿：正丁醇＝(4～5)：1；

更进一步地，上述sevage试剂中氯仿：正丁醇的体积比为4：1。

更进一步地，上述纯化处理步骤(2)中的醇溶液包括乙醇溶液；在本发明实施例中上述醇溶为95％乙醇溶液。

更进一步地，上述纯化处理步骤(3)中的纤维素柱为deae-52纤维素柱。

更进一步地，上述纯化处理步骤(3)中的洗脱用的nacl溶液浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.5及1mol/l。

更进一步地，上述纯化处理步骤(3)中的收集组分在本发明实施例中为收集0.1mol/lnacl溶液洗脱的组分，并在40～60℃条件下蒸发浓缩。

更进一步地，上述纯化处理步骤(3)中的透析处理为使用3000da透析袋进行透析，透析时间为7～14天直至无nacl析出，透析结束后可以进行干燥处理，干燥处理包括冷冻干燥。

更进一步地，上述纯化处理步骤(4)中的流动相包括超纯水，流动相流速为1.5ml/min，每管10ml。

更进一步地，上述离心条件为12000rpm离心10min。

更进一步地，上述凝胶柱为superdex-200葡聚糖凝胶柱，凝胶柱尺寸为2.6cm×70cm(直径×高度)。

更进一步地，上述纯化处理还包括在步骤(4)后进行浓缩和干燥。

本发明的第三个方面，提供：

上述香橼多糖或上述制备方法制备得到的香橼多糖在增强免疫力中的应用。

上述香橼多糖或上述制备方法制备得到的香橼多糖随着加摄入量的增加，能显著增加小鼠单核巨噬细胞白血病细胞释放的一氧化氮(no)量，促进巨噬细胞的免疫活性，并同时激发促炎细胞因子tnf-α和il-6的分泌，增强机体免疫力。

本发明的第四个方面，提供：

一种药物，该药物中含有上述香橼多糖或上述制备方法制备得到的香橼多糖。

进一步地，上述药剂还包括药学上可接受的辅料。

进一步地，上述药剂的剂型包括溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂和缓控释制剂。

本发明的有益效果是：

1.本发明提取得到一种新的香橼多糖，该香橼多糖随着加摄入量的增加，能显著增加小鼠单核巨噬细胞白血病细胞释放的一氧化氮(no)量，促进巨噬细胞的免疫活性，并同时激发促炎细胞因子tnf-α和il-6的分泌，增强机体免疫力。

2.本发明中的香橼多糖提取及纯化工艺，方法提取香橼多糖的纯度高，检测中不会检测出其他杂质的存在，简单高效。

附图说明

图1为本发明实施例中的香橼多糖的纤维素纯化色谱图；

图2为本发明实施例中的香橼多糖的superdex-200葡聚糖凝胶纯化色谱图；

图3为本发明实施例中的香橼多糖的提取纯化工艺流程图，其中cm1为本发明实施例中的香橼多糖粗提物，cm1-s为纯化后的香橼多糖；

图4为本发明实施例中的香橼多糖的离子色谱图；

图5为本发明实施例中的香橼多糖的气相色谱图；

图6为本发明实施例中的香橼多糖的¹hnmr图谱；

图7为本发明实施例中的香橼多糖的¹³cnmr图谱；

图8为本发明实施例中的香橼多糖的dept135图谱；

图9为本发明实施例中的香橼多糖的hh-cosy图谱；

图10为本发明实施例中的香橼多糖的hsqc图谱；

图11为本发明实施例中的香橼多糖的noesy图谱；

图12为各实验组的raw264.7巨噬细胞的存活情况；

图13为各实验组的raw264.7巨噬细胞的no的释放量，其中，a为不同孵育时间处理的no释放量，b为不同浓度香橼多糖处理的no释放量；

图14为各实验组的raw264.7巨噬细胞的促炎细胞因子tnf-α(a)和il-6(b)含量；

图15为各实验组中的tnf-α(a)和il-6(b)的mrna表达水平。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

香橼多糖的提取

本实施例中的香橼多糖的提取包括以下步骤：

(1)材料处理：

将香橼果肉榨汁烘干后(或直接使用香橼果渣)研磨，过50目筛，得到香橼果肉粉末，加入4倍体积95％乙醇，浸泡24h，过滤干燥后得到去除色素等小分子化合物的香橼果粉，备用；

(2)水提：

以水为溶剂，将上述处理后的香橼果粉于80-85℃水浴提取2h，过滤，得滤液，重复3次，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩提取液至原体积的一半，得到浓缩液；

(3)醇提：

将95％乙醇缓慢加入上述所得浓缩液中，边加边搅拌，至浓缩液中乙醇重浓度为20％，将溶液于4℃静置24h，收集上层凝胶，干燥后即得香橼多糖粗提物。

在此步骤中，在获得本发明实施例中的香橼多糖粗提物后，可以继续向滤液中加入95％乙醇至终浓度40％，4℃静置24h，收集上层凝胶，干燥后得到另一种香橼多糖cm2；再次向滤液中加入95％乙醇至终浓度80％，4℃静置24h，收集下部沉淀物，干燥后即得第三种香橼多糖cm3。香橼多糖cm2和香橼多糖cm3相比本发明实施例中的香橼多糖，提取含量>1％，并不在本发明的保护的香橼多糖范围内。

(4)纯化处理：

a.脱蛋白：

将上述步骤中得到得香橼多糖粗提物用蒸馏水溶解，加入四分之一体积(v/v)sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4：1(v/v))，以250r/min振荡2h，用分液漏斗将沉淀的蛋白去除，重复此操作直至无蛋白沉淀生成，将滤液静置过夜，备用；

b.醇沉：

将95％乙醇缓慢加入上述脱蛋白后的香橼多糖粗提物中，边加边搅拌，至溶液中乙醇浓度为80％，过滤，收集沉淀，得到中间产物1；

c.过纤维素柱：

将上述中间产物1的浓度调整(根据实际情况选择浓缩或稀释)至8～10g/l，以3ml/min流速通过deae-52纤维素柱，并分别用0、0.05、0.1、0.2、0.5及1mol/lnacl溶液进行洗脱，收集0.1mol/lnacl的洗脱液，用旋转蒸发浓缩(加热温度控制在40～60℃)(纤维素纯化色谱图如图1所示)。

d.透析：

用3000da透析袋进行透析，时间为7～14天，直到透析后无nacl，对透析的溶液进行冷冻干燥，即得香橼多糖中间产物2。

e.过凝胶柱：

取上述香橼多糖中间产物2加入超纯水溶解，12000rpm离心10min，取上清液，以超纯水流动相，用预装superdex-200葡聚糖凝胶柱(2.6cm×70cm)进行纯化，流动相流速为1.5ml/min，每管收集10ml，结合示差检测器在线检测收集对称峰。将收集液通过旋转蒸发仪进行浓缩，冷冻干燥，得到纯化后的香橼多糖(superdex-200葡聚糖凝胶纯化色谱图如图2)。

上述提取方法的流程图如图3所示，其中cm1为本实施例中的香橼多糖，cm1-s为纯化后的本实施例中的香橼多糖。

本实施例中的香橼多糖的鉴定

包括以下检测手段：

(1)用brt105-104-102串联凝胶柱(8mm×300mm)对其分子量进行测定。

其中，流动相为0.05mnacl溶液，流速为0.6ml/min，柱温40℃，进样量为20μl，检测器为示差检测器ri-502。

(2)用离子测谱仪测定单糖组成。

取16种单糖标准品

分别(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、n-乙酰-d氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成约10mg/ml标准溶液，并分别精密配置出0.1、0.5、1、5、10、20、50mg/l梯度浓度作为标准品，采用绝对定量法，测定上述实施例中的香橼多糖中的不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。

(3)用糖醛酸还原仪进行还原实验：

取上述实施例中的香橼多糖，加蒸馏水溶解，然后加入醛酸活化剂，将还原仪设定ph为4.8，反应3h，在将ph设定为6.8，反应2h。浓缩样品，透析，反复还原3-5次，冻干。

称取冻干的香橼多糖样品(2-3mg)，加入1ml无水dmso，快速加入甲基化试剂a液，封闭，在超声作用下溶解，再加入甲基化试剂b液，在磁力搅拌水浴30℃进行甲基化反应60min。反应60min后加入2ml超纯水终止甲基化反应。

取甲基化后的香橼多糖溶液，加入1ml的2m三氟乙酸(tfa)水解90min，旋转蒸发仪蒸干。再加入2ml双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋转蒸发，101℃烘箱烘干。然后加入1ml乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却，加入3ml甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。

将乙酰化后的香橼多糖用3mlch2cl2溶解，分液漏斗过滤，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层的水溶液，重复4次。ch2cl2层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10ml，用shimadzugcms-qp2010气相色谱-质谱联用仪测定样品，用gc-ms法测并与标准质谱图库进行比对。

其中，gc-ms条件为：rxi-5silms色谱柱30m×0.25mm×0.25um；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1ml/min。

(4)核磁共振检测：

取上述实施例制备得到的香橼多糖，50mg，将其溶于0.5ml的重水中并冷冻干燥。随后将冻干粉再溶于0.5ml的重水中，并继续冷冻干燥，重复多次以充分交换活泼氢。然后将其溶于0.5ml的重水中，在室温25℃下置于以600mhz的核磁共振仪测定¹hnmr谱、¹³cnmr谱、dept135一维图谱和二维图谱。

上述鉴定方法的检测结果如图4～11所示。

鉴定结果表明，上述实施例中的提取及纯化工艺能制备得到香橼多糖纯品，其发现上述实施例得到的香橼多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸构成，是一种酸性多糖，主链连接方式为→3,4)-α-l-rhap-(1→4)-α-d-galap-(1→，端基α-l-araf-(1→5)-α-l-araf-(1→通过→3,4)-α-l-rhap-(1→的o-4键连接在主链上。

由此得出香橼多糖的结构式如式i所示：

上述实施例中的香橼多糖在改善免疫调节中的应用

以上述实施例中的香橼多糖为样品，测试其在对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(raw264.7细胞)的影响，具体试验步骤如下。

1.细胞培养

在含有10％fbs和1％青霉素-链霉素(5000单位/ml青霉素和5000μg/ml链霉素)(v/v)的dmem培养基中孵育raw264.7细胞(37℃，5％二氧化碳)。

2.细胞活力测定

取上述培养好的raw264.7细胞，以1×10⁵细胞/孔(96孔板)或1×10⁶细胞/孔(6孔板)设置试验组，分别在每孔中加入1、5、25、100μg/ml上述实施例中的香橼多糖或100ng/mllps(脂多糖，作为阳性对照)，孵育24小时。然后向每孔加入10μlcck-8试剂，温育2h，在545nm处测量吸光度。

3.一氧化氮生成量测定

取上述培养好的raw264.7细胞，以1×10⁵细胞/孔(96孔板)或1×10⁶细胞/孔(6孔板)设置试验组，分别在每孔中加入1、5、25、100μg/ml上述实施例中的香橼多糖或100ng/mllps(脂多糖，作为阳性对照)，孵育24小时。将100μl的griess试剂加入100μl的上述培养液中，以nano2为标准，测定540nm的吸光度计算no浓度。

一氧化氮生成抑制试验：方法同一氧化氮生成量测定，在加入100μg/ml上述实施例中的香橼多糖或100ng/mllps(脂多糖，作为阳性对照)孵育前，先用本领域中的常规媒介物或no释放抑制剂预处理2小时。

4.细胞因子的测定

取上述培养好的raw264.7细胞，以1×10⁵细胞/孔(96孔板)或1×10⁶细胞/孔(6孔板)设置试验组，分别在每孔中加入1、5、25、100μg/ml上述实施例中的香橼多糖或100ng/mllps(脂多糖，作为阳性对照)，孵育24小时。用酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒(solarbio)测定细胞中的促炎细胞因子tnf-α和il-6，具体测定方法按照试剂盒说明书进行。

细胞因子抑制实验：方法同细胞因子的测定，在加入100μg/ml上述实施例中的香橼多糖或100ng/mllps(脂多糖，作为阳性对照)孵育前，先用本领域中的常规载体或no释放细胞因子表达抑制剂预处理2小时。

实验结果：

如图12所示，与阴性对照和lps组的细胞存活率相比，上述实施例中的香橼多糖在1至100μg/ml的浓度范围内孵育24小时并不影响raw264.7巨噬细胞的存活情况。

no作为调节免疫应答的活性物质之一，测定no含量可以用来反映raw264.7巨噬细胞中上述实施例中的香橼多糖引起的免疫调节活性的改变。如图13所示，随着上述实施例中的孵育时间(图13a)和香橼多糖浓度(图13b)的增加，no的释放量发生显著降低(p<0.001)。试验中可测定到的最大no含量为51.97±2.36μmol/l，接近lps组(58.89±2.72μmol/l)，约为对照组(5.81±0.54μmol/l)的9倍，说明上述实施例中的香橼多糖可以刺激raw264.7细胞中no的释放。由于一氧化氮是巨噬细胞产生的效应分子，可保护宿主系统免受病原体侵害，而且其也是关键的第二信使，在病原体感染期间对免疫反应产生重要影响，而香橼多糖促使no释放量明显增加，可以间接得到香橼多糖可以增强细胞免疫活性。

对于促炎细胞因子tnf-α和il-6含量的测定，可以用于评估香橼多糖对巨噬细胞的激活功能。从图14可以看出，与对照组相比，不同浓度(1、5、25、100μg/ml)的香橼多糖均可以显著刺激细胞中tnf-α和il-6的分泌，且这种促进作用具有剂量依赖性。其中，100μg/ml香橼多糖激发的tnf-α和il-6的最高含量分别为2793.70±44.38pg/ml和850.54±30.34pg/ml，分别是对照组的(tnf-α和il-6的最高含量分别为322.26±18.52pg/ml和10.63±0.37pg/ml)8.6倍和80倍。此外，香橼多糖(100μg/ml)与lps组的il-6含量(2803.66±17.86pg/ml)相当，而tnf-α含量则高于lps组(559.35±38.27pg/ml)。进一步通过rt-pcr定量各实验组中的tnf-α和il-6的mrna表达水平(结果如图15)，发现香橼多糖上调了tnf-α和il-6的mrna表达，且上调作用具有剂量依赖性。100μg/ml香橼多糖处理的raw264.7巨噬细胞中tnf-α和il-6的相对表达，分别是对照组的17倍和5882倍。再次证实了上述实施例中的香橼多糖可以激活巨噬细胞并增强机体免疫力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。