一种两步法核酸扩增、检测用的反应管及反应管套装的制作方法

1.本实用新型涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种两步法核酸扩增、检测用的反应管及反应管套装。


背景技术：

2.核酸扩增检测技术是开展分子生物学研究的基础，可用于定性、定量地分析和检测微量核酸，其在临床医学、检验医学、分子生物学、基因组学及食品安全等相关的各个领域发挥着重要的作用，是生命科学发展不可或缺的一种重要检验方法。现有核酸扩增技术可根据是否需要温度循环分为两类：第一类为变温扩增体系，包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)、连接酶链式反应(ligase chain reaction，lrc)等。其中pcr技术因其特异性强，灵敏度高，价格低廉等优点，是目前应用最为广泛的核酸体外扩增技术。但该技术需要特定的仪器，同时对操作人员以及实验条件有一定的专业要求。第二类为等温扩增体系，包括环介导等温扩增技术(loop
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mediated isothermal amplification，lamp)、滚环扩增技术(rolling circle amplification，rca)以及重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)等，该技术无需热循环过程，不需要特殊仪器，但其扩增易产生假阳性。
3.近年来，crispr技术的出现带来了一种更简便灵敏的检测方式。其主要原理是利用cas酶在体系中guide rna的引导下与目标序列结合后，便会切换为激活状态，高效的切割体系内其它的单链dna。在体系内加入含有报告基团的单链dna探针底物后，cas蛋白识别到靶序列的存在，就会切割单链dna探针底物从而释放荧光报告基团产生荧光信号。在目前已知的利用crispr检测的体系中，由于受到反应温度的影响，crispr体系无法在起始时刻就添加到反应体系中，必须等到反应结束后二次开盖再进行后续添加，极易造成严重的气溶胶污染和假阳性问题，并且使得整个检测操作过程变得复杂和繁琐。
4.申请人前期申请的，公开号为cn111334425a的发明专利申请公开了一种核酸扩增结合crispr检测的双系统耦联用反应管、双系统耦联方法，所述双系统耦联用反应管，包括管体及与管体配合密封的盖体，管体的内腔包括下部的反应区，以及上部的储存区；所述储存区设有用于在核酸扩增时暂时存放crispr检测试剂的储存室，以及在核酸扩增完成后将crispr检测试剂从储存室中释放到反应区的释放机构。上述现有技术中要么储存室开口设置，第一步反应完全后通过倾斜、倒置的方式将crispr检测试剂从储存室中释放到反应区，由于储存室开口设置，可能会意外将两步反应的液体混合，影响结果；或者储存室密封，但是通过盖体直接按压使crispr检测试剂从储存室中释放到反应区，容易意外触碰到盖体上对应区域，将crispr检测试剂从储存室中释放到反应区，影响结果。


技术实现要素：

5.本实用新型针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种储存第二反应液的空间为封闭设置，且用于将第二反应液释放的结构不容易被误操作的两步法核酸扩增、检测用
的反应管。
6.一种两步法核酸扩增、检测用的反应管，包括用于加第一反应液的管体及与管体配合密封的盖体，所述盖体包括用于在第一步反应时暂时存放第二反应液的液体盒，所述液体盒的底面具有供第二反应液流入管体的第一开口，所述液体盒的顶面设有用于向液体盒中加入第二反应液的第二开口，加第二反应液前使用密封膜密封第一开口；
7.所述液体盒具有伸入管体中与管体口部插接配合的塞子部，以及位于管体外部的封口部，所述第一开口位于塞子部的底面，所述第二开口位于封口部的顶面；
8.所述反应管还包括用于密封所述第二开口的上盖，所述上盖包括与所述封口部套接配合的套接部，以及设于套接部顶面、可向管体一侧弯折的密封板，所述密封板的底面设有用于在密封板向管体一侧弯折时刺破所述密封膜的刺破针；套接部的上方还设有环绕所述密封板、用于保护密封板的保护环。
9.优选的，所述密封板为向反应管外侧凸出的弧形，密封板的外侧面和/或内侧面间隔设有若干用于减薄密封板的减薄槽。本申请反应管一般使用塑料制备，塑料的密封板通过设置一些减薄槽，使密封板方便弯折，从向外侧凸出弯折成向内侧凸出，从而刺破密封膜，释放第二反应液。
10.更优选的，所有减薄槽呈以密封板中心为圆心的同心圆分布，这样可以通过挤压密封板的中间区域使密封板弯折。
11.进一步优选的，所述减薄槽的横截面至少靠近底面一侧为圆弧槽；最外圈的一个减薄槽设于密封板的内侧面，其余减薄槽均设于密封板的外侧面。圆弧设计相比于带有尖锐角度的设计来说，在弯折过程中不容易折破。而减薄槽设计在密封板的内侧面还是外侧面均能达到方便弯折的目的，弯折时，密封板的最外侧区域与套接部连接处不容易弯折，而中间区域向内侧弯折，所以将最外圈的减薄槽设置在密封板的内侧面，而其余减薄槽均设于密封板的外侧面，这样可以使减薄槽与密封板的弯折情况相适应，弯折时减薄槽是处于收拢状态，不容易将密封板折破。
12.更优选的，所述密封板的内侧面中心区域向外侧凸出形成用于固定安装所述刺破针的安装槽，所述刺破针的一端设有与所述安装槽过盈配合的安装部。刺破针通过安装部卡入到安装槽中固定。
13.优选的，所述刺破针的外周设有沿轴向布置的导流槽。导流槽的设计便于在刺破密封膜后，第二反应液可以顺着导流槽向下流入到管体中。
14.优选的，所述管体的内侧壁与所述塞子部的外侧壁之间设有相互配合的第一环形槽和第一凸环；所述套接部的内侧壁与封口部的外侧壁之间设有相互配合的第二环形槽和第二凸环。环形槽和凸环的设计可以增强密封效果。
15.优选的，所述液体盒的外侧壁、位于所述塞子部与封口部之间设有挡环，装配时，所述管体的顶面与挡环的下表面抵接，所述套接部的底面与挡环的上表面抵接。挡环的设计可以对液体盒与管体之间的配合、以及上盖与液体盒之间的配合进行限位。
16.优选的，所述液体盒的内腔从顶部到底部逐渐减小。本申请中逐渐减小可以是指连续变化的减小，也可以是分段式的减小，只要是有减小的趋势，则便于第二反应液汇聚到液体盒内腔的底部，在刺破密封膜后，方便第二反应液流到管体中。
17.本申请还提供了一种两步法核酸扩增、检测用的反应管套装，包括所述的反应管，
还包括用于挤压密封板使密封板向管体一侧弯折的挤压工具，所述挤压工具包括操作时供一根手指穿过的指套，以及设于指套外周的挤压头；所述挤压头包括使用时伸入保护环内挤压密封板的挤压部，以及通过抵接保护环顶面来限制挤压部伸入保护环内深度的限位部。本申请上盖中保护环的设计，使得手指不容易触碰到密封板，从而能够避免误操作。需要释放第二反应液时，通过使用所述挤压工具来下压密封板，且通过限位部限制下压的行程，防止过压。
18.本实用新型通过将第二反应液密封在液体盒中，反应管倾斜、晃动等情况下也不会影响第二反应液，从而可以由厂家预先向反应管中加好第二反应液，然后再进行运输、销售等。而由于密封板受到保护环的保护，不容易发生误碰密封板从而刺破密封膜的情况，进一步保障预加第二反应液后反应管在运输、销售等过程中的安全，也可以避免使用时的误操作。
附图说明
19.图1为本申请反应管的立体结构示意图。
20.图2为本申请反应管的爆炸结构示意图。
21.图3为本申请反应管的侧视结构示意图。
22.图4为图3中沿a
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a方向的剖视图。
23.图5为本申请反应管的局部剖视图。
24.图6为上盖的剖视图。
25.图7为液体盒的剖视图。
26.图8为刺破针的立体结构示意图。
27.图9为刺破针的侧视结构示意图。
28.图10为图9中沿b
‑
b方向的剖视图。
29.图11为本申请挤压工具下压折弯密封板前的结构示意图。
30.图12为本申请挤压工具下压折弯密封板过程中的结构示意图。
31.图13为本申请挤压工具下压折弯密封板后的结构示意图。
具体实施方式
32.如图1～13所示，一种两步法核酸扩增、检测用的反应管，包括用于加第一反应液的管体1及与管体1配合密封的盖体2，盖体2包括用于在第一步反应时暂时存放第二反应液的液体盒3，液体盒3的底面具有供第二反应液流入管体1的第一开口31，液体盒3的顶面设有用于向液体盒3中加入第二反应液的第二开口32，加第二反应液前使用密封膜密封第一开口31。管体1的整体结构与常规的pcr反应管类似，底部用于加反应液进行反应。
33.如图5和7所示，液体盒3具有伸入管体1中与管体1口部插接配合的塞子部33，以及位于管体1外部的封口部34，第一开口31位于塞子部33的底面，第二开口32位于封口部34的顶面。
34.如图5和6所示，本申请反应管还包括用于密封第二开口32的上盖4，上盖4包括与封口部34套接配合的套接部41，以及设于套接部41顶面、可向管体1一侧弯折的密封板42，密封板42的底面设有用于在密封板42向管体1一侧弯折时刺破密封膜42的刺破针5；套接部
41的上方还设有环绕密封板42、用于保护密封板42的保护环43。
35.密封板42为向反应管外侧凸出的弧形，密封板42的外侧面和/或内侧面间隔设有若干用于减薄密封板42的减薄槽44。本申请反应管一般使用塑料制备，塑料的密封板42通过设置一些减薄槽44，使密封板42方便弯折，从向外侧凸出弯折成向内侧凸出，从而刺破密封膜，释放第二反应液。所有减薄槽44呈以密封板42中心为圆心的同心圆分布，这样可以通过挤压密封板42的中间区域使密封板42弯折。减薄槽44的横截面至少靠近底面一侧为圆弧槽，圆弧设计相比于带有尖锐角度的设计来说，在弯折过程中不容易折破。最外圈的一个减薄槽44设于密封板42的内侧面，其余减薄槽44均设于密封板42的外侧面。而减薄槽44设计在密封板42的内侧面还是外侧面均能达到方便弯折的目的，弯折时，密封板42的最外侧区域与套接部41连接处不容易弯折，而中间区域向内侧弯折，所以将最外圈的减薄槽44设置在密封板42的内侧面，而其余减薄槽44均设于密封板42的外侧面，这样可以使减薄槽44与密封板42的弯折情况相适应，弯折时减薄槽44是处于收拢状态，不容易将密封板42折破。
36.密封板42的内侧面中心区域向外侧凸出形成用于固定安装刺破针5的安装槽45，刺破针5的一端设有与安装槽45过盈配合的安装部51，刺破针5通过安装部51卡入到安装槽45中固定，而刺破针5的另一端为用于刺破密封膜的针尖端。刺破针5的外周设有沿轴向布置的导流槽52，导流槽52的设计便于在刺破密封膜后，第二反应液可以顺着导流槽52向下流入到管体1中，如图8～10所示，刺破针5的外周面上设有相对的两个导流槽52。
37.管体1的内侧壁与塞子部33的外侧壁之间设有相互配合的第一环形槽11和第一凸环35。套接部41的内侧壁与封口部34的外侧壁之间设有相互配合的第二环形槽46和第二凸环36。环形槽和凸环的设计可以增强密封效果。
38.液体盒3的外侧壁、位于塞子部33与封口部34之间设有挡环37，装配时，管体1的顶面与挡环37的下表面抵接，套接部41的底面与挡环37的上表面抵接。挡环37的设计可以对液体盒3与管体1之间的配合、以及上盖4与液体盒3之间的配合进行限位。
39.液体盒3的内腔从顶部到底部逐渐减小。本申请中逐渐减小可以是指连续变化的减小，也可以是分段式的减小，只要是有减小的趋势，则便于第二反应液汇聚到液体盒3内腔的底部，在刺破密封膜后，方便第二反应液流到管体1中。
40.本申请还提供了一种两步法核酸扩增、检测用的反应管套装，包括上述结构的反应管，还包括用于挤压密封板42使密封板42向管体1一侧弯折的挤压工具6，如图11～13所示，挤压工具6包括操作时供一根手指穿过的指套61，以及设于指套61外周的挤压头；挤压头包括使用时伸入保护环43内挤压密封板42的挤压部62，以及通过抵接保护环43顶面来限制挤压部62伸入保护环43内深度的限位部63。本申请上盖4中保护环43的设计，使得手指不容易触碰到密封板42，从而能够避免误操作。需要释放第二反应液时，通过使用挤压工具6来下压密封板42，且通过限位部63限制下压的行程，防止过压。
41.使用时，先将刺破针5与上盖4插接固定，然后将第一步反应用的第一反应液加入到管体1中，第二步反应时需要添加到第一步反应产物中的第二反应液加入液体盒3中，液体盒3的第一开口31在加液前需要用密封膜密封，然后将上盖4与液体盒3装配密封，再与管体1组装好；反应时，进行第一步反应，第一步反应完成后，使用挤压工具6将密封板42下压使刺破针5刺破密封膜，第二反应液向下流入到管体1中与第一步反应的产物混合，然后进行第二步反应。对于lamp
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crispr耦联的两步法检测来说，第一步lamp反应包括了反应试剂
和待检测的对象，待检测的对象为作为模板的核酸样品，第二步crispr检测则用于检测lamp反应的结果。本申请反应管可以在出厂销售前，先将第二步反应用的第二反应管预装在液体盒3中，第一步反应的第一反应液除了作为模板的检测对象外，其他试剂也可以预装在管体1中，然后进行输送、销售等，检测时，只需要将盖体2从管体1中拔出，然后加入模板即可。