重组血红蛋白及其制备和使用方法与流程

相关申请的交叉引用本申请要求2019年2月1日提交的美国临时申请号62/799,829的优先权的权益，该美国临时申请的内容出于所有目的在此以引用方式整体并入。本公开总体上涉及重组血红蛋白及其制备、纯化和使用方法。本公开进一步涉及包含重组血红蛋白的药物组合物和使用基于重组血红蛋白的药物组合物治疗氧缺乏相关疾病(诸如中风、出血性休克、外周动脉疾病(pad)和急性高原病(ams))以及其他疾病或病状(诸如癌症和帕金森氏病(parkinson’sdisease)(pd))的方法。
背景技术：
：血红蛋白(hb)是富集于红血细胞(红细胞)中的携氧蛋白质，其经由通过循环系统的血液流动向机体组织递送氧。携氧蛋白质包含四条缔合的多肽链(两条α链和两条β链)，并带有被称为血红素的基团，血红素的铁原子暂时结合到肺中的氧，并将其释放到全身。血红蛋白还可结合一氧化碳(co)以形成(碳单氧基)血红蛋白(hbco)，这可以减少可用于向机体递送氧的hb的总量。缺氧在癌症中很常见，并且可通过使肿瘤细胞丧失这些药剂的细胞毒性活性所必需的氧，导致对电离辐射和化学疗法的抗性。缺氧还可通过一种或多种间接机制(包括蛋白质组变化和基因组变化)降低肿瘤对放射疗法和化学疗法的敏感性。从红细胞中提取的血红蛋白已被用作用于向缺氧组织递送氧的血液替代品。然而，使用从红细胞纯化的未经修饰的无细胞hb可能会受到若干限制，诸如污染、供应限制、由于辅因子2,3-双磷酸甘油酸(2,3-dpg)损失所致的氧亲和力增加、以及hb四聚体解离为αβ二聚体(其通过肾过滤被清除并且可引起长期的肾损害)。开发改善的重组血红蛋白可解决部分或全部上述问题。然而，现有的重组血红蛋白可能具有低的携氧能力，并且用于制备重组血红蛋白的现有方法是费力的，并且可能具有差的血红蛋白的可溶产率与高的杂质百分比。例如，原卟啉-ix(ppix)(常规重组血红蛋白产生中的常见副产物)可损害重组血红蛋白的总体氧载体功能。用于制备重组血红蛋白的现有方法通常包括热处理步骤以去除杂质，诸如ppix。然而，在制备方法中并入热处理步骤会增加成本并降低蛋白质产品的产率。另外，为了维持重组血红蛋白在热处理和其下游过程期间的稳定性，重组血红蛋白需要co。然而，由于co在最终产品中是不期望的，因此对于现有的制备方法通常需要co去除步骤，这也使得现有的方法成本高且耗时。因此，需要具有高携氧能力的改善的重组血红蛋白，并且还需要以高产率和高纯度制备重组血红蛋白的简化方法。技术实现要素：本公开总体上涉及重组血红蛋白及其使用和制备方法。本文所述的重组血红蛋白可具有改善的携氧能力。所公开的重组血红蛋白可用于治疗疾病，诸如癌症、中风、出血性休克、急性高原病(ams)、外周动脉疾病(pad)和帕金森氏病(pd)。本公开还总体涉及制备本文所述重组血红蛋白的方法。使用本文所述方法制备的重组血红蛋白可具有降低量的ppix、很少或没有hbco，以及最佳的血红素/蛋白质比和四聚体/二聚体分布。在本公开的第一方面，提供了包含二-α链和两条β链的重组血红蛋白，其中所述二-α链包含与seqidno:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列，其中seqidno:1的1位和143位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，seqidno:1的29位和171位处的氨基酸必须是苯丙氨酸，并且seqidno:1的58位和200位处的氨基酸必须是谷氨酰胺。在本公开的第一方面的第一实施方案中，二-α链包含与seqidno:1具有至少99.29％序列同源性的多肽序列。在本公开的第一方面的第二实施方案中，二-α链包含与seqidno:1具有至少99.64％序列同源性的多肽。在本公开的第一方面的第三实施方案中，二-α链是具有seqidno:1的多肽序列。在本公开的第一方面的第四实施方案中，两条β链中的每一条都包含与seqidno:2具有至少97.94％序列同源性的多肽序列，其中1位处的氨基酸必须是甲硫氨酸。在本公开的第一方面的第五实施方案中，两条β链中的每一条都是具有seqidno:2的多肽序列。在本公开的第一方面的第六实施方案中，两条β链中的每一条都包含与seqidno:3具有至少97.94％序列同源性的多肽序列，其中1位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，82位处的氨基酸必须是天冬氨酸，并且108位处的氨基酸必须是赖氨酸。在本公开的第一方面的第七实施方案中，两条β链中的每一条都包含与seqidno:3具有至少98.63％序列同源性的多肽序列。在本公开的第一方面的第八实施方案中，两条β链中的每一条都包含与seqidno:3具有至少99.31％序列同源性的多肽序列。在本公开的第一方面的第九实施方案中，两条β链中的每一条都包含seqidno:3的多肽序列。在本公开的第二方面，提供了包含上述重组血红蛋白和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。在本公开的第三方面，提供了治疗有需要的受试者中的氧缺乏相关疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物的步骤。在本公开的第三方面的第一实施方案中，氧缺乏相关疾病包括癌症、中风、出血性休克、急性高原病(ams)、外周动脉疾病(pad)或帕金森氏病(pd)。在本公开的第四方面，提供了产生重组血红蛋白的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含编码二-α链的多核苷酸和编码β链的多核苷酸的宿主细胞；以及(b)诱导含有编码所述二-α链的所述多核苷酸和编码所述β链的所述多核苷酸的所述宿主细胞表达重组血红蛋白，由此产生重组血红蛋白。在本公开的第四方面的第一实施方案中，编码二-α链的多核苷酸和编码β链的多核苷酸分别包含seqidno:4的多核苷酸序列和seqidno:5的多核苷酸序列。在本公开的第四方面的第二实施方案中，编码二-α链的多核苷酸和编码β链的多核苷酸分别包含seqidno:4的多核苷酸序列和seqidno:6的多核苷酸序列。在本公开第四方面的第三个实施方案中，宿主细胞选自由以下组成的组：具有λde3的jm109大肠杆菌(e.coli)细菌菌株、没有λde3的bl21-ai大肠杆菌细菌菌株和没有λde3的shuffle大肠杆菌细菌菌株。在本公开的第四方面的第四实施方案中，宿主细胞进一步包含编码hemh的多核苷酸。在本公开的第四方面的第五实施方案中，宿主细胞进一步包含编码血红素转运蛋白的多核苷酸。在本公开的第四方面的第六实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：(a)在诱导所述宿主细胞表达重组血红蛋白的所述步骤之后，使所述宿主细胞破裂以获得包含所述重组血红蛋白的溶液；以及(b)纯化所述重组血红蛋白以获得纯化的重组血红蛋白。在本公开的第五方面，提供了用于产生本公开的第一方面的重组血红蛋白的系统，所述系统包括：包含以下多核苷酸的大肠杆菌或非大肠杆菌宿主细胞：编码hemh的多核苷酸；编码血红素转运蛋白的多核苷酸；编码二-α链的多核苷酸；和编码β链的多核苷酸，其中所述二-α链包含与seqidno:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列，其中seqidno:1的1位和143位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，seqidno:1的29位和171位处的氨基酸必须是苯丙氨酸，并且seqidno:1的58位和200位处的氨基酸必须是谷氨酰胺；并且所述β链包含与seqidno:2具有至少99.31％序列同源性的多肽序列，其中1位处的氨基酸必须是甲硫氨酸；或与seqidno:3具有至少97.94％序列同源性的多肽序列，其中1位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，82位处的氨基酸必须是天冬氨酸，并且108位处的氨基酸必须是赖氨酸。本领域技术人员将了解，本文所述的公开内容易于进行除了具体描述的那些之外的变化和修改。通过阅读随后的描述，本公开的其他方面和优点对于本领域技术人员来说将是显而易见的。附图简单说明图1显示了根据本文所述的某些实施方案的二-α链(seqidno:1和seqidno:11)以及β链(seqidno:2、seqidno:3和seqidno:12)的多肽序列。图2a显示质粒图谱，其中pacycduet-ct是携带chua基因和用于表达tonb的基因的载体，并且pet-hemhm1-tb是携带用于表达hemh突变体和tb的序列的通用质粒，其中tb可以是用于表达tbn、tbm1或tbm9的序列。图2b显示图2a中的质粒在不同细胞株中的tbn、tbm1和tbm9表达的sds-page分析，其中#83是在没有λde3的shuffle大肠杆菌细菌菌株中表达的tbm1的结果，#84是在没有λde3的shuffle大肠杆菌细菌菌株中表达的tbm9的结果，#85是在没有λde3的jm109t7ctcrispr/cas9大肠杆菌细菌菌株中表达的tbm1的结果，#86是在没有λde3的jm109t7ctcrispr/cas9大肠杆菌细菌菌株中表达的tbm9的结果，#43是在具有λde3的jm109大肠杆菌细菌菌株中表达的tbn的结果。图2c显示图2a中的质粒在不同细胞株中的tbn、tbm1和tbm9表达的sds-page分析，其中#83是在没有λde3的shuffle大肠杆菌细菌菌株中表达的tbm1的结果，#84是在没有λde3的shuffle大肠杆菌细菌菌株中表达的tbm9的结果，#85是在没有λde3的jm109t7ctcrispr/cas9大肠杆菌细菌菌株中表达的tbm1的结果，#86是在没有λde3的jm109t7ctcrispr/cas9大肠杆菌细菌菌株中表达的tbm9的结果，#43是在具有λde3的jm109大肠杆菌细菌菌株中表达的tbn的结果。图3a显示小鼠模型中的肝氧水平测量的图示。图3b显示在施用tbn、tbm1、tbm9、yq(牛富马酰交联hb)和作为对照的ra-缓冲液后180min内小鼠模型的肝氧水平的变化。图4a显示超高效液相色谱(uplc)色谱图，其显示使用包含tbn的核苷酸序列的先前质粒表达的纯化蛋白质的血红素和ppix水平(图4a)。图4b显示uplc色谱图，其显示使用包含hemh突变体、血红素转运蛋白系统(chua和tonb)和tbn的核苷酸序列的新的改善的质粒表达的纯化蛋白质的血红素和ppix水平(图4b)。图5a显示根据本文所述的某些实施方案的不同重组人血红蛋白(tbn、tbm1和tbm9)的氧平衡曲线。图5b显示根据本文所述的某些实施方案的具有和没有2,3-dpg的不同重组人血红蛋白(tbn、tbm1和tbm9)的p50值的表。图5c显示根据本文所述的某些实施方案的具有和没有2,3-dpg的tbm1的氧平衡曲线。图6显示了根据本文所述的某些实施方案的纯化流程图。图7显示根据本文所述的某些实施方案的hemh突变体多核苷酸seqidno:8(顶部)和hemh突变体蛋白质seqidno:13(底部)。图8显示根据本文所述的某些实施方案的chua多核苷酸seqidno:9(顶部)和chua蛋白质seqidno:14(底部)。图9显示根据本文所述的某些实施方案的tonb多核苷酸seqidno:10(顶部)和tonb蛋白质seqidno:15(底部)。图10显示了显示tbn、tbm1和tbm9的经叠氮化物诱导的氧化速率(kaz)值的图形(顶部)和表(底部)。图11显示体外抑制4t1乳腺癌细胞增殖的重组人血红蛋白tbm1和tbm9的mtt测定结果。图12a显示体内抑制4t1乳腺癌细胞生长的重组人血红蛋白(tbm1)。图12b显示了显示重组人血红蛋白(tbm1)体内抑制4t1乳腺癌细胞生长的条形图。图13显示使用盐水和重组人血红蛋白(tbm1)的鼠pad模型结果的结果。图14显示在balb/c小鼠和icr小鼠中用重组人血红蛋白(tbm1)处理后的体重结果。具体实施方式本公开涉及具有高携氧能力的重组血红蛋白。本文所述的重组血红蛋白包含二-α链和两条β链。术语定义本文所用术语的定义意在并入生物
技术领域：
中对于每个术语公认的现有技术的定义。在适当情况下，提供举例说明。除非在特定情况下单独或作为更大组的一部分而受到其他限制，否则这些定义适用于本说明书通篇使用的术语。如本文所用的术语“一种或多种重组血红蛋白”是指分子大小为至少大约65kda的血红蛋白分子和/或其变体，并且通过任何标准分子生物学技术合成，而不是从任何动物或人来源分离或纯化。如本文所用的术语“蛋白质”或“多肽”指示由两个或更多个氨基酸单体和/或其类似物构成的有机聚合物。术语“多肽”包括任何长度的氨基酸聚合物，包括全长蛋白质和肽，以及其类似物和片段。三个或更多个氨基酸的多肽也被称为寡肽。如本文所用，术语“氨基酸”、“氨基酸单体”或“氨基酸残基”是指二十种天然存在的氨基酸中的任何一种，包括具有非天然侧链的合成氨基酸，并且包括d和l旋光异构体。可互换使用的术语“氨基酸类似物”和“类似物”是指一种氨基酸，其中一个或多个单个原子已被不同的原子、同位素或不同的官能团取代，但其他方面与其天然氨基酸类似物相同并且具有与其天然氨基酸类似物类似的化学和/或物理性质。如本文所用，术语“变体”是指不同于参考多肽或多核苷酸序列但保留其基本性质的多肽或多核苷酸序列。通常，变体与参考多肽或多核苷酸序列在总体上非常相似，并且在许多区域中完全相同。变体可例如包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本多肽序列的氨基酸序列。或者或另外，变体可包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本多肽序列的氨基酸序列。在这种情况下，非保守氨基酸取代优选不干扰或抑制功能性变体的生物活性。非保守氨基酸取代可增强变体的生物活性，使得变体的生物活性与亲本多肽相比增加。如本文所用的术语“氨基酸修饰”指示氨基酸的插入、取代或缺失等。所述多肽的氨基酸取代可以是保守的氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学性质的一种氨基酸被交换为具有相同或相似化学或物理性质的另一氨基酸的氨基酸取代。例如，保守氨基酸取代可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸取代另一酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如，asp或glu)、具有非极性侧链的氨基酸取代具有非极性侧链的另一氨基酸(例如，ala、gly、val、ile、leu、met、phe、pro、trp、cys、val等)、碱性/带正电荷的极性氨基酸取代另一碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如lys、his、arg等)、具有极性侧链的不带电荷氨基酸取代具有极性侧链的另一不带电荷氨基酸(例如，asn、gln、ser、thr、tyr等)、具有β-分支侧链的氨基酸取代具有β-分支侧链的另一氨基酸(例如，ile、thr和val)、具有芳族侧链的氨基酸取代具有芳族侧链的另一氨基酸(例如，his、phe、trp和tyr)等。如本文所用的术语“核苷酸修饰”是指核苷酸的插入、取代、缺失等。当参考多肽或多核苷酸序列使用时，术语“序列同源性百分比”是指多核苷酸与多肽之间的比较，并且通过在比较窗口内比较两个最佳比对的序列来确定，其中与用于两个序列的最佳比对的参考序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口内的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失(即，缺口)。通过以下方式计算百分比：确定两个序列中都存在相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中较长序列的位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同源性的百分比。使用本领域已知的多种序列比较算法和程序中的任何一种来评价同源性。此类算法和程序包括但决不限于tblastn、blastp、fasta、tfasta和clustalw(pearson和lipman,1988,proc.natl.acad.sci.usa85(8):2444-2448；altschul等,1990,j.mol.biol.215(3):403-410；thompson等,1994,nucleicacidsres.22(2):4673-4680；higgins等1996,methodsenzymol.266:383-402；altschul等,1990,j.mol.biol.215(3):403-410；altschul等,1993,naturegenetics3:266-272)。在某些实施方案中，使用本领域众所周知的基本局部比对搜索工具(“blast”)来评价蛋白质和核酸序列同源性(参见例如karlin和altschul,1990,proc.natl.acad.sci.usa87:2267-2268；altschul等,1990,j.mol.biol.215:403-410；altschul等,1993,naturegenetics3:266-272；altschul等,1997,nuc.acidsres.25:3389-3402)。如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指减少或改善病症和/或与其相关的症状。应当了解，尽管没有排除，但治疗疾病或病况不要求完全消除该疾病、病况或与其相关的症状。在某些实施方案中，治疗包括预防病症或病状和/或与其相关的症状。如本文所用，术语“中风”指示其中到脑的不良血流导致细胞死亡的医学病况。其包括但不限于缺血性中风和出血性中风。如本文所用，术语“出血性休克”是指组织灌注减少、导致细胞功能所必需的氧和营养素递送不足的病况。本文所用的术语“急性高原病”是指当暴露于具有低水平氧和降低的空气压力的高海拔时产生的病况。如本文所用的术语“缺血性疾病”或“缺血”是指特征在于机体内任何组织的氧合减少的疾病和/或病况，诸如但不限于缺血性心脏病、短暂性缺血发作、心脏缺血、中风、再灌注损伤、肠道缺血、肠缺血、外周动脉疾病、危重肢体缺血、肠系膜缺血、脑缺血、腿缺血、心肌梗塞、外周血管疾病、冠状动脉疾病、绞痛、伤口愈合、肾动脉疾病、糖尿病性溃疡愈合、充血性心力衰竭和肝缺血。缺血可由多种病况引起，包括但不限于贫血、中风和动脉粥样硬化。多种疾病由缺血引起，包括例如脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、肢体缺血、心肌缺血和缺血性心肌病变。如本文所用的术语“外周动脉疾病”或“pad”是指外周动脉(诸如为腿、胃、臂和/或头服务的那些)变窄的病况。pad包括由改变动脉结构和功能的动脉粥样硬化、血栓栓塞和炎性过程引起的宽范围的血管疾病。pad最常见的原因是动脉粥样硬化。本文所用的术语“p50值”指示血红蛋白50％饱和的氧张力。p50值与底物亲和力负相关；较低的值对应于较高的亲和力，反之亦然。如本文所用的术语“携氧能力”指示组合物携氧的能力。携氧能力包括但不限于两个方面：当在广泛失血(例如，出血性休克)导致的组织缺氧的情况下需要快速供氧时，使用含有具有较低氧亲和力的重组血红蛋白的组合物。较低的氧亲和力意味着该材料可比具有较高氧亲和力的材料更容易地将氧“卸载”到靶标。具有较高氧亲和力的组合物可用作癌症治疗中的供氧辅助疗法，其中在该情况下期望较慢的氧递送速率。“改善的的携氧能力”意指由组合物所携载氧的水平增加，而不管快速供氧或氧的低递送。术语“共转化(co-transform、co-transforming、共转化co-transformed)”等是指将超过一种带有外源dna的质粒或载体同时转移到宿主细胞中的过程。宿主细胞通常包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。用于接受带有外源dna的质粒或载体的任何其他合理的宿主细胞也在本公开的预期之内。用于将dna构建体转化到宿主细胞中的方法包括但不限于化学转化、电穿孔或粒子轰击。用于将dna构建体转化到宿主细胞中的任何其他合理方法也在本公开的预期之内。如本文所用，术语“质粒”、“表达质粒”、“载体”、“dna构建体”等在本文中可互换用于指携带一个或多个目的外源dna序列以及其他功能性dna片段和/或位点(诸如启动子片段、限制位点、5’引物位点、3’引物位点、复制起点区段、抗生素抗性基因区段、可选标志物区段等)的遗传结构。这些遗传结构通常是(但不总是)环状dna分子，它们与染色体dna物理分离，并且可独立复制。如本文所用的术语“外源dna”、“目的外源dna序列”等是指源自宿主细胞外部的脱氧核糖核酸，包括但不限于编码特定目的蛋白质或其亚基的基因。如本文所用的术语“重组血红蛋白表达质粒”可指携带编码一条二-α链的多核苷酸序列的质粒、携带编码一条或两条β链的多核苷酸序列的质粒、或携带编码二-α链和β链的多核苷酸序列的质粒。如本文所用的术语“hemh”是指催化血红素产生的任何酶，诸如亚铁螯合酶。如本文所用的术语“血红素转运蛋白”是指促进血红素和/或铁的摄取的蛋白质，并且此类蛋白质包括但不限于chua、tonb、血红素载体蛋白质1(hcp1)、二价金属转运蛋白1(dmt1)、粘脂蛋白-1(也被称为trpml1)、hrg1和血色素结合蛋白。如本文所用的术语“hemh质粒”是指携带编码催化血红素产生的任何酶(诸如亚铁螯合酶)的多核苷酸序列的质粒，并且所述多核苷酸可包含一个或多个核苷酸修饰。如本文所用的术语“一种或多种血红素转运蛋白质粒”是指一种或多种携带一个或多个多核苷酸序列的质粒，所述多核苷酸序列编码一种或多种促进血红素和/或铁的摄取的蛋白质，并且此类蛋白质包括但不限于chua、tonb、血红素载体蛋白质1(hcp1)、二价金属转运蛋白1(dmt1)、粘脂蛋白-1(也被称为trpml1)、hrg1和血色素结合蛋白。二-α链可包含与seqidno:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列。与seqidno:1具有至少98.93％序列同源性的多肽可指具有关于seqidno:1的至多三个氨基酸修饰(即零个、一个、两个或三个氨基酸修饰)的多肽。在某些实施方案中，二-α链包含与seqidno:1具有至少99.29％序列同源性的多肽序列。具有至少99.29％序列同源性的多肽可具有关于seqidno:1的至多两个氨基酸修饰，即零个、一个或两个氨基酸修饰。在某些实施方案中，二-α链包含与seqidno:1具有至少99.64％序列同源性的多肽序列。具有至少99.64％序列同源性的多肽可具有关于seqidno:1的至多一个氨基酸修饰，即零个或一个氨基酸修饰。在某些实施方案中，二-α链包含seqidno:1的多肽序列。在某些实施方案中，二-α链由seqidno:1的多肽序列组成。一个、两个或三个氨基酸修饰可发生在存在于seqidno:1中除了seqidno:1的1位、29位、58位、143位、171位和200位之外的任何氨基酸处，其中seqidno:1的1位和143位必须是甲硫氨酸，seqidno:1的29位和171位处的氨基酸必须是苯丙氨酸，并且seqidno:1的58位和200位处的氨基酸必须是谷氨酰胺。二-α链的多肽序列可含有连接第一α亚单位的n末端与第二α亚单位的c末端的接头，或者第一α亚单位的n末端直接连接到第二α亚单位的c末端。在接头呈现于二-α链中的情况下，接头可以是选自由甘氨酸和丝氨酸组成的组的一个或多个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头是(gly-ser)n、(gly-gly-gly-ser)n、(gly-gly-ser-gly)n、(gly-gly-gly-gly-ser)n、(gly-gly-ser)n、(gly-ser)n或glyn，其中n是1-10。在某些实施方案中，接头是glyn接头，其中n是1-4。在某些实施方案中，接头是gly。两条β链中的每一条可包含与seqidno:2具有至少97.94％序列同源性的多肽序列。具有至少97.94％序列同源性的多肽可具有关于seqidno:2的至多三个氨基酸修饰，即零个、一个、两个或三个氨基酸修饰。在某些实施方案中，两条β链中的每一条都包含与seqidno:2具有至少98.63％序列同源性的多肽序列。具有至少98.63％序列同源性的多肽可具有关于seqidno:2的至多两个氨基酸修饰，即零个、一个或两个氨基酸修饰。在某些实施方案中，两条β链中的每一条都包含与seqidno:2具有至少99.31％序列同源性的多肽序列。具有至少99.31％序列同源性的多肽可具有关于seqidno:2的至多一个氨基酸修饰，即零个或一个氨基酸修饰。在某些实施方案中，两条β链中的每一条都包含seqidno:2的多肽序列。在某些实施方案中，一个、两个或三个氨基酸修饰可发生在存在于seqidno:2中除了seqidno:2的1位(其必须是甲硫氨酸)之外的任何氨基酸处。在某些实施方案中，两条β链中的每一条可包含与seqidno:3具有至少97.94％序列同源性的多肽序列。具有至少97.94％序列同源性的多肽可指具有关于seqidno:3的至多三个氨基酸修饰(即零个、一个、两个或三个氨基酸修饰)的多肽。在某些实施方案中，两条β链中的每一条都包含与seqidno:3具有至少98.63％序列同源性的多肽序列。具有至少98.63％序列同源性的多肽可具有关于seqidno:3的至多两个氨基酸修饰，即零个、一个或两个氨基酸修饰。在某些实施方案中，两条β链中的每一条都包含与seqidno:3具有至少99.31％序列同源性的多肽序列。具有至少99.31％序列同源性的多肽可具有关于seqidno:3的至多一个氨基酸修饰，即零个或一个氨基酸修饰。在某些实施方案中，两条β链中的每一条都包含seqidno:3的多肽序列。一个、两个或三个氨基酸修饰可发生在存在于seqidno:3中除了seqidno:3的1位、82位和108位之外的任何氨基酸处，其中seqidno:3的1位必须是甲硫氨酸，seqidno:3的82位必须是天冬氨酸，并且seqidno:3的108位必须是赖氨酸。具有seqidno:11的多肽序列的二-α链和具有seqidno:12的多肽序列的两条β链形成重组血红蛋白tbn。具有seqidno:1的多肽序列的二-α链和具有seqidno:2的多肽序列的两条β链形成重组血红蛋白tbm1。具有seqidno:1的多肽序列的二-α链和具有seqidno:3的多肽序列的两条β链形成重组血红蛋白tbm9。在相同条件下制备的tbn、tbm1和tbm9的ppix浓度列于表1中。p50水平、四聚体纯度、高铁血红蛋白(met-hb)％和血红素/蛋白质比示于表2中。用于制备本文所述的重组血红蛋白的方法是简化的和成本有效的。不希望受限于理论，相信二-α链和β链的突变导致重组血红蛋白的结构改变，这影响并入血红素和ppix的动力学，并最终改变纯化的重组血红蛋白中ppix的百分比。表1.不同纯化重组血红蛋白中的ppix％(*ppix％值是来自五个批次的平均值)表2.经纯化重组血红蛋白的性质本公开还涉及表达、发酵和纯化本文所述重组血红蛋白的方法。在某些实施方案中，所述方法包括在宿主细胞中共表达编码本文所述的重组血红蛋白的质粒、亚铁螯合酶(hemh)质粒和血红素转运蛋白质粒。检测表3中所列的不同宿主细胞，并且在所述宿主细胞中，jm109(de3)(具有λde3)(即具有λde3的jm109大肠杆菌细菌菌株)、bl21-t7或ai大肠杆菌细菌菌株(没有λde3)和t7感受态大肠杆菌(没有λde3)(即没有λde3的shuffle大肠杆菌细菌菌株)具有最佳的产率和质量。这四种宿主细胞易于缩放，可快速表达在其内转化的质粒，非常便宜，需要简单的培养条件，并且已建立调控跟踪记录。hemh质粒可以是野生型或含有某些突变。可通过将大肠杆菌血红素利用基因(chua)插入载体中来构建血红素转运蛋白质粒。chua基因编码69kda外膜蛋白质，该蛋白质促进大肠杆菌中血红素的摄取。chua对血红素的摄取取决于命名为tonb的内膜蛋白质。因此，本文所述的方法优选包括将重组血红蛋白质粒、hemh质粒、chua质粒和tonb质粒共转化到所选宿主细胞中的步骤，即具有λde3的jm109大肠杆菌细菌菌株、没有λde3的bl21-t7或ai大肠杆菌细菌菌株和没有λde3的shuffle大肠杆菌细菌菌株。或者，所述方法还可将单独的chua质粒与重组血红蛋白质粒和hemh质粒一起共转化到所选宿主细胞中。还可通过crispr/cas9基因组编辑方法将编码亚铁螯合酶(hemh)和血红素转运蛋白的基因插入大肠杆菌细菌菌株的基因组中，以内源表达亚铁螯合酶(hemh)和血红素转运蛋白。通过该方法，将bl21-t7和jm109-t7大肠杆菌菌株修饰为bl21-t7-ct(crispr/cas9)和jm109-t7-ct(crispr/cas9)细菌菌株，以表达重组血红蛋白。表3.不同的宿主细胞(y：是，n：否)所述方法进一步包括纯化步骤，所述纯化步骤有利地不需要加热步骤，并且不使用一氧化碳。纯化步骤示于图6中。使用本文所述方法制备的重组血红蛋白可具有表1中所示的降低量(例如小于1％(以重量计))的原卟啉-ix(ppix)。在某些实施方案中，使用本文所述方法制备的重组血红蛋白具有0.08％到1％、0.11％到1％、0.08％到0.20％、0.08％到0.15％或0.08％到0.11％(以重量计)的ppix。因此，与用于重组血红蛋白制备的现有方法相比，本文所述的方法更简单，并且可产生更高产率的具有降低杂质水平的可溶性重组血红蛋白。本公开进一步涉及包含本文所述的重组血红蛋白和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物包含其他赋形剂，诸如氨基酸和糖。本公开进一步涉及编码如本文所述的二-α链的多核苷酸序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码二-α链，所述二-链包含与seqidno:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列，其中seqidno:1的1位和143位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，seqidno:1的29位和171位处的氨基酸必须是苯丙氨酸，并且seqidno:1的58位和200位处的氨基酸必须是谷氨酰胺。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码二-α链，所述二-链包含与seqidno:1具有至少99.29％序列同源性的多肽序列，其中seqidno:1的1位和143位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，seqidno:1的29位和171位处的氨基酸必须是苯丙氨酸，并且seqidno:1的58位和200位处的氨基酸必须是谷氨酰胺。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码二-α链，所述二-链包含与seqidno:1具有至少99.64％序列同源性的多肽序列，其中seqidno:1的1位和143位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，seqidno:1的29位和171位处的氨基酸必须是苯丙氨酸，并且seqidno:1的58位和200位处的氨基酸必须是谷氨酰胺。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码包含seqidno:1的多肽序列的二-α链。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码由seqidno:1的多肽序列组成的二-α链。本公开进一步涉及编码如本文所述的β链的多核苷酸序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码β链，所述β链包含与seqidno:2具有至少97.94％序列同源性的多肽序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码β链，所述β链包含与seqidno:2具有至少98.63％序列同源性的多肽序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码β链，所述β链包含与seqidno:2具有至少99.31％序列同源性的多肽序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码包含多肽序列的β链，所述多肽序列包含seqidno:2的多肽序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码包含多肽序列的β链，所述多肽序列由seqidno:2的多肽序列组成。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码β链，所述β链包含与seqidno:3具有至少97.94％序列同源性的多肽序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码β链，所述β链包含与seqidno:3具有至少98.63％序列同源性的多肽序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码β链，所述β链包含与seqidno:3具有至少99.31％序列同源性的多肽序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码包含多肽序列的β链，所述多肽序列包含seqidno:3的多肽序列。在某些实施方案中，氨基酸修饰可发生在存在于seqidno:3中除了seqidno:3的1位、82位和108位之外的任何氨基酸处，其中seqidno:3的1位必须是甲硫氨酸，seqidno:3的82位必须是天冬氨酸，并且seqidno:3的108位必须是赖氨酸。在某些实施方案中，多核苷酸序列编码如本文所述的二-α链和如本文所述的β链。在某些实施方案中，二-α链包含与seqidno:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列，其中seqidno:1的1位和143位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，seqidno:1的29位和171位处的氨基酸必须是苯丙氨酸，并且seqidno:1的58位和200位处的氨基酸必须是谷氨酰胺；并且两条β链包含与seqidno:2具有至少99.31％序列同源性的多肽序列，其中1位处的氨基酸必须是甲硫氨酸；或与seqidno:3具有至少97.94％序列同源性的多肽序列，其中1位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，82位处的氨基酸必须是天冬氨酸，并且108位处的氨基酸必须是赖氨酸。可使用一种或多种载体将本文所述的多核苷酸序列引入期望的细胞中。载体通常包括另外的序列，包括指导载体在细胞中繁殖或将载体的一部分插入细胞基因组中的序列，以及允许个体筛选载体存在的基因。载体的常见示例包括设计成插入细胞基因组中的质粒、人工染色体、病毒和线性多核苷酸片段。载体是本领域普通技术人员熟知的工具，并且本领域普通技术人员可容易地在文献中或在诸如atcc的生物库中发现用于特定生物体的适当载体。在某些实施方案中，本文提供一种载体，其包含编码本文所述的二-α链和如本文所述的β链中的至少一条的多核苷酸序列。在某些实施方案中，载体是设计成插入细胞基因组中的质粒、人工染色体、病毒或线性多核苷酸片段。本公开进一步涉及用于产生如本文所述的重组血红蛋白的系统，所述系统包括：大肠杆菌或非大肠杆菌宿主细胞，其包含：编码hemh的多核苷酸；编码血红素转运蛋白的多核苷酸；编码二-α链的多核苷酸；和编码β链的多核苷酸；其中所述二-α链包含与seqidno:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列，其中seqidno:1的1位和143位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，seqidno:1的29位和171位处的氨基酸必须是苯丙氨酸，并且seqidno:1的58位和200位处的氨基酸必须是谷氨酰胺；并且所述β链包含与seqidno:2具有至少99.31％序列同源性的多肽序列，其中1位处的氨基酸必须是甲硫氨酸；或与seqidno:3具有至少97.94％序列同源性的多肽序列，其中1位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，82位处的氨基酸必须是天冬氨酸，并且108位处的氨基酸必须是赖氨酸。在某些实施方案中，编码hemh的多核苷酸；编码血红素转运蛋白的多核苷酸；编码二-α链的多核苷酸；和编码β链的多核苷酸存在于一种或多种选自由以下组成的组的载体中：设计成插入细胞基因组中的质粒、人工染色体、病毒和线性多核苷酸片段。在某些实施方案中，使用crispr/cas9将编码hemh的多核苷酸；编码血红素转运蛋白的多核苷酸；编码二-α链的多核苷酸；和编码β链的多核苷酸插入宿主细胞基因组中。在某些实施方案中，编码hemh的多核苷酸；编码血红素转运蛋白的多核苷酸；编码二-α链的多核苷酸；和编码β链的多核苷酸存在于宿主细胞中的一种或多种质粒中。在某些实施方案中，用于产生如本文所述的重组血红蛋白的系统包括：大肠杆菌或非大肠杆菌宿主细胞，其包含：第一质粒，所述第一质粒包含编码hemh、二-α链和两条β链的多核苷酸；和第二质粒，其包含编码血红素转运蛋白的多核苷酸；其中所述二-α链包含与seqidno:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列，其中seqidno:1的1位和143位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，seqidno:1的29位和171位处的氨基酸必须是苯丙氨酸，并且seqidno:1的58位和200位处的氨基酸必须是谷氨酰胺；并且所述两条β链包含与seqidno:2具有至少99.31％序列同源性的多肽序列，其中1位处的氨基酸必须是甲硫氨酸；或所述两条β链包含与seqidno:3具有至少97.94％序列同源性的多肽序列，其中1位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，82位处的氨基酸必须是天冬氨酸，并且108位处的氨基酸必须是赖氨酸。本文所述的载体可进一步包含一种或多种编码启动子、操纵子和可选标志物的多核苷酸。在本文所述的载体中可使用任何启动子。适当的启动子的选择完全在本领域普通技术人员的技能范围内。示例性的启动子包括但不限于lac、trp、tac、trc、ara、arab、t5、t7和t7lac。操纵子可包括lac操纵子、λ操纵子、trp操纵子、gal操纵子、ara操纵子和arg操纵子。如果期望，对应的启动子可与其操纵子功能相关。可选标志物可以是经通在特定条件下允许对或针对分子或含有该分子的细胞进行选择的多核苷酸序列。这些标志物可编码活性，诸如但不限于rna、肽或蛋白质的产生，或者可提供用于rna、肽、蛋白质、无机化合物和有机化合物或组合物等的结合位点。本领域中的任何可选标志物都可以与本文所述的表达系统和方法结合使用。示例性的可选标志物包括但不限于编码提供针对本来有毒的化合物(诸如抗生素)的抗性的产物的多核苷酸序列；编码原本在受体细胞中缺乏的产物(诸如trna基因、营养缺陷标志物)的多核苷酸序列；编码抑制基因产物活性的产物的多核苷酸序列；编码可易于鉴别的产物(例如，表型标志物，诸如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白质(gfp)和细胞表面蛋白质)的多核苷酸序列；等等。在某些实施方案中，可选标志物是赋予针对抗细菌剂的抗性的多核苷酸序列，所述抗细菌剂诸如氨苄西林(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、红霉素(erythromycin)、氯霉素(chloramphenicol)、庆大霉素(gentamycin)、春日霉素(kasugamycin)、利福平(rifampicin)、壮观霉素(spectinomycin)、d-环丝氨酸、萘啶酸、链霉素、四环素等。本公开进一步涉及产生如本文所述的重组血红蛋白的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含编码二-α链的多核苷酸和编码两条β链的多核苷酸的宿主细胞；以及(b)诱导含有编码所述二-α链的所述多核苷酸和编码所述两条β链的所述多核苷酸的所述宿主细胞以表达重组血红蛋白，由此产生所述重组血红蛋白。在某些实施方案中，编码hemh的多核苷酸；编码血红素转运蛋白的多核苷酸；编码二-α链的多核苷酸；和编码两条β链的多核苷酸存在于一种或多种选自由以下组成的组的载体中：设计成插入细胞基因组中的质粒、人工染色体、病毒和线性多核苷酸片段。在某些实施方案中，使用crispr/cas9将编码hemh的多核苷酸、编码血红素转运蛋白的多核苷酸、编码二-α链的多核苷酸和编码两条β链的多核苷酸插入宿主细胞基因组中。在某些实施方案中，编码hemh的多核苷酸、编码血红素转运蛋白的多核苷酸、编码二-α链的多核苷酸和编码两条β链的多核苷酸存在于宿主细胞中的一种或多种质粒中。在某些实施方案中，产生本文所述的重组血红蛋白的方法包括：(a)提供包含一种或多种编码二-α链和两条β链的重组血红蛋白表达质粒的宿主细胞；以及(b)诱导含有所述一种或多种编码所述二-α链和所述两条β链的重组血红蛋白表达质粒的宿主细胞表达重组血红蛋白，由此产生所述重组血红蛋白。在某些实施方案中，一种或多种编码二-α链和两条β链的重组血红蛋白表达质粒包含seqidno:4的多核苷酸序列和seqidno:5的多核苷酸序列。在某些实施方案中，一种或多种编码二-α链和两条β链的重组血红蛋白表达质粒包含seqidno:4的多核苷酸序列和seqidno:6的多核苷酸序列。在某些实施方案中，宿主细胞选自由以下组成的组：具有λde3的jm109大肠杆菌细菌菌株、没有λde3的bl21-ai大肠杆菌细菌菌株和没有λde3的shuffle大肠杆菌细菌菌株。在某些实施方案中，宿主细胞进一步包含编码hemh的质粒。在某些实施方案中，宿主细胞进一步包含一种或两种编码血红素转运蛋白的质粒。本文还提供了包含至少一种本文所述载体的宿主细胞，所述载体编码至少一种选自如本文所述的二-α链和如本文所述的两条β链的多肽。在某些实施方案中，至少一种载体是质粒。在某些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种质粒。可通过在血红素存在的情况下在宿主细胞内表达一条二-α链和两条β链来形成重组血红蛋白。测试了不同的宿主细胞并且示于表3中。在一些实施方案中，宿主细胞是具有λde3的jm109大肠杆菌细菌菌株、没有λde3的bl21-t7或ai大肠杆菌细菌菌株、或没有λde3的shuffle大肠杆菌细菌菌株(因为它们具有最佳产率)、或bl21-t7-ct(crispr/cas9)和jm109-t7-ct(crispr/cas9)(因为它们具有最佳质量和易操作性)。二-α链和β链的表达可通过将携带编码一条二α多肽链的多核苷酸序列的质粒和携带编码两条β多肽链的多核苷酸序列的质粒一起共转化到宿主细胞中来实现，其中用于二-α多肽链的质粒与用于两条β多肽链的质粒的比率为大约1:1。二-α链和β链的表达还可通过将携带编码一条二α多肽链的多核苷酸序列的质粒和携带编码一条β多肽链的多核苷酸序列的质粒一起共转化到宿主细胞中来实现，其中用于二-α多肽链的质粒与用于一条β多肽链的质粒的比率为大约1:2。二-α链和β链的表达还可通过将携带编码一条二-α多肽链的多核苷酸序列和编码两条β链的多核苷酸序列的质粒转化到宿主细胞中来实现。在某些实施方案中，用于表达本文所述的重组血红蛋白的质粒包含编码与seqidno:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列的多核苷酸，其中seqidno:1的1位和143位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，seqidno:1的29位和171位处的氨基酸必须是苯丙氨酸，并且seqidno:1的58位和200位处的氨基酸必须是谷氨酰胺；和两条β链，每条β链包含与seqidno:2具有至少97.94％序列同源性的多肽序列，其中seqidno:2的1位必须是甲硫氨酸。在一些实施方案中，用于表达重组血红蛋白的质粒包含seqidno:4的多核苷酸序列(tbm1和tbm9的二-α链)和seqidno:5的多核苷酸序列(tbm1的β链)。质粒图谱示于图2a中。在某些实施方案中，宿主细胞是k12菌株(t7感受态大肠杆菌)。在某些实施方案中，用于表达重组血红蛋白的质粒包含seqidno:4的多核苷酸序列(tbm1和tbm9的二-α链)和seqidno:5的多核苷酸序列(tbm1的β链)，并且宿主细胞是k12菌株(neb#c3026)。在某些实施方案中，用于表达本文所述的重组血红蛋白的质粒包含编码与seqidno:1具有至少98.93％序列同源性的多肽序列的多核苷酸，其中seqidno:1的1位和143位处的氨基酸必须是甲硫氨酸，seqidno:1的29位和171位处的氨基酸必须是苯丙氨酸，并且seqidno:1的58位和200位处的氨基酸必须是谷氨酰胺；和两条β链，每条β链包含与seqidno:3具有至少97.94％序列同源性的多肽序列，其中seqidno:3的1位必须是甲硫氨酸，seqidno:3的82位必须是天冬氨酸，并且seqidno:3的108位必须是赖氨酸。在某些实施方案中，用于表达重组血红蛋白的质粒包含seqidno:4的多核苷酸序列(tbm1和tbm9的二-α链)和seqidno:6的多核苷酸序列(tbm9的β链)(质粒图谱示于图2a中)，并且宿主细胞是k12菌株(t7感受态大肠杆菌)。在某些实施方案中，将用于表达二-α链、β链和/或其组合的质粒与用于表达亚铁螯合酶或催化血红素产生的任何其他酶的质粒共转化。在某些实施方案中，用于表达亚铁螯合酶或催化血红素产生的任何其他酶的质粒是hemh质粒，其中所述hemh质粒可含有任何hemh核苷酸。示例性的hemh突变体多核苷酸列于图7中。在某些实施方案中，hemh质粒具有seqidno:7(野生型)或seqidno:8(突变体)的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将氯化血红素添加到含有已用表达二-α链、β链和/或其组合的质粒转化的宿主细胞的溶液中。在某些实施方案中，还将用于表达血红素转运蛋白的质粒与用于表达重组血红蛋白的质粒和/或用于表达血红素产生酶的质粒一起共转化。血红素转运蛋白可以是可促进血红素摄取的任何蛋白质，包括但不限于由chua基因编码的69kda外膜蛋白质和命名为tonb的内膜蛋白质，chua对血红素的摄取依赖于所述内膜蛋白质。任何其他血红素和/或铁转运蛋白，诸如血红素载体蛋白质1(hcp1)、二价金属转运蛋白1(dmt1)、粘脂蛋白-1(也被称为trpml1)、hrg1、血色素结合蛋白等也在本公开的预期范围内。在某些实施方案中，血红素转运蛋白质粒包含与seqidno:9具有98％序列同源性的多核苷酸序列。chua的dna序列示于图8中。在某些实施方案中，血红素转运蛋白质粒包含与seqidno:9具有99％序列同源性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，血红素转运蛋白质粒包含seqidno:9的多核苷酸序列。在某些实施方案中，血红素转运蛋白质粒包含与seqidno:10具有98％序列同源性的多核苷酸序列。编码tonb的dna序列示于图9中。在某些实施方案中，血红素转运蛋白质粒包含与seqidno:10具有99％序列同源性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，血红素转运蛋白质粒包含seqidno:10的多核苷酸序列。在某些实施方案中，仅将带有chua的血红素转运蛋白质粒与用于表达二-α链、β链和/或其组合的质粒共转化。在某些实施方案中，仅将带有chua的血红素转运蛋白质粒与用于表达二-α链、β链和/或其组合的质粒以及用于表达血红素产生酶的质粒共转化。在某些实施方案中，将带有chua基因的质粒和用于表达tonb的质粒两者与用于表达二-α链、β链和/或其组合的质粒共转化。在某些实施方案中，将带有chua基因的质粒和用于表达tonb的质粒两者与用于表达二-α链、β链和/或其组合的质粒以及用于表达血红素产生酶的质粒共转化。在一些实施方案中，已测试了不同的蛋白质表达系统(示于表4中)，并且用于12号和19号克隆的蛋白质表达系统显示重组血红蛋白的最佳产率和质量。petduet-1载体具有两个t7启动子。第一t7启动子是t1，并且第二t7启动子是t2。所述蛋白质可在petduet-1载体的t1或t2的控制下表达。类似地，prsfduet-1载体具有两个t7启动子，第一个t7启动子是r1，并且第二个t7启动子是r2。所述蛋白质可在prsfduet-1载体的t1或t2的控制下表达。表4.不同的蛋白质表达系统用于表达系统的组件含有(1)t7启动子/lac操纵子和(2)用于蛋白质表达序列，包括起始密码子和终止密码子。每个duet质粒都具有两个t7启动子/lac操纵子(t1和t2)。我们插入在第1或第2t7启动子/lac操纵子控制下的不同基因，以测试蛋白质表达水平。质粒的抗生素抗性和复制子示于表4中。12号和19号克隆显示重组血红蛋白的最佳产率和质量。对于克隆12来说，它含有两种质粒：第1质粒是petduet-1(氨苄西林)，其在t1下表达二-α和β链且在t2下表达hemh；第2质粒是prsfduet-1(卡那霉素)，其在r2下表达chua和tonb。对于克隆19来说，它含有两种质粒：第1质粒是petduet-1-kana(卡那霉素)，其在t1下表达二-α和β链且在t2下表达hemh；第2质粒是pacycduet-1(氯霉素)，其在a2下表达chua和tonb。可使用本领域技术人员已知的任何方法对含有一种或多种上述质粒的宿主细胞进行孵育和发酵。然后可使用简化的程序纯化由细菌细胞产生的重组血红蛋白，该简化的程序不需要加热步骤，并且不需要使用一氧化碳(图6)。重组血红蛋白可使用本文所述的纯化程序纯化，并且可产生纯化的血红蛋白，其含有很少或不含hbco，并且具有低量的ppix，例如，小于1％。uplc结果指示，血红素:蛋白质对于tbm1和tbm9较高，且对于tbm9最高(表2)。高效液相色谱(hplc)结果指示了如下表5中所示的tbn、tbm1和tbm9的八聚体:四聚体:二聚体分布。表5.不同重组血红蛋白的hplc结果蛋白质八聚体％四聚体％二聚体％tbn2.5097.500.00tbm101000.00tbm901000.00本文所述的重组血红蛋白的纯化即使在没有热处理步骤的情况下也能以高纯度产生蛋白质产物，如图4以及表1和表2中所示。这样意想不到的技术效果解决了用于制备重组血红蛋白的现有方法的一个或多个问题。例如，本文所述的重组血红蛋白在纯化期间的稳定性将不受影响，因此将不需要co来维持重组血红蛋白在热处理期间的稳定性。因此，不需要另外的步骤来去除不期望的co。因此，本文所述重组血红蛋白的纯化方法不需要热处理和co去除，因此使该方法更简单、成本更低并且在工业上更适用。在小鼠模型中注射使用本文所述方法制备的重组血红蛋白以测量肝氧水平180min(图3)。结果显示，与施用缓冲液和施用yq(牛交联血红蛋白，批号er007)的对照组相比，施用重组血红蛋白tbm1(其中二-α链具有seqidno:1并且两条β链具有seqidno:2)后30min显著增加肝氧压(图3b)。在180min内的肝氧压的测量显示，肝氧压在施用tbm9后20-30min达到平稳状态，并且在施用tbm1后约70min达到平稳状态，两者都高于通过施用yq、缓冲液或tbn(其中二-α链具有seqidno:11，并且两条β链具有seqidno:12，如图1中所示)达到的平稳状态。tbn、tbm1和tbm9的p50值汇总于表6中。表6.tbn、tbm1和tbm9的p50值和抗氧化性本文所述的重组血红蛋白可制备为包含至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。药学上可接受的载体可包括稀释剂、佐剂、赋形剂、媒介物或其组合，活性化合物与它们一起施用。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。在某些实施方案中，此类媒介物是蔗糖或海藻糖。这些溶液是无菌的并且通常不含微粒物质。它们可通过常规的、众所周知的灭菌技术(例如，过滤)进行灭菌。所述组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如ph调节剂和缓冲剂、稳定剂、稠化剂、润滑剂和着色剂等。蛋白质在此类药物制剂中的浓度可宽泛地变化，例如，按重量计从小于约0.5％，通常为约1％或至少约1％到多达15％或20％，并且将主要基于所需剂量、流体体积、粘度等，根据所选特定施用模式来选择。适合的媒介物和制剂包含蔗糖、海藻糖、氨基酸、磷酸盐缓冲液。本文所述的重组血红蛋白可用作对体内或离体组织的供氧的药剂。此类药剂可用于治疗氧缺乏是疾病和/或病况的原因、或氧缺乏与疾病和/或病况的治疗功效有关的任何疾病或病况。这些疾病或病况包括但不限于癌症、中风、出血性休克、ams、pad、pd和慢性阻塞性肺病(copd)、肺气肿、支气管炎、肺炎、肺水肿、贫血、哮喘、心脏病、糖尿病、囊性纤维化、癫痫和癫痫发作、炎性肠病(ibd)和雷诺病(raynaud’sdisease)。如通过本文所述的动物研究所证实的，可显著降低tbm1和tbm9的所需剂量。本公开还提供了可例如改善本文所述的重组血红蛋白的纯度的表达克隆。如图4和表7中所示，使用带有hemh和tbn、tbm1或tbm9的核苷酸序列的先前表达克隆表达的纯化蛋白质在uplc-pda分析中具有ppix的峰，而对于使用带有hemh突变体、血红素转运蛋白系统(chua和tonb)和tbn、tbm1或tbm9的核苷酸序列的新的改善表达克隆表达的纯化蛋白质，此类峰消失。这显示本文所述的表达克隆可显著增加所产生的血红蛋白中的血红素掺入百分比，这改善了重组血红蛋白的携氧功能，并且显著降低了ppix，该ppix是副产物和主要杂质，可削弱所产生的重组血红蛋白的携氧功能。表7.血红素和ppix含量的uplc-pda分析结果(*ppix％值是来自三个批次的平均值)为了模拟体内条件，将2,3-dpg添加到重组血红蛋白溶液中。在2,3-dpg存在下人重组血红蛋白的p50值与没有2,3-dpg的人重组血红蛋白相比增加(图5b)。实施例1：tbn、tbm1、tbm9、hemh、chua和tonb表达质粒的构建以常规克隆方法构建质粒，并且将用于每个质粒的载体和限制酶切割位点示于下表8中。表8.不同的质粒信息实施例2：蛋白质表达小规模蛋白质表达：用于筛选将期望的质粒转化到期望的菌株中。从新鲜的培养板，挑取菌落并将其置于含有2mllb培养基和适当抗生素(卡那霉素50μg/ml；氯霉素34μg/ml)的15ml管中，并且在32℃、250rpm下生长过夜。将所得培养物在50mlfalcon中以1:100稀释到10ml具有适当抗生素的tb培养基中。当od600达到0.6时，在25℃通过0.4mmiptg诱导靶蛋白质。在20h诱导后，通过以4000×g离心15min来收获细菌。发酵：将用期望的质粒转化的大肠杆菌克隆接种到200ml种子培养基(6％酵母提取物和1％nacl)中，并且在32℃以250rpm振荡培养过夜。在10l生物反应器(sartoriuscplus)中进行发酵。将烧瓶种子培养物以0.05的最终od600接种到10l生物反应器中的6.5l培养基(1％酵母提取物、1.6％胰蛋白胨、15mmk2hpo4、37mmkh2po4、15mmnacl、15mm(nh4)2so4、2mml-脯氨酸、2％甘油)中，并且在32℃和ph7.0下培养，气流为6l/min且初始搅拌速率为400rpm，其中将溶解氧维持在高于20％。将10l生物反应器中重组蛋白质产生的补料分批工艺分为两个阶段。第1阶段是在32℃需氧分批培养7h。第2阶段是在25℃使用最终浓度为0.4mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)以4.0的细菌od600进行18h的诱导过程，以诱导重组蛋白质的表达。在25℃补料分批培养18h，其中连续进料80g/l甘油和100mg/l氯化血红素，气流为8l/min且搅拌速率为600-800rpm，以维持细菌的所需比生长速率，其中将溶解氧维持在约4％。通过离心收获最终od600为30-40的细菌并将其储存在-80℃以供将来使用。实施例3：蛋白质纯化通过镍珠进行的小规模蛋白质纯化：用于筛选将来自10mltb培养基的细胞沉淀物悬浮在磷酸盐缓冲液(ph7.4)中，并通过0.1mm玻璃珠加以破碎。通过在4℃以15000×g离心15min来收获可溶性蛋白质。靶蛋白质结合到带镍珠粒，并且被0.4m咪唑洗脱。蛋白质纯化细胞裂解和粗制蛋白质样品的澄清将来自发酵的细胞沉淀物以1g细胞对7ml缓冲液的比率再悬浮于增溶缓冲液(20mmtris-hcl,150mmnacl,ph8.5)中。通过高压均质器在800巴下处理该悬浮液(两个循环)。通过中空纤维系统使细胞裂解物澄清。色谱纯化为了去除杂质，使可溶性部分通过一系列色谱柱，以分离tbn蛋白质、tbm1蛋白质或tbm9蛋白质。首先，将上清液加载到锌亲和柱上。在用缓冲液(20mmtris,30mmnacl,ph8.5)充分洗柱后，用洗脱缓冲液(20mmtris,100mm咪唑,ph8.3)洗脱靶蛋白质。其次，将回收的级分加载到deae阴离子交换柱上。用洗脱缓冲液(20mmnapi,ph6.0)洗脱靶蛋白质。最后，将纯化的tbn/tbm1/tbm9样品浓缩到50mg/ml。将蛋白质样品与适当的赋形剂在玻璃瓶中冻干。实施例4：所表达蛋白质的表征(a)uplc通过bradford蛋白质测定测量样品的蛋白质浓度。将样品稀释到约10mg/ml的蛋白质浓度。将50μl纯化蛋白质与400μl酸性丙酮混合。在剧烈搅拌后，通过离心分离混合物。向溶液中添加乙腈(acn，400μl，样品与有机溶剂的比率等于1:8)，之后以14,000rpm离心5min。然后将样品用于uplc分析(acquityh级uplc系统；waters，milford，ma，usa)。通过watersacquitybehc181.7μm，2.1×50mm柱以0.40ml/min在25℃持续15min(洗脱剂：a：h2o；b：acn[0.1％tfa])(梯度：在第6min30％b到50％b，在第12min50％b到80％b，在第13min80％b到30％b，在第15min30％b)(检测波长为400nm)来分离ppix。使用商业获得的ppix(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)作为标准品。鉴别ppix的峰，并记录校准标准品和样品中的峰面积。针对工作标准品的ppix浓度绘制校准标准品的峰面积。因此，使用校准曲线和相关方程获得ppix的相对量。(b)高效液相色谱(hplc)将样品稀释到约1mg/ml的蛋白质浓度。将10μl纯化蛋白质应用于高效液相色谱(hplc)分析(watersbreeze2hplc系统；waters,milford,ma,usa)。通过yarra3μm,sec-2000,7.8×300mm柱以0.50ml/min在25℃持续20min(流动相：0.75m氯化镁，0.2mtris，116μmedta)(检测波长为410nm)来分离蛋白质。实施例5：重组血红蛋白的携氧能力的测量(a)氧合血红蛋白解离曲线(odc)和p50值测量通过hemox-分析仪确定p50值。将1.5mg纯化蛋白质稀释于有或没有2,3-dpg(4mm)的3.5ml缓冲液(hepes100mm,kcl100mm,ph7.3)中。将样品缓冲液吸入比色皿中并使混合物的温度平衡并且达到37℃；然后用空气将样品供氧到100％。在调整po2值后，用氮气将样品脱氧。在脱氧过程期间，记录曲线。将p50值在x轴线上外推为o2饱和度为50％的点。(b)大鼠模型中的肝氧水平测量(180min)在水牛大鼠(buffalorat)中的缺血和再灌注程序期间，通过体内监测系统(oxfordoptronix,uk)直接监测肝组织氧合(肝po2)。简单地说，将大面积表面(las)氧传感器(oxfordoptronix,uk)置于大鼠的右肝叶瓣与三角叶瓣之间。夹紧肝动脉和门静脉到右叶瓣和三角叶瓣的分支。静脉施用yq(牛富马酰交联血红蛋白-阳性对照组)(0.2g/kg)、tbm1/tbm9(0.2g/kg)或林格氏乙酸盐缓冲液(ringer’sacetatebuffer)(对照组)。在肝缺血再灌注损伤期间连续测量肝氧张力：(1)基线；(2)输注yq、tbm1/tbm9或林格氏乙酸盐缓冲液后。实施例6：经叠氮化物诱导的氧化的测量在室温下，用0.1m磷酸钠加1mmedta(ph7.0)将重组血红蛋白稀释到1mg/ml。将样品溶液在室温下由hemex分析仪(tcsscientific)用压缩空气供氧20min。通过向1ml供氧样品溶液中添加55.6μl的2m叠氮化钠，开始经叠氮化物诱导的氧化。然后将样品溶液无延迟地转移到比色皿中，用石蜡膜密封以防止蒸发。在室温下，在0、1、2、3、4、5、6、24和48h以快速模式，通过具有audrop板(thermosscientific)的multiskango记录400nm到800nm的可见光谱。使用578nm、630nm和700nm处的读数，利用以下公式计算氧合-hb的浓度：[氧合-hb]＝16.2*(a578-a700)–68*(a630-a700)。通过对前6h的数据进行指数拟合来计算初始氧化速率。实施例7：4t1乳腺癌细胞增殖研究(a)4t1体外研究为了确定体外对癌细胞增殖的抑制，将4t1乳腺癌细胞(2000个细胞/孔)接种到96孔板上，并且在37℃孵育24h。在细胞稳定化之后，用100ul含有tbm1或tbm9的培养基替换培养基，在48h后通过mtt测定评价细胞存活力。对tbm1或tbm9处理后的细胞增殖的mtt测定的结果示于图11中。tbm1和tbm9在0.1到10um的浓度下可显著抑制癌细胞增殖。(b)4t1体内研究-小鼠向6周龄雌性balb/c裸小鼠皮下注射4t1癌细胞(每只小鼠5000个细胞)。根据以下标准公式计算肿瘤体积(mm3)：(最长直径)×0.5×(最短直径)2。在肿瘤体积达到100mm3后，通过尾静脉注射tbm1蛋白质(100mg/kg,n＝8)，每周一次，持续两周。向对照组(n＝8)注射pbs。每周监测肿瘤体积两次。如图12a中所示，在用pbs处理的小鼠(对照组)中，肿瘤在治疗后约14天内快速生长。tbm1组中小鼠的肿瘤生长与对照组相比显著减慢(p<0.05)。图12b显示14天tbm1处理后的肿瘤体积。对于对照组，肿瘤达到800mm3的体积，显著高于tbm1处理组的体积(377mm3)。实施例8：外周动脉疾病(pad)模型使用鼠类模型来评价tbm1对危重肢体缺血的潜在治疗作用。简单地说，通过腹膜内注射甲苯噻嗪(20mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)将小鼠麻醉。切离左侧股动脉，并从其作为髂外动脉的分支的近端起点结扎至远端点，其在此处分叉为隐动脉和腘动脉。在股动脉成功结扎后24小时，将小鼠随机分配以接受经由尾静脉的生理盐水(n＝2)和tbm1(800mg/kg,n＝2)的单次静脉施用。通过使用激光多普勒成像系统(laserdopplerimagingsystem)(moorinstruments,devon,uk)，在基线、股动脉结扎后即刻和施用所分配的治疗后第7天连续评估后肢的组织灌注。在测量程序期间，将小鼠麻醉。捕获数字彩色编码图像并进行分析，以对膝关节到脚趾的区域中的血流进行定量。如图13中所示，在“右股动脉结扎后即刻”的时间点，我们的结果显示平均相对血液灌注从非缺血对照肢体的平均相对血液灌注的88.8％大幅降低到仅5.2％，确认了急性后肢缺血的成功诱导。有趣的是，在第7天，接受tbm1处理小鼠的缺血肢体中的组织血液灌注有很大改善。具体地，在第7天，在生理盐水组中，平均相对组织血液灌注为非缺血对照肢体的平均相对组织血液灌注的11.7％，大幅低于接受800mg/kgtbm1的对应物的平均相对组织血液灌注(30.1％)。总之，在危重肢体缺血的小鼠模型中，以800mg/kg单次静脉注射tbm1使组织灌注得以改善。实施例9：小鼠和大鼠中多剂量和单剂量的tbm1(a)小鼠中多剂量的tbm1：将小鼠(balb/c小鼠和icr小鼠两者)随机分为3组(n＝6)，并通过尾静脉接受连续4次的每周注射(tbm1100mg/kg、tbm1200mg/kg或作为对照的pbs)。在终点，将小鼠麻醉并且收集血液样品并进行血液学分析。收获主要器官(肝、脾、肾、肺)，在福尔马林(formalin)中固定并处理以进行组织学评价(h&e染色)。如图14中所示，在tbm1治疗组与对照组(均为balb/c小鼠和icr小鼠)之间未见显著的重量差异。在所用剂量下未见小鼠出现其他常见的药物毒性体征，诸如皮毛起皱、厌食症、恶病质、皮肤隆起(由于脱水)、皮肤溃疡或中毒性死亡。(b)大鼠中单剂量的tbm1(用于检查心肌病变)：sd大鼠(n＝6)接受单剂量(tbm1400和800mg/kg，通过静脉输注)。简单地说，在给药日之前至少4天，将颈导管手术植入到大鼠的右颈静脉中。在给药日，将动物称重并分配为每组6只，雌雄各半。将tbm1吸入注射器中并且连接到具有0.22um过滤器的延伸管以用于注射。通过电动注射泵以恒定速率给予输注。在72h后，处死大鼠并收获心脏，在福尔马林中固定并处理以进行组织学评价(h&e染色)。在总共6只大鼠中没有药物诱导的心肌病变的迹象。尽管已根据某些实施方案描述了本发明，但对于本领域普通技术人员来说显而易见的其他实施方案也在本发明的范围内。因此，本发明的范围意在仅由所附权利要求来限定。工业适用性本公开提供了可用于治疗氧缺乏相关疾病或病状的重组血红蛋白，所述疾病或病况诸如癌症、中风、出血性休克、急性高原病(ams)、外周动脉疾病(pad)和帕金森氏病(pd)。本文所述的重组血红蛋白可具有增加的携氧能力。包含本文所述的重组血红蛋白的药物组合物的治疗用途可能需要减少的临床剂量，这增加了此类治疗用途在有需要的受试者中的安全性。还提供了以高产率和高纯度制备、获得、发酵和/或纯化重组血红蛋白的简化方法和/或工艺。此类方法可以工业规模使用，与现有的常规方法相比，其可具有更高的成本效益和更少的杂质倾向。序列表<110>环喜有限公司<120>重组血红蛋白及其制备和使用方法<130>p20263pct00<150>美国临时专利申请号62/799,829<151>2019-02-01<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>283<212>prt<213>人工序列<220><223>在实验室中合成的二-α链<400>1metleuserproalaasplysthrasnvallysalaalatrpglylys151015valglyalahisalaglyglutyrglyalaglualaphegluargmet202530pheleuserpheprothrthrlysthrtyrpheprohispheaspleu354045serhisglyseralaglnvallysglyglnglylyslysvalalaasp505560alaleuthrasnalavalalahisvalaspaspmetproasnalaleu65707580seralaleuseraspleuhisalahislysleuargvalaspproval859095asnphelysleuleuserhiscysleuleuvalthrleualaalahis100105110leuproalagluphethrproalavalhisalaserleuasplysphe115120125leualaservalserthrvalleuthrserlystyrargglymetleu130135140serproalaasplysthrasnvallysalaalatrpglylysvalgly145150155160alahisalaglyglutyrglyalaglualaphegluargmetpheleu165170175serpheprothrthrlysthrtyrpheprohispheaspleuserhis180185190glyseralaglnvallysglyglnglylyslysvalalaaspalaleu195200205thrasnalavalalahisvalaspaspmetproasnalaleuserala210215220leuseraspleuhisalahislysleuargvalaspprovalasnphe225230235240lysleuleuserhiscysleuleuvalthrleualaalahisleupro245250255alagluphethrproalavalhisalaserleuasplyspheleuala260265270servalserthrvalleuthrserlystyrarg275280<210>2<211>146<212>prt<213>人工序列<220><223>在实验室中合成的β链<400>2methisleuthrprogluglulysseralavalthralaleutrpgly151015lysvalasnvalaspgluvalglyglyglualaleuglyargleuleu202530valvaltyrprotrpthrglnargphephegluserpheglyaspleu354045serthrproaspalavalmetglyasnprolysvallysalahisgly505560lyslysvalleuglyalapheseraspglyleualahisleuaspasn65707580leulysglythrphealathrleusergluleuhiscysasplysleu859095hisvalaspprogluasnpheargleuleuglyasnvalleuvalcys100105110valleualahishispheglylysgluphethrproprovalglnala115120125alatyrglnlysvalvalalaglyvalalaasnalaleualahislys130135140tyrhis145<210>3<211>146<212>prt<213>人工序列<220><223>在实验室中合成的β链<400>3methisleuthrprogluglulysseralavalthralaleutrpgly151015lysvalasnvalaspgluvalglyglyglualaleuglyargleuleu202530valvaltyrprotrpthrglnargphephegluserpheglyaspleu354045serthrproaspalavalmetglyasnprolysvallysalahisgly505560lyslysvalleuglyalapheseraspglyleualahisleuaspasn65707580leuaspglythrphealathrleusergluleuhiscysasplysleu859095hisvalaspprogluasnpheargleuleuglylysvalleuvalcys100105110valleualahishispheglylysgluphethrproprovalglnala115120125alatyrglnlysvalvalalaglyvalalaasnalaleualahislys130135140tyrhis145<210>4<211>852<212>dna<213>人工序列<220><223>在实验室中合成的二-α链<400>4atgctgtctccggcagataaaacgaatgttaaagcagcctggggtaaagtcggcgctcac60gcgggcgaatacggtgcagaagcctttgaacgtatgtttctgtccttcccgaccacgaaa120acctattttccgcatttcgatctgagtcacggctccgcgcaggtgaaaggtcagggcaaa180aaagttgcagacgctctgacgaacgcggtggcccacgttgatgacatgccgaatgcactg240tcagctctgagcgatctgcacgcgcacaaactgcgtgttgatccggtgaactttaaactg300ctgagccattgcctgctggtcaccctggcggcacacctgccggcagaatttacgccggcg360gttcatgccagcctggataaattcctggcgagcgtgagcaccgtcctgacgtctaaatac420cgcggcatgctgtctccggcagataaaacgaatgttaaagcagcctggggtaaagtcggc480gctcacgcgggcgaatacggtgcagaagcctttgaacgtatgtttctgtccttcccgacc540acgaaaacctattttccgcatttcgatctgagtcacggctccgcgcaggtgaaaggtcag600ggcaaaaaagttgcagacgctctgacgaacgcggtggcccacgttgatgacatgccgaat660gcactgtcagctctgagcgatctgcacgcgcacaaactgcgtgttgatccggtgaacttt720aaactgctgagccattgcctgctggtcaccctggcggcacac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