由多重耐药细菌产生的金属-β-内酰胺酶的抑制剂及其制备方法

本发明涉及用于抑制所有亚类(b1、b2和b3)金属-β-内酰胺酶(mbl)的化合物和包含其的抗菌组合物。

背景技术：

β-内酰胺类抗生素是用于治疗细菌感染的最成功的药物之一，约占全球抗生素总市场的65％(worthington等人，有机化学期刊，78，4207(2013))。因此，对β-内酰胺类抗生素的抗性是与革兰氏阴性细菌感染相关的最严重问题之一(lee等人，柳叶刀传染病，16，17-18(2016))。

β-内酰胺酶是水解失活β-内酰胺类(β-内酰胺类抗生素)的细菌酶，并且是出现对β-内酰胺类抗生素(如青霉素类、头孢菌素类、单内酰环类和碳青霉烯类)具有抗性的病原菌的主要原因，所述β-内酰胺类抗生素是一类通常用于治疗严重或高风险细菌感染的高效抗生素剂。

β-内酰胺酶由各种细菌产生，赋予它们对β-内酰胺类抗生素如青霉素类、头孢菌素类、单内酰环类和/或碳青霉烯类(用于治疗细菌感染的最后手段药物)的抗性(mckenna，自然，499，394-396(2013)；papp-wallace等人，抗菌剂与化疗，55，4943-4960(2011))。β-内酰胺酶(一组在革兰氏阴性细菌中赋予抗生素抗性的酶)的产生现在是治疗革兰氏阴性感染的主要障碍之一(lee等人，柳叶刀传染病，16，17-18(2016)；papp-wallace等人，抗菌剂与化疗，55，4943-4960(2011)；tucker等人，细胞，172，618(2018))。β-内酰胺酶根据其催化机制分类为丝氨酸β-内酰胺酶(a、c和d类)和金属-β-内酰胺酶(mbl，b类酶，进一步分为b1-b3三个亚类)(bush等人，抗菌剂与化疗，54，969-976(2010)；galleni等人，抗菌剂与化疗，45，660-663(2001))。

mbl需要锌来催化。它们具有宽的底物谱，并且可以催化几乎所有β-内酰胺类抗生素(包括碳青霉烯类，除了单内酰环类)的水解(palzkill，纽约科学院年鉴，1277，91-104(2013))。在肠杆菌科中鉴定的获得性b1亚类mbl的最常见家族包括vim型(verona整合子编码的金属-β-内酰胺酶)和imp型(耐亚胺培南的假单胞菌)组，以及新兴的ndm型(新德里金属-β-内酰胺酶)组(nordmann等人，微生物学进展，19，588-595(2011)；walsh等人，临床微生物学评论，18，306-325(2005)；yong等人，抗菌剂与化疗，53，5046-5054(2009))。最具临床意义的碳青霉烯酶之一ndm-1在2008年首次在从印度返回瑞典的患者中的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌中检测到，并且随后显示存在于世界上许多国家的细菌分离株中(yong等人，抗菌剂与化疗，53，5046-5054(2009))。1991年在日本的粘质沙雷氏菌分离株中发现了imp-1(ito等人，抗菌剂与化疗，39，824-829(1995))。vim-1于1997年在意大利首次被鉴定(cornaglia等人，临床传染病，31，1119-1125(2000)；lauretti等人，抗菌剂与化疗，43，1584-1590(1999))，然后vim-2在法国在1996年的铜绿假单胞菌分离株中被报道(poirel等人，抗菌剂与化疗，44，891-897(2000))。gim-1(德国亚胺培南酶-1：b1亚类mbl)在2002年在来自德国的临床铜绿假单胞菌分离株中首次被鉴定(castanheira等人，抗菌剂与化疗，48，4654-4661(2004))，并且它也在来自德国的多药耐药性铜绿假单胞菌分离株的不同克隆中被报道(rieberh等人，抗微生物化疗杂志，67，1043-1045(2012))。从嗜水气单胞菌中鉴定出cpha型(碳青霉烯酶水解气单胞菌：b2亚类mbl)(massidda等人，细菌学杂志，173，4611-4617(1991))。b3亚类gob型mbl包括各种等位基因变异体，它们全部由脑膜败血伊丽莎白菌表达，所述脑膜败血伊丽莎白菌是一种导致新生儿脑膜炎和免疫受损患者机会性感染的病原体(bloch等人，医学(巴尔的摩)，76，30-41(1997)；lee等人，中华医学会杂志，71，473-476(2008)；shinha等人，idcases，2，13215(2015))。在临床上最重要的人类病原体脑膜脓毒性金黄杆菌中发现了gob-1(以脑膜脓毒性金黄杆菌的b类β-内酰胺酶命名)(bellais等人，抗菌剂与化疗，44，1878-1886(2000))。

阿维巴坦(以前的nxl104)是二氮杂双环辛烷(dbo，非内酰胺类)衍生物抗生素，并且头孢他啶-阿维巴坦在2015年被fda批准。阿维巴坦在可逆地抑制丝氨酸β-内酰胺酶方面具有非常好的效力，所述丝氨酸β-内酰胺酶包括amblera类(主要是超广谱β-内酰胺酶(esbl)和肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(kpc))、c类和部分d类(包括oxa-1、oxa-10和oxa-48亚组)(lomovskaya等人，抗菌剂与化疗，61，pii：e01443-17(2017))。此外，瑞来巴坦(以前的mk-7655a)由另一种dbo类药物开发，并且fda最近在2019年宣布批准组合抗生素亚胺培南-西司他丁/瑞来巴坦。法硼巴坦(以前称为rpx7009)，一种环状硼酸酯非β-内酰胺剂(结构上不同于阿维巴坦和瑞来巴坦)，是β-内酰胺酶抑制剂，美罗培南-法硼巴坦在2017年被fda批准。两种抑制剂(瑞来巴坦和法硼巴坦)显示出针对amblera类(包括esbl和kpc)和c类β-内酰胺酶(ampc)的活性。

然而，尚未证明它们抑制b类mbl(例如ndm-、imp-和vim-型)(zhanel等人，药物，78，65(2018))。此外，mbl不被基于机制的抑制剂如克拉维酸盐、舒巴坦和他唑巴坦抑制。

因此，迫切需要开发具有广谱功能的新型mbl抑制剂以抑制所有亚类(b1、b2和b3)mbl。本发明人合成了能够抑制所有mbl亚类的新型抑制剂，并完成了本发明。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的是提供金属-β-内酰胺酶(mbl)的抑制剂。

本发明的另一个目的是提供制备新型mbl抑制剂的方法。

本发明的另一个目的是提供用于治疗或预防细菌感染的组合物，其包括本发明的mbl。

本发明的再一个目的是提供通过使用本发明的mbl治疗或预防细菌感染的方法。

技术方案

出于本发明的目的，本发明的一个方面是具有式i的mbl抑制剂或其衍生物：

[式i]

其中r1是h、

更具体地，所述mbl抑制剂是选自式ii至iv的抑制剂之一。

[式ii]

[式iii]

[式iv]

根据本发明的第二方面，本发明是一种包括用于治疗细菌感染的抗生素剂和所述式i的mbl抑制剂的组合物。式i的mbl抑制剂通过防止抗生素剂的降解而维持抗生素剂活性。抗生素剂可以是β-内酰胺类抗生素剂，更具体地，它是选自青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、单内酰环类和碳青霉烯类及其组合的抗生素剂。该组合物还可以包括药学上可接受的载体。

根据本发明的第三方面，本发明是一种治疗细菌感染的方法，其包括向受试者施用具有抗菌活性的抗生素剂的步骤和向受试者施用式i的mbl抑制剂的步骤。根据本发明的一个方面，所述向受试者施用抗生素剂的步骤在所述向受试者施用mbl抑制剂的步骤之前或之后，或同时向受试者施用抗生素剂和mbl抑制剂。根据本发明的一个方面，所述治疗细菌感染的方法可以是施用具有抗生素剂、mbl抑制剂和药学上可接受的载体的组合物。所述细菌感染可以是但不限于革兰氏阴性细菌感染。

根据本发明的第四方面，一种合成式i的化合物的方法，其中r1是h、所述方法包括根据反应图式1-3之一进行反应：

反应图式1：

反应图式2：

以及

反应图式3：

式i的化合物，其中r1是h，并且3,5-二氯苯基硼酸的合成根据反应图式1合成；

式i的化合物，其中r1是并且(4-(4-氨基-3-氯苯氧基)-3,5-二氯苯基)硼酸的合成根据反应图式2合成；

式i的化合物，其中r1是并且(3,5-二氯-4-(2-羟基乙氧基)苯基)硼酸的合成根据反应图式3合成。

有益效果

本发明的式i的mbl抑制剂是对mbl的所有亚类具有活性的广谱mbl抑制剂。通过将本发明的mbl抑制剂与β-内酰胺类抗生素剂一起给药，可以保护抗生素剂免受微生物产生的mbl的降解。因此，可以延长或扩大抗菌剂活性的时间和范围。由于mbl的存在而对抗菌剂具有抗性的一些细菌可以通过本发明的组合物来控制。因此，本发明可用于治疗或预防耐抗生素的细菌的感染。

附图说明

图1显示3,5-二氯苯基硼酸的¹h-nmr谱。

图2显示3,5-二氯苯基硼酸的¹³c-nmr谱。

图3是显示(4-(4-氨基-3-氯苯氧基)-3,5-二氯苯基)硼酸化合物的示例性合成的流程图的图式和试剂。

图4显示(4-(4-氨基-3-氯苯氧基)-3,5-二氯苯基)硼酸的¹h-nmr谱。

图5显示(4-(4-氨基-3-氯苯氧基)-3,5-二氯苯基)硼酸的¹³c-nmr谱。

图6是显示(3,5-二氯-4-(2-羟基乙氧基)苯基)硼酸化合物的示例性合成的流程图的图式和试剂。

图7显示(3,5-二氯-4-(2-羟基乙氧基)苯基)硼酸的¹h-nmr谱。

图8显示(3,5-二氯-4-(2-羟基乙氧基)苯基)硼酸的¹³c-nmr谱。

具体实施方式

在下文中，将参考附图详细描述本发明的实施例。

根据本发明的一个或多个实施例，由式i表示的化合物或其衍生物可以抑制mbl(参见下面的实施例3)。该化合物显示出抑制所有亚类(b1、b2和b3)mbl的广谱功能。然而，尚未证明所有报道的化合物(fad批准的)抑制主要的临床上重要的b1亚类mbl(ndm、imp、vim和gim型)、b2亚类mbl(cpha)和b3亚类mbl(gob型)(参见以下实施例)。

使用icm-vls软件的基于结构的虚拟筛选用于发现抑制mbl的新化合物(参见下面的实施例1)。用于这种筛选的mbl纯化自细菌来源。筛选的化合物抑制mbl活性的能力(ic50值)用标准的酶抑制试验测定(参见下面的实施例5；page，生物化学杂志，295，295-304(1993))。使用基于细胞的测定，针对携带blandm-1的肺炎克雷伯菌进行了我们的化学文库的6,600种化合物的筛选(参见下面的实施例2)。ocl-4(从我们的化学文库中筛选并由a和b部分组成)和亚胺培南的组合显示出对携带blandm-1的肺炎克雷伯菌的部分协同作用。为了开发新的抑制剂，基于式i(dcpba，其中r1＝h)和ocl-4的部分(a和b)来设计它们。基于dcpba和ocl-4的a部分合成acp-dcpba(图式2)。基于dcpba和ocl-4的b部分合成chp-dcpba(图式3)。在本发明的一个优选实施例中，dcpba及其衍生化合物(式3的chp-dcpba和式4的chp-dcpba)可用于有效抑制mbl的活性。

根据本发明的一个或多个实施例，包括式i的化合物的组合物可用作金属-β-内酰胺酶(mbl)的抑制剂。与尚未证明抑制所有亚类(b1、b2和b3)金属-β-内酰胺酶(mbl)的所有报道的化合物不同，式i的化合物显示出抑制所有亚类(b1、b2和b3)金属-β-内酰胺酶(mbl)的广谱功能。

因此，与常规抑制剂相比，式i化合物在抑制mbl方面更有效，使得式i的化合物可更适用于治疗细菌感染。

由于通过施用式i的化合物使对β-内酰胺类抗生素具有抗性的病原菌的β-内酰胺酶失活，因此可以更有效地进行用抗生素的治疗。

β-内酰胺类抗生素(β-内酰胺类抗生素)是在其分子结构中含有β-内酰胺环的抗生素剂。β-内酰胺类抗生素包括但不限于青霉素类、头孢烯类、碳青霉烯类、青霉烯类和单内酰环类。根据本申请的一个实施例，β-内酰胺类抗生素是青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、单内酰环类和/或碳青霉烯类。

包括式i的化合物的组合物可以口服或肠胃外施用，并且在肠胃外施用的情况下，可以通过在皮肤上局部施用、静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射或透皮给药来进行施用。

以药学有效量施用该组合物。如本文所述，表述“药学有效量”是指足以治疗可用于医学治疗的细菌感染的量。有效剂量水平可以基于感染的类型或严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、施用期、施用途径、排泄比、治疗时间段、包括组合使用的药物的要素以及医学领域熟知的其他要素来确定。该组合物可以在施用β-内酰胺类抗生素之前、或之后施用于受试者或同时向受试者施用该组合物与β-内酰胺类抗生素。该组合物可以作为单独的治疗剂施用，或者其可以与其他治疗剂组合使用。它可以与常规治疗剂顺序或同时施用。它也可以作为单剂量或多剂量施用。重要的是施用允许以最小剂量获得最大效果的量，同时考虑所有上述要素而没有任何副作用，并且剂量可以由相关领域的技术人员容易地确定。

根据本发明一个实施例的组合物还可以包括药学上可接受的载体。载体包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，它们通常用于制备制剂，但不限于此。根据本发明实施例的组合物可另外包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。

本发明实施例的组合物可以制备成各种制剂，包括口服制剂和肠胃外制剂。在制备制剂的情况下，通过使用通常用于制备制剂的稀释剂或赋形剂如填充剂、疏松剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂或表面活性剂进行制备。至于用于口服给药的固体制剂，包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且这种固体制剂通过将至少一种化合物与一种或多种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶混合来制备。此外，除了简单的赋形剂之外，还使用润滑剂如硬脂酸镁或滑石。对于口服给药的液体制剂，可以提及混悬液、内用溶液制剂、乳液、糖浆制剂等。除了水或液体石蜡作为常用的简单稀释剂之外，还可以包括各种赋形剂，例如保湿剂、甜味剂、芳香剂或防腐剂。用于肠胃外施用的制剂的实例包括无菌水溶液、不溶性试剂、悬浮剂、乳液、冷冻干燥剂和栓剂。作为水不溶性溶剂或悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇或植物油(如橄榄油)和可注射酯(如油酸乙酯)。作为栓剂的基质，可以使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂精脂、甘油明胶等。

实施例

在下文中，根据实施例更详细地解释本发明。然而，给出以下实施例仅用于具体解释本发明，并且对于本领域普通技术人员显而易见的是，本发明的范围不受其限制。

实施例1

虚拟文库筛选

为了找到抑制ndm-1(临床上最重要的mbl)的新化合物，使用icm-vls软件进行基于结构的虚拟筛选。使用内坐标力学(icm)软件程序(molsoft，llc)中可用的pocketfinder算法分析ndm-1(pdbid，3spu)的晶体结构(king等人，蛋白质科学，20，1484-1491(2011))。

使用icm力场和rms(均方根)梯度为的距离依赖性介电势，通过三维(3d)质子化、水分子缺失和能量最小化来制备蛋白质结构。

将配体结合位点定义为活性位点裂缝周围的亚组区域，并选择其作为使用icm-vls软件(molsoft，llc)进行虚拟文库筛选(vls)的靶位点。icm-vls使用具有偏置概率蒙特卡罗构象搜索的全局优化，以将配体的完全灵活的全原子模型快速对接到从蛋白质受体中的原子坐标计算的一组栅极电位图。然后用评分函数评估每个配体对接构象。icm-评分函数整合了范德华能、静电、氢键键合、构象熵损失和溶剂化静电能变化(abagyan等人，分子生物学杂志，235，983-1002(1994))。使用icm-vls在三个3.0-ghzintelxeon处理器上使用默认icm-对接参数对接来自molcart化合物和构建块数据库(molsoft，llc)的整组10,658,063种化合物。在三次单独的对接运行后，通过选择具有广泛氢键和范德华接触的那些化合物进一步过滤对接评分<-45的所得化合物，然后对多种支架进行分层聚类，导致鉴定出50种与靶ndm-1配体结合位点在结构和化学上高度相容的化合物。选择具有最佳分子对接得分的七种化合物并购自enamine公司(http://www.enamine.net/)。

如下所述测定七种化合物的ic50值。将筛选的七种化合物以10mm溶于100％dmso中。根据需要制备更稀释的储备液。通过岛津uv-1650pc分光光度计使用头孢硝噻吩(ncf)(oxoid，汉普郡，英国)的特征分子消光系数(δε482＝15,900m^-1cm^-1)监测482nm处吸光度的变化来确定ndm-1活性。高达5％dmso，未观察到对mbl的酶活性的影响。测定在含有酶(263nm)、100μmzncl2和100μg/ml牛血清白蛋白的50mmmes(ph7.0)中进行。在30℃预温育纯化的酶和抑制剂5分钟后，通过加入头孢硝噻吩(100μm)开始酶促反应。5分钟后测定残余速度。每个反应的前120秒用于测量初始速率。使用microsoftexcel评估数据。使用由两倍稀释系列产生的不同浓度的七种化合物测量ndm-1的浓度依赖性抑制。一式三份测量七种化合物的每个浓度下的反应进程。使用用于excel的xl拟合曲线拟合软件(www.idbs.com)，使用以下等式，使用4参数对数拟合计算ic50值：

其中y是剩余酶活性(％)，并且x是相应的浓度。拟合的ic50参数定义为在曲线的拟合顶部(b)和底部(a)之间的一半处给出响应的浓度。在七种化合物中，仅化合物1(式i：dcpba)显示ic50值(79.89μm)(表1)。

表1筛选的化合物对ndm-1的ic50值

ni^a，无抑制。

实施例2

体内筛选

为了发现亚胺培南(固定的8μg/ml)和化学物质的组合的增强的活性，在96孔板中以200μm对我们的化学文库的6,600种化合物进行针对携带blandm-1的肺炎克雷伯菌的初始筛选。简言之，我们在mueller-hintonii液体培养基(mhb；difco实验室，密歇根州底特律市)中以1×10⁷个细胞/ml的密度制备接种溶液，并使用多通道移液管将10μl溶液分配到96孔板中。我们将96孔板在37℃下孵育24小时。然后，我们使用od600下的吸光度确定细胞存活率，并选择相对于未处理的对照使培养物的浊度降低超过60％的化合物。针对携带blandm-1的肺炎克雷伯菌的6,600种化合物的初步筛选产生了四个“命中”，其将细胞存活率降低至60％以下。

在棋盘测定中测试四种化合物(ocl-1、ocl-2、ocl-3和ocl-4)以确定它们的单独和组合效力(表2)。在双剂量反应实验中进行所选择的化合物组合以确定针对携带blandm-1的肺炎克雷伯菌的相互作用的性质。首先，我们制备了每种所选化合物的系列稀释液(20-1280μg/ml，在10％dmso中)，并将它们与亚胺培南的系列稀释液(10-2560μg/ml，在无菌milli-qh2o中)组合。接下来，我们在mueller-hintonii液体培养基中以1×10⁷个细胞/ml的密度制备细胞接种溶液。最后，我们将200μl的96孔板与浓度为5×10⁵个细胞/ml、0.5-128μg/ml和1-64μg/ml的最终细胞、亚胺培南和化合物组合。对于对照，我们接种一列和一行单独的亚胺培南或化合物，以及相应的未处理和死细胞对照孔。最后，我们将96孔板在37℃下孵育24小时，并使用od600下的吸光度确定细胞存活率。使用下式确定分数抑制浓度(fic)指数(fici)：fic指数＝fica+ficb＝[a]/mica+[b]/micb，其中[a]是药物a的浓度，mica是其mic，并且fica是药物a对生物体的fic，并且[b]、micb和ficb以与药物b相同的方式定义。由此获得的fic指数解释如下：<0.5，协同；0.5-0.75，部分协同；0.76-1.0，加性效应；>1.0-4.0，无差异；以及>4.0，拮抗作用(timurkaynak等人，国际抗生素杂志，27，224-228(2006))。当与亚胺培南组合时，它们显示出不同程度的抗菌活性增加。特别地，对于亚胺培南的组合，ocl-4显示出最低的fici值(0.562)(表2)。这些结果表明ocl-4对ndm-1具有抑制作用。为了开发可以更有效地对抗携带blandm-1的肺炎克雷伯菌的抑制剂，基于化合物1(dcpba)和ocl-4的部分(a和b)设计了新的抑制剂。

表2亚胺培南与化合物的体外相互作用

实施例3

新型化合物的合成与表征

在氩气气氛下在烘箱干燥的玻璃器皿中并使用无水溶剂进行有机金属反应。通过标准方法获得无水四氢呋喃(thf)和乙醚，并在使用前在氩气下从二苯甲酮羰游基钠中新鲜蒸馏thf。所有起始化学品和试剂均可商购获得。在硅胶(粒度0.05-0.20mm)上进行化合物的色谱纯化。在brukeravance400(400mhz用于¹h和125mhz用于¹³c)或brukeravance500(500mhz用于¹h和125mhz用于¹³c)光谱仪上在甲醇(cd3od)溶液中记录¹h-nmr和¹³c-nmr谱。化学位移(δ)在作为内标的四甲基硅烷(tms)的低场处以ppm报告(s单峰，d双峰，t三重峰，m多重峰，brs宽信号)。偶合常数(j)以hz给出。在agilent1260仪器上通过lc/ms检查所得化合物的纯度。所有测试化合物的纯度均高于95％。

实施例3-1：3,5-二氯苯基硼酸(dcpba；化合物1)的合成

式i的化合物的示例性合成如下：

图式1：dcpba的合成

步骤1：

将3,5-二氯苯胺(0.042mol)加入浓盐酸(300ml)中，并将混合物冷却至-5℃。在剧烈搅拌下滴加亚硝酸钠(0.24mol)在水(90ml)中的溶液，保持反应温度在-5℃至0℃的范围内。30分钟后，将混合物过滤，并将滤液加入到冷却的(0℃)并搅拌的碘化钾(0.6mol)的水(60ml)溶液中。将混合物温热至室温(rt)并搅拌过夜。将反应用乙酸乙酯(300ml)稀释，并分离有机相，并将水相用乙酸乙酯(1×200ml)萃取。将合并的有机萃取物用饱和nahso3溶液洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯50:1)纯化残余物，得到1,3-二氯-5-碘苯。

步骤2：

将0.026mol碘化物(1,3-二氯-5-碘苯)在150mlthf中的搅拌溶液冷却至-80℃，滴加0.029mol正丁基锂(buli)在己烷中的溶液(2.5m)，同时保持反应混合物温度低于-70℃。加入完成后，将反应混合物在-80℃下搅拌15分钟，然后立即加入0.076mol硼酸三异丙酯。使反应混合物缓慢升温至环境温度并再搅拌1h。此后，将反应混合物减压浓缩至约50ml的体积，并倒入500ml冰水中。将混合物用26ml2n盐酸水溶液酸化，将形成的沉淀过滤并干燥，得到目标化合物，其为白色粉末。mp323℃。lc/ms：mh⁺192。¹h-nmr(500mhz,dmso):δ7.62(d,1h,4-h),7.76(s,2h,2,6-h),8.44(brs,2h,oh)(图1)。¹³c-nmr(125mhz,dmso):δ129.3(4-c),131.9(2,6-c),132.8(1-c),134.2(3,5-c)(图2)。

实施例3-2：(4-(4-氨基-3-氯苯氧基)-3,5-二氯苯基)硼酸(acp-dcpba)的合成

本发明的acp-dcpba化合物的示例性合成通过遵循如图3所示的流程图的图式和试剂来合成。

图式2：acp-dcpba的合成

步骤1：

向4-溴-2,6-二氯苯酚(30.2g，124.8mmol，1.05当量)在dmf(200ml)中的溶液中添加2-氯-4-氟-1-硝基苯(20.9g，121.5mmol，1.0当量)和k2co3(32.8g，237.7mmol，2.0当量)。将所得混合物在120℃搅拌16小时。然后将混合物过滤，并将滤液用水(1000ml)稀释，用ea(300ml×3)萃取。将合并的有机层用盐水(400ml×3)洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。通过硅胶柱纯化残余物，用pe/ea＝100/1洗脱，得到5-溴-1,3-二氯-2-(3-氯-4-硝基苯氧基)苯，其为白色固体(6.6g，纯的，收率：14％)和黄色固体(18.5g，纯度：约70％，收率：39％)。

步骤2：

向5-溴-1,3-二氯-2-(3-氯-4-硝基苯氧基)苯(18.5g，46.6mmol，1.0当量)在thf(230ml)、etoh(115ml)和h2o(58ml)的混合溶剂中的溶液中添加nh4cl(25.2g，466.0mol，10当量)和fe(13.0g，233.0mmol，5当量)。将所得混合物在80℃搅拌6小时。通过lc-ms监测反应。然后将混合物过滤并将滤液浓缩。将残余物用h2o(150ml)稀释，并用ea(200ml×3)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤并经无水硫酸钠干燥。真空浓缩溶液且通过硅胶快速柱纯化残余物(0-10％ea的pe溶液)以得到4-(4-溴-2,6-二氯苯氧基)-2-氯苯胺，其为白色固体(8.3g，产率：48％)。

步骤3：

在氮气下，向4-(4-溴-2,6-二氯苯氧基)-2-氯苯胺(8.3g，22.6mmol，1.0当量)、b2pin2(6.9g，27.1mmol，1.2当量)和koac(4.4g，45.2mmol，2.0当量)在二氧六环(170ml)中的混合物中添加pd(dppf)cl2(1.7g，2.3mmol，0.1当量)。将所得混合物在100℃搅拌16小时。通过lc-ms监测反应。然后将混合物真空浓缩。通过硅胶柱纯化残余物，用pe/ea＝30/1洗脱，得到2-氯-4-(2,6-二氯-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯氧基)苯胺，其为白色固体(6.8g，产率：73％)。

步骤4：

向2-氯-4-(2,6-二氯-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯氧基)苯胺(6.8g，16.5mmol)在丙酮(200ml)中的溶液中添加h2o(50ml)、naio4(28.2g，131.7mmol)和aconh4(10.1g，131.7mmol)。在45℃搅拌4小时后，将混合物浓缩，用meoh(50ml)稀释并过滤以除去不溶性固体。通过反相柱(10％-100％mecn的水溶液)纯化滤液，得到(4-(4-氨基-3-氯苯氧基)-3,5-二氯苯基)硼酸，其为棕红色固体(3.5g，产率：64％)。¹h-nmr(400mhz,cd3od):δ＝6.58(dd,j＝8.8,2.8hz,1h),6.67(d,j＝2.8hz,1h),6.80(d,j＝8.8hz,1h),7.76(brs,2h)(图4)。¹³c-nmr(400mhz,cd3od):δ＝115.18,116.13,117.15,119.77,129.60,134.84,139.80,149.00,149.79.ms:m/z331.9[m+h]⁺(图5)。

实施例3-3：(3,5-二氯-4-(2-羟基乙氧基)苯基)硼酸(chp-dcpba)的合成

本发明的chp-dcpba化合物的示例性合成通过遵循图6中所示的流程图的图式和试剂来合成：

图式3：chp-dcpba的合成

步骤1：

向1,2,3-三氯-5-硝基苯(7.0g，31.0mmol)在dmf(100ml)中的溶液中添加4-氯-2-甲氧基苯酚(4.9g，31.0mmol)和k2co3(8.6g，62.0mmol)。在100℃下搅拌16小时后，将混合物用水(400ml)稀释，并用ea(200ml×3)萃取。将合并的ea用盐水(300ml×3)洗涤，经na2so4干燥并在真空下浓缩。将残余物用pe/ea＝20/1(120ml)研磨，得到1,3-二氯-2-(4-氯-2-甲氧基苯氧基)-5-硝基苯(9.2g，产率：86％)，其为黄色固体。¹h-nmr(400mhz,cdcl3):δ＝3.91(s,3h),6.45(d,j＝8.8hz,1h),6.81(dd,j＝8.4,2.4hz,1h),6.99(d,j＝2.4hz,1h),8.28(s,2h)。

步骤2：

向1,3-二氯-2-(4-氯-2-甲氧基苯氧基)-5-硝基苯(9.2g，26.6mmol)在thf/etoh/h2o(50ml/100ml/20ml)中的溶液中添加fe(7.5g，133.3mmol)和nh4cl(14.4g，266.6mmol)。在75℃搅拌1小时后，将反应混合物浓缩至约50ml，用ea/h2o(100ml/100ml)稀释并过滤。分离水相并用ea(100ml)萃取。合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥且浓缩，得到3,5-二氯-4-(4-氯-2-甲氧基苯氧基)苯胺，其为黄色固体(8.2g，产率：97％)。

步骤3：

将3,5-二氯-4-(4-氯-2-甲氧基苯氧基)苯胺(8.0g，25.2mmol)在mecn(180ml)中的溶液用40％hbr水溶液(15.1ml，75.7mmol)处理。在-5℃向所得混合物中滴加nano2(2.1g，30.3mmol)在h2o(30ml)中的溶液。添加后，将混合物在-5℃搅拌25分钟。分批加入cubr(7.2g，50.5mmol)。将混合物温热至室温并再搅拌1小时。然后将混合物浓缩至约30ml并用h2o(100ml)稀释，用ea(100ml×2)萃取。将合并的ea用盐水(100ml)洗涤，经na2so4干燥并浓缩。通过硅胶柱(pe/ea＝80/1)纯化残余物，得到5-溴-1,3-二氯-2-(4-氯-2-甲氧基苯氧基)苯，其为白色固体(7.5g，产率：78％)。¹h-nmr(400mhz,cdcl3):δ＝3.95(s,3h),6.34(d,j＝8.8hz,1h),6.77(dd,j＝8.8,2.4hz,1h),6.98(d,j＝2.0hz,1h),7.54(s,2h)。

步骤4：

将5-溴-1,3-二氯-2-(4-氯-2-甲氧基苯氧基)苯(7.5g，19.7mmol)、双(频哪醇合)二硼(7.5g，29.6mmol)、pd(dppf)cl2(720mg，1.0mmol)和acok(3.9g，39.5mmol)在二氧六环(115ml)中的混合物在100℃在n2气氛下搅拌16小时。然后将混合物浓缩，并通过硅胶柱(pe/ea＝80/1)纯化，得到2-(3,5-二氯-4-(4-氯-2-甲氧基苯氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷，其为白色固体(7.1g，产率：84％)。

步骤5：

向2-(3,5-二氯-4-(4-氯-2-甲氧基苯氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(4.0g，9.3mmol)在丙酮(160ml)中的溶液中添加h2o(40ml)、naio4(16.0g，74.8mmol)和aconh4(5.8g，74.8mmol)。在45℃搅拌4小时后，将混合物浓缩，用meoh(50ml)稀释并过滤以除去不溶性固体。将滤液浓缩至约30ml且通过反相柱(30％-100％mecn的水溶液)纯化以得到(3,5-二氯-4-(4-氯-2-甲氧基苯氧基)苯基)硼酸，其为白色固体(2.6g，产率：80％)。ms:m/z345.3(m-h)^-。

步骤6：

在-78℃在n2气氛下将bbr3在dcm中的溶液(17％，30ml，30.0mmol)滴加至(3,5-二氯-4-(4-氯-2-甲氧基苯氧基)苯基)硼酸(2.5g，7.5mmol)在dcm(60ml)中的搅拌溶液中。使反应在1小时内升温至室温并再搅拌3小时。将反应在-78℃用meoh(20ml)淬灭并在室温搅拌10分钟。将所得溶液在真空下浓缩。通过反相柱(5％-95％mecn的水溶液)纯化残余物，得到(3,5-二氯-4-(4-氯-2-羟基苯氧基)苯基)硼酸，其为白色固体(2.0g，产率：83％)。¹h-nmr(400mhz,cd3od):δ＝6.28(d,j＝8.8hz,1h),6.65(dd,j＝8.8,2.4hz,1h),6.93(d,j＝2.4hz,1h),7.79(brs,2h)(图7)。¹³c-nmr(400mhz,cd3od):δ＝115.88,117.91,120.10,128.98,130.12,134.77,135.67,145.13,148.61,149.77.ms:m/z332.9(m+h)⁺(图8)。

实施例4

蛋白质生产和纯化

在用引物对(表3)进行pcr扩增后，克隆来自肺炎克雷伯菌临床分离株的blandm-1基因(genbankid：fn396876)、来自鲍氏不动杆菌临床分离株的blaimp-1基因(genbankid：s71932)和来自弗氏柠檬酸杆菌临床分离株的blavim-2基因(genbankid：af191564)，然后测序。这三种临床分离株收集自大韩民国的大学医院。合成并购自idt(集成dna技术，柯罗维尔，爱荷华州，美国)的编码blagim-1基因(genbankid：aj620678)、blacpha基因(genbankid：x57102)和blagob-1基因(genbankid：af090141)的三种dna模板，其是针对大肠杆菌优化的密码子。使用合适的引物对通过pcr扩增dna模板(表3)。将扩增的dna和pet-30a(+)载体(novagen，麦迪逊，威斯康星州，美国)用ndei和xhoi双消化，然后将消化的dna连接到消化的载体中。在验证dna序列后，将质粒pet-30a(+)/his6-blandm-1、pet-30a(+)/his6-blaimp-1、pet-30a(+)/his6-blavim-2、pet-30a(+)/his6-blagim-1、pet-30a(+)/his6-blacpha和pet-30a(+)/his6-blagob-1分别转化到大肠杆菌bl21(de3)细胞中。如先前所述(park等人，全球抗菌素耐药性杂志，14，302-305(2018))制备组氨酸标记的蛋白质ndm-1、imp-1、vim-2、gim-1、cpha和gob-1中的每一种。

表3用于pcr扩增以表达编码mbl的六种基因的寡核苷酸的核苷酸序列

^af，正义(正向)引物；r，反义(反向)引物。

限制性位点以粗体显示。下划线和粗体碱基表示六组氨酸标签，斜体碱基表示肠激酶识别位点。

实施例5

新型化合物(dcpba、acp-dcpba和chp-dcpba)对mbl的ic50值的测定

为了研究新型化合物(dcpba、acp-dcpba和chp-dcpba)对四种临床上重要的b1亚类mbl(ndm-1、imp-1、vim-2和gim-1)、b2亚类mbl(cpha)和b3亚类mbl(gob-1)的抑制作用，测定了它们的ic50值(表4)。将化合物(dcpba、acp-dcpba和chp-dcpba)以10mm溶解于100％dmso中。通过监测482nm处吸光度的变化来测定mbl的活性。高达5％dmso，未观察到对mbl的酶活性的影响。在与化合物(dcpba、acp-dcpba和chp-dcpba)预温育5分钟后，将每种酶(ndm-1，263nm；imp-1，891nm；vim-2，81nm；gim-1，662nm；cpha，157nm；gob-1，2.69μm)与100μm头孢硝噻吩混合。每个反应的前120秒用于测量初始速率。使用microsoftexcel评估数据。一式三份测量每种浓度的dcpba(acp-dcpba或chp-dcpba)下的反应进程。dcpba、acp-dcpba和chp-dcpba抑制mbl的结果示于表4中。对于所有亚类mbl，dcpba显示ic50值在27.33±0.01μm-798.90±0.02μm范围内。对于所有亚类mbl，acp-dcpba显示ic50值在22.78±0.01μm-790.24±0.02μm范围内。对于所有亚类mbl，chp-dcpba显示ic50值在15.15±0.01μm-468.50±0.01μm范围内。因此，所有新型化合物(dcpba、acp-dcpba和chp-dcpba)显示出对所有亚类mbl的抑制作用。特别地，cpha对acp-dcpba和chp-dcpba的ic50值比cpha对dcpba的ic50值低六倍。表4证明chp-dcpba是所有亚类(b1、b2和b3)金属-β-内酰胺酶的最佳抑制剂。

表4以头孢硝噻吩作为底物，新型抑制剂(dcpba、acp-dcpba和chp-dcpba)针对所有亚类(b1、b2和b3)mbl的ic50值

^ambl，金属-β-内酰胺酶

已经证明，式i的化合物显示出抑制所有临床上重要的mbl亚组的广谱功能。

因此，所述化合物可用于增强β-内酰胺类抗生素剂(β-内酰胺类)的作用，并且可与β-内酰胺类抗生素剂组合用于预防和治疗细菌感染。

sequencelisting

<110>明知大学产学协力团

<120>由多重耐药细菌产生的金属-β-内酰胺酶的抑制剂及其制备方法

<130>pn200032

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