多靶受体的声学亲和细胞选择的制作方法

多靶受体的声学亲和细胞选择
1.相关申请
2.本技术要求申请日为2019年8月30日的美国临时专利申请第63/101,227号的优先权，其全部内容通过引用的方式整体并入本文。


背景技术：

3.生物材料的分离已应用于各种环境。例如，用于从其他生物材料中分离蛋白质的分离技术被用于许多的分析过程。
4.声泳是一种使用声学(例如声驻波)从初级或宿主流体中分离颗粒和/或次级流体的技术。当密度和/或可压缩性存在差异时，声驻波可以对流体中的颗粒施加力，这种差异被称为声学对比因子。驻波中的压力分布含有驻波波节处的局部最小压力幅度和驻波波腹处的局部最大值区域。根据它们的密度和可压缩性，颗粒可以被驱赶到驻波的波节或波腹并在这些地方被捕获。一般来说，驻波的频率越高，可以捕获的颗粒就越小。


技术实现要素：

5.本公开描述了用于材料的声学分离的方法、系统和设备有关的技术。被分离的材料可以是生物材料。分离可以采用材料支撑结构。支撑结构可以是珠。可以将功能化材料应用于对一种或多种待分离的材料具有亲合力的支撑结构。支撑结构可以混合在含有材料的流体中。流体混合物可以提供给流体柱或流动室。依靠在柱的一端提供可以防止支撑结构通过的声驻波，支撑结构可以针对流体或流体混合物流过柱被保留在柱中。
6.根据一些实例，实现了声学亲和系统，其可以包括封闭的、自动化的和/或一次性使用的特征。如果组件可以相对于露天环境密封，则可以认为该系统是封闭的。自动化系统能够自主运行，几乎不需要操作员干预。当用于亲和分离运行的组件和材料在亲和分离运行后将被断开并丢弃时，该系统是一次性使用的，其中亲和分离运行可包括多次再循环。一次性使用的系统可以避免针对后续的运行而对设备组件和材料进行清洁和消毒的额外步骤。
7.在一些实例中，公开了用于分离生物材料的方法、系统和设备，所述分离生物材料通过分布在流体室中的与特定的靶材料结合的功能化材料来实现。特定的靶材料可以是颗粒，包括细胞、重组蛋白质和/或单克隆抗体。可以是珠和/或微载体结构的功能化材料被包被或以其他方式提供用于吸引和结合特定的靶材料的亲和材料。亲和材料可以是蛋白质、配体或可以与靶材料形成键合的其他材料。
8.在一些示例性实施方式中，亲和材料和靶材料可以与功能化材料上的结合位点形成抗原-抗体相互作用。在一些情况下，当靶材料或功能化材料的配体与互补材料上的基质缀合时，靶材料与功能化材料结合。功能化材料包括功能化微珠。功能化微珠包括对相应抗体具有亲和力的特定的抗原配体。
9.在一些实例中，通过功能化材料粘附到支撑结构的材料保留在柱中，而流体中的其他游离材料可以穿过声驻波以实现材料分离。基于支撑结构的密度、可压缩性、尺寸或允
许支撑结构比流体混合物中的其他材料对声驻波更强烈地反应的其他特性，支撑结构可以实施为具有一定的声学对比因子。
10.可以在柱中搅拌支撑结构以增强亲和过程。在不同的模式，穿过声驻波的柱流体混合物可以再循环到柱中，或者不再循环。可以控制柱内的流体流动或不流动，当流动时，可以控制流速。流体在柱中可以是静止的，并且可以对其应用其他过程，例如温度调节、搅拌、孵育和/或任何其他有用的过程。可以有效地改变柱的体积，例如在柱中提供柱塞或活塞。可以在柱的内部或外部，对柱或柱的内容物进行加热或冷却。
11.微粒可以包括珠，并且其中至少一种珠包含直径为约20至300μm的球体，并且包含deae(n，n-二乙基氨基乙基)-葡聚糖、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、胶原蛋白或藻酸盐。细胞支撑材料可以包括具用于细胞生长的表面涂层的微泡。细胞可以包括例如t细胞、mrc-5细胞或干细胞。
12.声学换能器可用于产生声驻波，该声驻波可产生一维或多维的压力。多维的情况下，声驻波力可以具有相同的数量级。例如，波传播方向上的力可能与在不同方向上产生的力具有相同的数量级。界面区域可以在有助于防止支撑结构穿过的声驻波的边界附近生成。可以使用多个换能器，一些用于产生一种或多种模式的声波，而另一些用于产生另外的，不同模式的声波。例如，声波可以是可以产生一维或多维压力的驻波。可以以形成界面区域的模式产生声波，以防止某些材料穿过而允许其他材料穿过。声波可以以捕获或和聚集某些材料的模式产生，这些材料尺寸增大，直到这些团簇上的重力或浮力超过团簇上的其他力，例如流体或声场力，从而使团簇下降或上升，而脱离声波。
13.可以在关闭或不关闭声学换能器的情况下收集细胞。可以应用增强支撑结构聚集到流动室中的添加剂。方法还可以包括将支撑结构(例如珠)再循环到连接到流动室的培养室。方法还可以包括处理收集的细胞以输注到受试者中。优选在捕获之后，方法可以包括允许捕获的细胞和/或细胞支撑材料由于浮力或重力而从流体中上升或沉降。上升或沉降的细胞和/或支撑材料可以离开流动室。通过从流体中上升或沉降来捕获用于分离的细胞或支撑材料的模式可以伴随着防止或允许细胞和/或支撑材料穿过流体路径的模式。防止或允许穿过的模式可以通过具有跨流体路径的界面区域的声波来实现。
14.在一些示例性实施方式中，材料包括靶化合物，例如重组蛋白质和单克隆抗体、病毒和/或活细胞(例如，t细胞)。在其表面上具有或不具有功能化材料的珠或微载体可以是靶化合物或组分。
15.实例的设备可以包括配置为接收含有功能化材料的流体的流动室。流动室可以是柱的形式。声学换能器相对于流动室布置，例如，声学上耦合到流动室，以在激发时将声波或信号提供到流动室内。换能器的激发可以在腔室内生成多维声场，包括第一空间区域和第二空间区域，在第一空间区域声压幅度高于基准水平，基准水平例如是当声学换能器关闭时的水平，在第二空间区域声压幅度几乎没有或没有高于基准水平，例如，声压幅度可等于声学换能器关闭时的声压幅度。
16.在一些模式中，功能化材料可以被驱动并保留在多维声场的第一或第二位置。在其他模式中，可以根据界面区域处的边缘效应防止功能化材料进入多维声场。包括用于分离的靶材料的待处理材料可以流入流动室，在流动室中功能化材料被保留，使得具有与功能化材料互补的特征的一部分靶材料与功能化材料结合，而其他部分靶材料穿过流动室。
腔室可以被配置成用于垂直流动，垂直流动可以是向上或向下方向的。到腔室的流体路径可以设置在腔室的顶部和/或底部。声学换能器可以耦合到腔室的顶部和/或底部，以在该位置产生声场。
17.功能化微载体也可以在重组蛋白质或单克隆抗体通过缓冲液从表面洗脱或其他过程洗脱之后循环。这允许更大的表面积，以及功能化微载体与来自生物反应器的表达蛋白质的更强的亲和力相互作用，从而提高声流化床色谱过程的效率。
18.在一些示例性实施方式中，装置提供功能化颗粒(例如珠)，其布置为比填充柱提供更多的颗粒(例如珠或细胞)之间的空间。较低的密度降低了非靶生物材料堵塞功能化颗粒之间的流动路径的可能性。在一些示例性实施方式中，通过使游离的靶生物材料多次通过功能化颗粒，含有靶生物材料的再循环介质实际上增加了装置的捕获表面积。减少非靶生物材料(例如细胞)的接触可有助于保存细胞的活力。本文描述的技术可用于高密度或低密度细胞培养、新的研究应用、例如超过1,000升的大生产培养量、高效监测和培养控制、降低细胞培养应用中的成本和污染。
19.本说明书中描述的主题的一个或多个实施方式的细节在附图和以下描述中阐述。本主题的其他特征、方面和优点将从说明书、附图和权利要求中变得明显。
附图说明
20.下面参考附图更详细地描述本公开，其中：
21.图1是声学亲和过程的简化的示意图；
22.图2是以边缘效应模式操作的声学亲和系统的侧视图；
23.图3是以团簇模式操作的声学亲和系统的侧视图；
24.图4是流化床装置的正视图照片；
25.图5是声学亲和系统和过程的示意图；
26.图6是声学亲和系统和过程的示意图；
27.图7是声学亲和系统和过程的示意图；
28.图8是声学亲和系统和过程的示意图；
29.图9是声学亲和过程中亲和阳性选择的示意图；
30.图10是声学亲和过程中亲和阴性选择的示意图；
31.图11是示出了保留率与流入流体速率的关系图；
32.图12是示出了细胞存活率与柱体积的关系图；
33.图13是示出颗粒尺寸的直方图的图；
34.图14是具有再循环的声学亲和系统和过程的示意图；
35.图15是示出了再循环装置中纯度和回收率的条形图；
36.图16是用于靶向cd3标记物的具有功能化材料的珠的示意图；
37.图17是示出了不同种类的珠的尺寸分布的图；
38.图18是示出了不同种类的珠的结合率的图；
39.图19是示出了不同亲和系统之间的比较分析的图；
40.图20a和20b示出了四张图，说明了细胞群随抗体滴定比变化的差异；
41.图21是示出了每毫升细胞计数与柱体积的关系的色谱图；
42.图22是示出了柱流出物的细胞数随时间变化的曲线图；以及
43.图23和24是示出了细胞选择操作的系列图，包括在声场中保留珠和通过非靶细胞。
具体实施方式
44.本公开描述了使用具有波节和波腹的声驻波来将支撑结构(例如是珠或包被的微泡)从腔室(例如柱)中的其他材料分离的方法、系统和装置。本文描述的示例性实施方式可以以不同的模式操作。例如，在某些模式，会在整个腔室中生成具有某些特性的声波。声波可以由声学换能器生成，所述声学换能器可以位于柱的一端。声波可以导致生成界面区域，从阻拦某些材料进入声波，同时允许其他材料穿过。可以根据例如压缩率、密度、尺寸、声学对比因子和响应于声波的任何其他参数等参数来控制声波特性，以阻拦材料或使材料穿过。在其他模式中，生成具有空间位置的声波，其捕获材料以形成团簇，所述团簇尺寸增加到团簇上的重力或浮力超过声学或流体拖曳力的点，导致团簇离开声波。
45.本文讨论的模式可以一起使用，或者单独地或组合使用。可以利用一个或多个声学换能器来使用或者产生这些模式。由声波产生的声场可以被配置为阻拦或允许某些材料穿过。例如，用于细胞的支撑结构(其可以是珠、珠/细胞复合体或颗粒形式)可能被阻拦穿过声场。材料(例如细胞)可以穿过流体室。支撑结构包括能够与穿过流体室的至少一些材料结合的功能化材料。通过声波，经由功能化材料与支撑结构结合的材料通过保留在流体室内的支撑结构而被保留在流体室中。未结合到支撑结构的材料可以通过声波而离开流体室。使用声波进行亲和分离的技术获得了如本文更详细描述的许多优点。
46.参考图1，图示说明了声学亲和过程100。功能化珠102被放置在含有靶材料和非靶材料的腔室104中。靶材料对应于提供给珠102的功能化。过程100图示了在亲和结合过程中靶材料与珠102结合。珠102被换能器106在换能器106和反射器108之间生成的声驻波收集或影响。腔室104中的剩余材料可以通过使流体流过腔室104而去除，而珠102被声波保留。图1中所示的过程100可以是阳性选择过程或阴性选择过程，其分别表示希望靶材料本身被收集或从其他材料中去除。
47.根据一些实例，实现了声学亲和系统，其可以包括封闭的、自动化的和/或一次性使用的特征。如果组件可以相对于露天环境密封，则可以认为该系统是封闭的。自动化系统能够自主运行，几乎不需要操作员干预。当用于亲和分离运行的组件和材料在亲和分离运行后将被断开并丢弃时，该系统是一次性使用的，其中亲和分离运行可包括多次再循环。一次性使用的系统可以避免针对后续的运行而对设备组件和材料进行清洁和消毒的额外步骤。
48.之前用于亲和分离的系统采用磁响应珠。这些珠在制造过程中可能会遇到挑战，因为它们不会溶解或不容易在体内消耗，并且优选地从提供给患者的任何治疗中完全去除。虽然这种珠可用于本声学亲和分离系统中，但声学的使用提供了可使用的支撑结构(例如珠)，其被定制为特定声学响应的。例如，珠可以是非磁性的或非磁性响应的，并且是高声学响应的。声学响应的珠可以由多种材料组成，这显著地增加了使用它们的处理系统的灵活性。这些声学亲和珠可以由生物相容的可溶解材料组成，这可以缓解使用磁响应珠时的严苛的珠去除过程。
49.与当前的系统相比，声学亲和系统可以配置为具有增加的通量。例如，通过系统的流体流速可以增加到超过常规亲和系统通常使用的流速。该系统可以配置更大的通道，允许更高的流速和体积。细胞群的扩展可以在当前公开的系统内实施，或者可以在外部实施并馈送到声学亲和系统。
50.声学亲和系统的配置允许使用多种类型的支撑结构或珠，这些支撑结构或珠可能具有不同的特性，例如不同的尺寸或密度范围。不同组的支撑结构或珠可以配备有不同类型的功能化材料，例如蛋白质、抗原或抗体，从而能够实现亲和分离的多重化。这种配置允许复杂的单通道亲和选择得以实现。
51.在一些实例性的实施方式中，为柱提供一定体积的珠，这些珠对某种类型的细胞具有亲和力。引入柱中的细胞与珠形成复合体，该复合体可以使用声学技术从柱体积中分离。可以利用分离来收获培养的感兴趣的细胞，并且可以将提取的细胞输注到患者体内。使用具有亲和结合系统的声学法来分离感兴趣的培养细胞可适用于各种细胞疗法应用，例如疫苗疗法、干细胞疗法，特别是同种异体和自体疗法，或者再生疗法。
52.在流动室(例如柱)中生成声波，以实现珠和珠复合体与流体中未结合的细胞或材料的分离。分离可以是阴性的或阳性的，其中分别是要排除的不想要的材料结合到珠上，或者在分离中所需的材料结合到珠上。无论是阴性选择还是阳性选择，感兴趣的材料可以是不同类型的细胞，包括贴壁细胞。实例贴壁细胞可以包括人多潜能性干细胞(hmsc)、人间质干细胞(也称为hmsc)、人多能干细胞(hpsc)、人真皮成纤维细胞(hdf)、人软骨细胞和一些t淋巴细胞。贴壁细胞的抗原特异性可能不同(例如cd8贴壁细胞)。用于细胞治疗的细胞系可以是单克隆或多克隆(例如多克隆cd8贴壁细胞系)和car(嵌合抗原受体)贴壁细胞(又名人工贴壁细胞受体，或嵌合贴壁细胞受体，或嵌合免疫受体)。这些是经过修饰以识别特定蛋白质的t细胞。声学亲和分离系统中采用的珠可以配置为与这些细胞或感兴趣的材料结合或不结合，以用于阴性或阳性选择。
53.本文描述的珠技术可用于高密度细胞培养、新的研究应用、例如超过1,000升的大生产培养体积、高效监测和培养控制、降低细胞培养应用中的成本和污染。所使用的珠可以是市售的，例如由promega corporation提供的magne磁性亲和珠或聚苯乙烯珠，或由miltenyi biotec提供的macs(磁活化细胞分选)珠。珠的尺寸(例如它们的直径)可以在纳米或微米范围内。可以使用球形珠，其是具有至少两层的珠。这些层可以具有不同的特性，例如不同的对比因子，结构硬度，或通过使用多个层而组合在单个珠中的任何其他所希望的特性。
54.一些实施方式可以使用微泡作为支撑结构来结合感兴趣的材料。微泡可以由生物相容性材料的外壳和能够连接到感兴趣的细胞或材料(包括蛋白质、脂质或生物聚合物)的配体以及填充气体组成。为了相对容易制造，可以使用低密度的流体。微泡外壳可以是刚性的(例如，变性白蛋白)或柔性的(磷脂)，并具有10至200nm的厚度。填充气体可以是高分子量和低溶解度的填充气体或液体(全氟化碳或六氟化硫)，它可以在微泡内部产生相对于周围流体(例如血液)升高的蒸气浓度，并增加微泡在外周循环中的稳定性。微泡外壳可以具有表面涂层，例如脂质层。脂质层可以用作材料(例如细胞或生物分子)生长的支架或底物。活性基团可以更容易地直接与玻璃表面结合。微泡可具有2至6微米范围内的直径。包被的微泡可以具有负对比因子。
55.上文讨论的实例提供了珠作为支撑结构。也可以使用其他支撑结构，例如包被的气泡或微气泡。为方便起见，支撑结构在本文中可统称为珠，该术语旨在涵盖所有类型的支撑结构，包括珠、气泡、微载体和任何其他类型的可以结合至感兴趣的靶材料的亲和材料/支撑结构，或者被感兴趣的靶材料所结合的亲和材料/支撑结构。
56.细胞被结合至珠，例如cd3/cd28活化的珠。如下文进一步详细讨论的，可以借助于表面化学使珠功能化，使得感兴趣的细胞或材料可以附着到或粘附到珠的表面上。珠可以包括允许贴壁细胞在生物反应器或其他细胞培养系统中生长的支撑基质。在某些情况下，贴壁细胞会结合到表面上没有抗原的珠上，并且珠可以是功能化的或非功能化的。亲和应用的一些实例包括对血液成分除去法的产物的cd3+、cd3+cd4+和/或cd3+cd8+亲和选择的阳性或阴性选择。亲和应用的其他实例包括tcr+或tcr-细胞的阳性或阴性选择。
57.在结构上，珠包括具有直径在1至300μm范围内的球体，例如在125至250μm范围内的球体。球体的密度可以在1.02-1.10g/cm3的范围内。在一些情况下，珠还可以包括棒状结构。珠可以是光滑的或大孔隙的。
58.珠的核可以由不同的材料制成，例如玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、胶原蛋白，以及藻酸盐。珠材料以及不同的表面化学物质可以影响细胞行为，包括形态和增殖。
59.珠可以包被多种涂层，例如玻璃、胶原蛋白(例如，中性或带电的明胶)、重组蛋白质或化学处理以增强细胞附着性，这可能得到针对许多不同细胞系的更理想的细胞产量。
60.珠的表面化学物质可以包括细胞外基质蛋白、重组蛋白质、肽，以及带正电荷或带负电荷的分子。微载体的表面电荷可以从许多不同的基团引入，包括deae(n，n-二乙基氨基乙基)-葡聚糖、层粘连蛋白或玻连蛋白涂层(细胞外基质蛋白)。在deae-葡聚糖实例中，可以在表面添加少量的正电荷。
61.珠包被的其他实例，例如用于生物亲和过程的功能化材料，包括链霉亲和素、单体亲和素、蛋白a、抗cd3，以及用于结合生物材料的其他已知功能化材料。抗体、试剂和/或功能化材料的各种组合可以与珠一起使用以结合感兴趣的细胞。例如，可以用靶蛋白或标记物，如cd3来识别感兴趣的细胞。
62.在一些实施方式中，通过分布在整个基质中的带正电荷的deae基团取代交联的葡聚糖基质来形成珠。这种类型的珠可用于建立细胞系，以及用于从原代细胞和正常二倍体细胞株的培养物中生产病毒或细胞产物。
63.在一些实施方式中，通过将变性胶原蛋白的薄层化学偶联至交联的葡聚糖基质来形成珠。由于胶原蛋白表面层可以被多种蛋白水解酶消化，它提供了从珠中收获细胞的机会，同时维持增加的或最大的细胞活力和膜完整性。本文讨论的声学亲和系统可以与多种类型的珠一起操作，下面讨论其三个一般分组。
64.可以根据cgmp(现行药品生产质量管理规范)标准或法规来构造和配置珠。可以在声学亲和系统中使用的一组实例珠是致密的大珠。这些大珠可具有以下特征。
65.非磁性
66.约50μm的平均尺寸
67.较慢的结合动力学
68.使用声学技术更容易分离
69.正声学对比因子
70.可溶解和生物相容性
71.聚(乳酸-共-甘醇酸)，plga
72.未被细胞内化
73.另一组实例珠在本文中被称为中等尺寸的珠。这些中等尺寸的珠可具有以下特征。
74.非磁性
75.约1-10μm范围内的平均尺寸
76.可溶解和生物相容性
77.比大珠更快的结合动力学
78.使用大声学对比
79.正的和负的对比
80.plga或专有的脂质基(proprietary lipid-based)
81.另一组实例珠在本文中被称为小珠。这些小珠可具有以下特征。
82.非磁性
83.约200nm-2μm范围内的平均尺寸
84.可溶解和生物相容性
85.非常快速的结合
86.聚类分离
87.负对比因子，低声速&高密度
88.专有的脂质基
89.可以为不同类型的应用选择不同类型的珠。例如，当细胞与珠一起培养时，或者当亲和结合以非流动模式发生时，可以使用较大的珠。
90.用于亲和结合的珠可以被由声学换能器生成的声波拦阻，或者穿过声波。声学换能器可以在流动室中产生多维声驻波以产生包括增加的压力辐射力的区域的声场。声学换能器可以包括压电材料，其被激发以振动并生成声波。声学换能器可以被配置为产生更高阶的振动模式。例如，可以激发声学换能器中的振动材料以在振动材料的表面上获得驻波。振动频率与激发信号的频率直接相关。在一些实施方式中，振动材料被配置为具有直接暴露于流体层(例如流体或流经流动室的流体中的珠和培养细胞的混合物)的外表面。在一些实施方式中，声学换能器包括覆盖振动材料的外表面的磨损表面材料，磨损表面材料具有半波长或更小的厚度，和/或为聚氨酯、环氧树脂或硅树脂涂层、聚合物或类似的薄涂层。在一些实施方式中，声学换能器包括外壳，外壳具有顶端、底端和内部容积。振动材料可位于外壳的底端和内部容积内，并具有面向外壳顶端的内表面。在一些实例中，声学材料的内表面直接暴露于顶端外壳。在一些实例中，声学换能器包括与声学材料的内表面接触的背衬层，该背衬层由基本上透声的材料制成。一种或多种配置可以组合在声学换能器中，以用于产生多维声驻波。
91.所生成的多维声驻波的特征在于，声场内各个方向上都有很强的梯度，不仅在驻波的轴向上，而且在横向上也是如此。在某些情况下，这种梯度的强度使得声辐射力足以克服在毫米/秒数量级的线速度拖拽力。特别地，声辐射力可以具有相同数量级的轴向力分量和横向力分量。因此，声学梯度会在横向上产生强捕获力。
92.多维声驻波可以产生声辐射力的空间图案。由于换能器中压电材料的多模扰动，可以从一个换能器和反射器对生成多维声驻波。声辐射力可以具有相同数量级的轴向力分量和横向力分量。空间图案可以表现为辐射力的周期性变化。更具体地，可以在流体介质中产生压力波节平面和压力波腹平面，它们分别对应于具有最大和最小声辐射力平面的地板(floor)声辐射力平面，最大和最小声辐射力平面位于压力波节平面和波腹平面之间。压力波节平面也是声位移波腹平面，反之亦然。空间图案的作用可能很像流体介质中的梳状滤波器。
93.在下文更详细讨论的一些模式中，空间图案可以产生界面区域，其阻挡具有某些特性的颗粒进入或穿过声波。在下文更详细讨论的其他操作模式中，空间图案可用于捕获颗粒，例如是具有特定尺寸或尺寸范围的颗粒，而具有不同尺寸或尺寸范围的颗粒可能不被捕获。这些模式可以单独地使用或组合在一起使用，以在相同的或分离的场所提供屏障和捕获功能。
94.在多维声驻波中，特定压力波节平面内的声辐射力使得颗粒被捕获在这些平面内的几个不同的点处。颗粒的捕获导致形成颗粒团簇，其尺寸不断增大，并且在达到临界尺寸时，由于增强的重力或浮力沉降而不断地从初级流体中沉降或从初级流体中上升。例如，可以配置空间图案，例如，通过调节提供给换能器的声透射频率和/或相位、功率、电压和/或电流，或流体速度或流速，以允许培养的细胞自由流动通过同时捕获支撑结构(例如珠或微泡)，从而至少将捕获的支撑结构与流体中的细胞或其他材料分离。
95.在一些示例性实施方式中，在超声学换能器和反射器之间生成一个或多个多维声驻波。声波不断地从声学换能器发射出来，并被反射器反射，与发射的声波发生干涉，形成声驻波。声驻波的形成可能取决于许多因素，包括频率、功率、介质、换能器和反射器之间的距离等等。驻波可以在换能器或反射器处偏移，使得局部最小值或最大值与换能器或反射器间隔开。反射波(或由相对的换能器生成的波)可以与换能器生成的波同相或异相。驻波的特性可以通过施加到换能器的驱动信号来调制和/或控制，例如通过调制和/或控制驱动信号的相位、幅度振幅或频率。声学透过的或响应的材料也可以与换能器或反射器一起使用，以调制和/或控制驻波。
96.当流体混合物在超声学换能器和反射器之间流动，或在两个面对的超声学换能器之间流动时，在其之间建立有一个或多个多维声驻波，颗粒或次级流体群聚、聚集、凝聚、团聚、结块或聚结。材料的群聚可能发生在多维声驻波的波节或波腹处，这取决于颗粒或次级流体相对于宿主流体的声学对比因子。当团簇已经增长至大到足以克服多维声驻波的捕获力的尺寸时，颗粒形成团簇，最终离开多维声驻波的波节或波腹。例如，团簇的大小增长到重力或浮力变得超过声学或流体拖曳力的程度，导致团簇分别下沉或上升。对于比宿主流体密度更大的流体/颗粒，例如大多数细胞的情况，团簇会下沉并且可以与澄清的宿主流体分开而被收集。对于密度低于宿主流体的流体/颗粒，有浮力的的团簇会向上漂浮并可以被收集。
97.声场对颗粒的散射产生二次声场力，其有助于将颗粒或液滴驱动在一起。多维声驻波产生三维声辐射力，其用作三维捕获场。当颗粒相对于波长较小时，声辐射力与颗粒的体积(例如半径的立方)成正比。该力与频率和声学对比因子成正比。力随声能变化(例如声压幅度的平方)。当施加在颗粒上的声辐射力大于流体拖曳力、浮力和重力的综合作用时，
颗粒就会被捕获在声驻波中。多维声驻波中的颗粒捕获导致被捕获的颗粒的群聚、集中、凝聚和/或聚结。因此，可以通过增强的重力/浮力分离将一种材料的相对大的固体与不同材料的较小的颗粒、相同材料的较小的颗粒、和/或宿主流体的较小的颗粒进行分离。
98.多维驻波在多个方向上产生声辐射力，包括在声波传播方向上和在与声波传播方向横向的方向上。当混合物流过声室时，悬浮中的颗粒在驻波的方向上遭遇一个强的轴向力分量。由于该声场力穿过(例如垂直于)流动方向，因此它与流体拖曳力的方向不一致。因此，声场力可以将颗粒快速移动到压力波节平面或波腹平面，这取决于颗粒的对比因子。横向声辐射力的作用是使集中的颗粒朝着每个平面波节的中心移动，从而导致群聚、凝聚或结块。横向声辐射力分量可以为这种颗粒的团块克服流体拖曳力，以使团块不断生长，这些团块可以由于占支配地位的重力或浮力而离开混合物。随着颗粒团簇尺寸增大，每个颗粒的拖曳力下降，以及随着颗粒团簇尺寸增大，每个颗粒的声辐射力下降，其可单独地或共同地影响声分离器装置的操作。在本公开中，多维声驻波的横向分量和轴向分量处于相同的或不同的数量级。在由单个换能器生成的多维声驻波中，轴向力可以与横向力相当。这种多维声驻波的横向力远高于平面驻波的横向力，通常高出两个或更多数量级。
99.通过以激发换能器的基本3d振动模式的频率激发压电材料来获得针对各种模式(包括形成屏障或用于群聚)生成的多维声驻波。换能器可以由可以被扰动以产生超声波的各种材料组成。例如，换能器可以由压电材料组成，包括压电晶体或多晶体。在超声学换能器中扰动可以是压电晶体或多晶体的压电材料，以实现多模响应，从而产生多维声驻波。压电材料可以专门设计为在设计频率下以多模响应变形，从而产生多维声驻波。多维声驻波可以用压电材料的不同模式来生成，例如生成九个单独的多维声驻波的3x3模式。借助于使压电材料通过许多不同的模式形状振动，也可以生成大量多维声驻波。因此，可以选择性地激发材料以在多种模式运行，例如0x0模式(即活塞模式)、1x1、2x2、1x3、3x1、3x3和其他更高阶模式。可以操作该材料逐一地或跳过一个或多个模式地循环通过各种模式，并且不必在每个循环中以相同的顺序。这种模式之间的材料切换或抖动允许在指定时间内生成各种多维波形，以及单活塞模式波形。换能器可由压电材料组成，例如压电晶体或多晶体，其可由pzt-8(锆钛酸铅)制成。这样的晶体可以具有1英寸数量级或更大的主要尺寸。压电材料的谐振频率标称可以是约2mhz，并且可以在一种或多种频率下操作。每个超声学换能器模块可以包括一个或多个晶体。多个晶体可以各自充当单独的超声学换能器，并且可以由一个或多个控制器控制，这些控制器可以包括信号放大器。换能器的控制可以由计算机控制来提供，该计算机控制可以被编程以向换能器的驱动器提供控制信号。计算机控制提供的控制信号可以控制驱动器参数，例如频率、功率、电压、电流、相位或用于激发压电材料的任何其他类型的参数。压电材料可以是正方形、矩形、不规则多边形，或通常为任意形状。换能器用于产生压力场，该压力场在横向和轴向上产生相同数量级的力。
100.在一些实例中，压电材料的尺寸、形状和厚度可以确定在不同激发频率下的换能器位移。具有不同频率的换能器位移可用于瞄准声投射流体中的某些材料。例如，具有较短波长的较高频率可以针对较小尺寸的材料。具有较长波长的较低频率可以针对较小尺寸的材料。在这些频率较高和较低的情况下，不受声波影响的材料可穿过而没有显著变化。高阶模态位移可以在声场中所有方向上产生具有强梯度的三维声驻波，从而在所有方向上产生强的声辐射力，例如，这些力的大小可能相等，从而导致多个捕获线，其中俘获线的数量与
换能器的特定模式形状相关。
101.本文所述的换能器的压电晶体可以通过改变驱动参数(包括频率)，在各种响应模式操作，以激发晶体。每个操作点都有理论上无限数量的叠加的振动模式，其中一个或多个模式占主导地位。在实践中，在换能器的任意操作点都存在多种振动模式，其中一些模式在给定的操作点占主导地位。
102.参考图2，示出了在界面屏障模式操作的系统200。声界面区域202用于阻拦珠204穿过声波206。声波206由声学换能器208生成，声学换能器208连续地发射声波，声波被反射器210反射以产生具有局部最小值(波节)和最大值(波腹)的驻波。可以在界面区域202处的声波206的上游侧产生压力上升(pressure rise)以及声辐射力，其作用在进入的悬浮颗粒上。界面区域202(也称为提供边缘、边界或屏障效应)可以充当某些材料或颗粒的屏障。在系统200中，大多数或基本上所有的珠204被阻止进入声波206。其他材料可以穿过界面区域202。声波206被配置为影响珠204，而其他材料经受较低的影响，以允许它们穿过声波206。
103.界面区域202位于由声学换能器208声透射的流体体积的上游边界表面或区域。例如，流体可以流过界面区域202以进入流体的声投射体积并沿下游方向继续。声驻波206的频率可以被控制以具有期望的特性，例如，使得不同对比因子的材料可以被声驻波206拦阻，或允许通过声驻波206。可以生成并控制界面区域202以影响例如要保留的第一尺寸范围的颗粒。可以生成并控制声驻波206以允许例如不同于第一尺寸范围的第二尺寸范围的颗粒穿过。可以调制形成界面区域202的声驻波206，以阻拦选择性材料，或使其穿过。当流体流过由声驻波206生成的声场时，调制可用来在不同时间阻拦选择性材料，或使其穿过。
104.在一些示例性实施方式中，声驻波206产生三维声场，在由实现为矩形换能器的换能器208激发的情况下，可以将其描述为跨越流体流动的方向，占据大致矩形棱柱体体积的流体。声波206可以作为驻波生成。声波206的生成可以通过跨越流体流动的彼此面对的两个换能器来实现。单个换能器，例如换能器208，可用于发射朝向界面边界区域穿过流体的声波206，该界面边界区域提供声学特性的改变，例如可通过腔室壁或反射器210实现。从界面边界反射的声波有助于与从换能器208发射的声波形成驻声波。在以不同的或变化的流速运行期间，界面区域202的位置可以向上游或下游移动。
105.由声驻波206产生的声场在界面区域202处的流体和材料上施加声辐射压力(例如，压力上升)和声辐射力。辐射压力影响流体中的材料，以阻拦具有某些特性的上游材料进入声场。具有与被阻拦材料不同特性的其他材料被允许随着流体流动穿过声场。影响材料或颗粒是被声场阻拦还是穿过声场的特性包括材料的可压缩性、密度、尺寸和声学对比因子。可以影响声波的生成或调制的参数包括频率、功率、电流、电压、相位或用于操作换能器208的任何其他驱动参数。影响声波206的其他参数包括换能器尺寸、形状、厚度以及腔室尺寸和流体参数，例如密度、粘度和流速。
106.参考图3，图示了以聚类模式(clustering mode)操作的系统300。在超声学换能器308和反射器310之间产生一个或多个多维声驻波306。声波从声学换能器308连续发射并被反射器310反射以与发射的波产生干涉，从而形成具有局部最小值和最大值，或者分别是波节和波腹的驻波306。反射波(或由相对的换能器生成的波)可以与换能器生成的波同相或异相。驻波的特性可以通过施加到换能器308的驱动信号来调制和/或控制，例如通过调制和/或控制驱动信号的相位、幅度振幅或频率。声学透过的或响应的材料也可以与换能器
308或反射器310一起使用，以调制和/或控制驻波306。
107.在聚类模式中，珠304、珠复合体314和/或颗粒(例如细胞)在多维驻波306内群聚、聚集、凝聚、团聚、结块或聚结。取决于珠304或颗粒相对于宿主流体的声学对比因子，群聚可以发生在多维声驻波306的波节或波腹处。例如，具有正声学对比因子的珠304、珠复合体314或颗粒被驱赶到多维声驻波306的波节，而具有负声学对比因子的珠304、珠复合体314或颗粒被驱赶到波腹。群聚的珠304、珠复合体314或颗粒形成团簇312，当团簇312已经生长至尺寸大到足以克服多维声驻波306的保留力时，其最终离开多维声驻波306的波节或波腹。例如，随着团簇312在多维声驻波306中的尺寸增大，重力或浮力开始超过声场力和/或流体拖曳力。一旦团簇312的尺寸大到足以导致团簇312上的重力或浮力超过声场力和/或流体拖曳力，团簇312就离开多维声驻波306。
108.对于例如具有正声学对比因子的珠304、珠复合体314或颗粒，团簇312通常随着重力而下沉。对于例如具有负声学对比因子的珠304、珠复合体314或颗粒，团簇312通常随着浮力而上升。重力没有示出在图3中，并且系统300的朝向可以为重力与流体流动方向一致或重力与流体流动方向相反。在重力与流体流动方向相反的情况，团簇312被图示为由于重力而下沉。在重力与流体流动方向一致的情况，团簇312被图示为由于浮力而上升。
109.在这种操作模式中，珠304和珠复合体314通过下沉或上升而离开声波，被保留在腔室中。在这种模式，珠倾向于轻微地群聚，并倾向于在腔室中重新分布，以允许与靶材料或细胞进行额外的相互作用。此外，可以向腔室提供搅拌器，以促进群聚的珠的运动和重新分布。
110.在多维声驻波306中，颗粒(例如细胞类型a)没有被捕获。类型a细胞和多维声驻波306的特性允许类型a细胞穿过而不被捕获和/或群聚。类型b细胞与珠304结合，以形成珠复合体314。因此，类型b细胞本身可以穿过多维声驻波306，但如果与珠304结合，则可以被驱赶进入团簇312。
111.参考图4，图示了流化床系统400的设置。流化床由具有约10％至约30％填充范围的球形珠组成。声学换能器附接到容纳流化床的柱的顶部。在柱的底部提供连接，用于引入或去除可能夹带珠、细胞或其他材料的流体。系统400的配置和操作可以用控制器控制，控制器提供信号以操作换能器的驱动器以及流体控制装置，例如泵、阀或开关。控制器接收来自传感器的反馈，这些传感器可以包括浊度传感器、流体流量传感器和/或阀门传感器。控制器还接收来自声学换能器的反馈，以有助于提供闭环换能器控制。一个或多个换能器的不同操作模式可以由控制器实现。根据本文讨论的实例，控制器可用于为系统400提供自动化操作。例如，可以为控制器提供多个自动化配置文件，操作员可以从中选择以实施自动化的声学亲和细胞选择过程。如图4所示，声学换能器以一种模式使用，以生成如上所述的边缘效应或界面区域。使用在这种模式操作的传感器对柱的通量进行的测试已经建立了一些关于流速和流量的指南，可以在柱中使用这些流速和流量，同时通过声驻波和边缘效应将珠保留在柱中。
112.参考图5，图示了流化床系统500。在该实例性实施中，柱502填充有亲和珠504，其可以在约10％至约30％填充的范围内，其中％填充表示珠的体积相对于整个柱的体积的百分比。珠504被提供有亲和结构，以结合靶细胞506。能够生成声场的声学换能器512耦合到柱502的顶部。在操作中，靶细胞506和非靶细胞508的混合物通过入口510进入到柱502中。
当细胞混合物流过柱502时，靶细胞506与珠504结合。由于缺乏互补的亲和结构，非靶细胞508倾向于不与珠504结合。随着混合物朝向换能器512流经柱502，珠504在柱502的流化床内自由移动。当珠504靠近由换能器512生成的声场时，它们被声学边缘效应阻拦和/或被捕获在声场内。在任何情况下，珠504都被阻止穿过柱502的输出端。当靶细胞506与珠504结合时，靶细胞506被阻止与它们所结合的珠504一起离开柱502。非靶细胞508受声场的影响不如珠504强烈，并且可以穿过声场并离开柱502。
113.与流化床系统500一起使用的这种亲和技术可以在单通道的基础上实施。系统500可以配置成可选择珠，以选择通过和离开柱502的材料，或选择结合到珠并保留在柱502中的材料。通过或保留材料可以是阳性选择或阴性选择。
114.参考图6，图示了亲和分离过程600。过程600包括外部孵育步骤，在该步骤中，亲和珠和细胞结合在一起以获得珠复合体。流体中的珠复合体和未结合的材料的混合物被送入柱602。随着流体混合物沿着柱602行进，珠复合体被换能器604生成的声场引导到柱602中。未结合的材料穿过声场离开柱602。该分离步骤保留了珠复合体，同时去除了大部分未结合的材料。一旦珠复合体被加载到柱602中，可以通过在柱602的底部引入缓冲液来实施冲洗过程。剩余的未结合的材料与缓冲液一起移动，通过换能器604生成的声场。珠复合体也随着缓冲流体沿柱602移动，但被声场阻拦而不能离开。
115.过程600提供了许多有利于材料亲和分离的特征。例如，靶材料与珠的结合可以在外部进行，这也允许灵活的孵育步骤。声学分离提供了一种温和且高通量的分离过程，可快速减少与珠复合体混合的未结合材料的数量。例如，分离过程可以在不到一小时的时间内完成。过程600还可以是灵活地可扩展的，并且可以处理约10ml到约1l范围内的处理量。此外，所有类型的珠都可以在过程600中使用，从而为独特的或定制的亲和分离过程提供显著的灵活性。
116.参考图7，图示了流化床系统700。提供了柱702，其可以实现为图4-6中所示的任何柱。在第一次洗涤过程中，柱702装载有亲和珠。洗涤溶液穿过柱702，同时声学换能器704开启，以在柱702顶部附近生成声场。声场将亲和珠保留在柱702中，同时洗涤溶液穿过以洗涤亲和珠。实施捕获过程，在这个过程中，将细胞材料引入柱702。靶细胞材料与亲和珠结合以形成珠复合体，并且被声学换能器704生成的声场阻拦而不能离开柱702。非靶材料可以穿过声场，并且可以离开柱702。在捕获过程之后，提供冲洗过程，其中流体被引入柱702，以使非靶材料流出柱702。珠复合体通过由声学换能器704生成的声场抵抗流体流动而保留在柱702中。
117.系统700为亲和分离过程提供了许多有利的特征，包括内部珠结合和施加在柱702中的材料上的低剪切力。当使用较大的珠时，伴随低剪切力的内部珠结合可能很重要，因为与较大的珠相关的结合能可能更大。例如，对于靶细胞材料，可能需要更长的时间或更多的能量才能被较大的珠捕获。因此，较低的剪切力有助于避免阻碍与较大珠的结合。系统700可以使用声学换能器704来产生声学边缘效应，这可以导致提高的通量。例如，结合和分离的过程可以在2小时内完成。系统700还可以是可扩展的，并且可以处理约10ml到约1l范围内的处理量。系统700中采用的流化床可与珠或细胞一起，用于亲和分离和/或单独分离的目的。
118.参考图8，示出了细胞选择系统800。系统800包括设有搅拌机构804的柱802。搅拌
机构804可实施为靠近柱802底部的搅拌棒。可以在系统800中使用柱802作为流化床来实施亲和分离过程。柱802装载有亲和珠，例如在约10％至约30％填充的范围内。通过将流体引入柱802来洗涤亲和珠，同时声场由声学换能器806生成。流体离开柱802，而亲和珠被声场阻拦而不能离开。将细胞材料的混合物引入柱802中，同时声学换能器806在柱802顶部附近生成声场。随着声场的实施，所有的细胞材料与亲和珠一起被保留在柱802中。过量的流体可以穿过声场并离开柱802，而细胞和亲和珠被阻拦而不能离开。
119.在洗涤过程和细胞材料的引入期间，换能器806可以以不同的模式或以不同的特性操作，以在一种情况下阻拦亲和珠在洗涤过程中离开，而在另一种情况下，阻拦亲和珠和细胞物质二者离开。例如，保留亲和珠所使用的驱动换能器806的频率不同于保留细胞和亲和珠二者时使用的频率。
120.一旦柱802装载有亲和珠和细胞材料，就可以使用搅拌机构804来搅动柱802。搅动有助于在柱802内移动亲和珠和细胞材料。随着亲和珠和细胞材料在柱802内移动，针对靶材料的亲和结合过程可被增强。该孵育步骤可以在没有流体流动并且换能器806未通电的情况下实施。
121.一旦孵育/结合过程完成，可以洗涤亲和珠/靶材料复合体，并且可以从柱802中去除非靶材料。可以利用提供给柱802的溶液将靶材料与亲和珠分离，该溶液促进靶材料与亲和珠的分离。例如，溶液可以在缓冲液中包含酶(例如胰蛋白酶)。例如，靶材料然后可以从柱802中去除，而亲和珠被声学换能器806生成的声场保留。
122.参考图9，示出了用于在直柱中，采用单通道的阳性选择的亲和选择过程900。过程900开始于用亲和珠装载柱902并洗涤珠。在装载和洗涤过程期间，声学换能器904在柱902的顶部附近产生声场。然后将细胞材料的混合物送入柱902。靶材料与亲和珠结合形成珠复合体。未结合的材料通过声场离开柱902。靶材料与亲和珠一起保留在柱902中，而非靶材料离开柱902。通过将缓冲液引入柱902来洗涤珠复合体。将脱附缓冲液引入柱902，以使靶材料从亲和珠上脱附。随着声场就位，脱附的靶材料离开柱902并被收集，而亲和珠被保留。
123.参考图10，示出了用于在直柱中，采用单通道的阴性细胞选择的亲和选择过程1000。过程1000开始于用亲和珠将柱1002加载到所需的空隙比例(void fraction)。加载过程可以在声学换能器1004从柱1002移除的同时实施。将声学换能器1004连接到柱1002的顶部，通过引入缓冲液洗涤亲和珠。该洗涤过程还用于使珠体积膨胀以形成流化床。随着声学换能器1004生成声场，细胞材料的混合物被送入柱1002。靶材料与亲和珠结合形成珠复合体。非靶材料通过声场离开柱1002。靶材料与亲和珠一起保留在柱1002中，而非靶材料离开柱1002并作为所需产物被收集。这种阴性细胞选择在单通道中从细胞材料混合物中去除靶材料。亲和珠可以是多重的，或配置为与多于一种类型的靶材料结合，这允许在单通道中进行多重的阴性选择。
124.参考图11，曲线图1100图示了针对声学流化床柱，使用声场的珠保留率与流体流入速率的关系。如曲线图1100所示，当流体流入速率从0增加到每分钟约10ml时，100％的珠被保留在柱中。随着流体流入速率增加到超过每分钟10ml，越来越多的珠穿过声场。曲线图1100中呈现的数据有助于理解导致珠穿过声场的突破流体流入速率。该测试使用平均直径为90μm、平均密度为1.033g/cc的sp sepharose“fast flow”珠。最终速度为52.2cm/hr。柱参数为：体积
–
40ml；高度
–
20cm；以及直径
–
1.6cm。膨胀后的空隙比例为70％，起始珠浓度为
7.86e+05个细胞/ml。操作参数为：频率
–
1mhz，以及功率
–
3w。
125.参考图12，曲线图1200图示了在声学亲和系统中回收的总活细胞与柱体积的关系，其中柱体积表示由柱体积标准化的系统输入量。如曲线图1200所示，在约半个柱体积之后，总的活细胞(以每毫升数百万个细胞计)显著增加。该数据显示了声学亲和系统中的结合效率。例如，在向流化床柱提供细胞材料进料的最初半柱体积期间，几乎没有观察到未结合的细胞。
126.参考图13，曲线图1300示出了离开流化床柱的珠根据粒径的直方图。图1300显示，在较低流速下，小颗粒从柱中逸出，而较大的颗粒被保留。此外，逸出颗粒的平均尺寸随流速增加。
127.参考图14，图示了具有再循环的用于实施声学亲和细胞选择的流化床系统1400。系统1400包括柱1402和声学换能器1404。柱1402包括环形的肋1406，其可以阻止流体流动并迫使流体流向柱1402的中心。肋1406可以有助于防止不希望的影响，例如柱1402内的沟流。
128.系统1400的操作与上文所述类似。例如，系统1400可用于阳性或阴性选择，并可采用声学换能器1404的不同操作模式。系统1400示出了通过为靶细胞提供更多与柱1402中的珠结合的机会，使用再循环来改善靶细胞回收。在将珠加载到柱1402中并洗涤之后，将第1通道的进料供应到柱1402。收集来自第1道进料的柱1402的流出物，以用作第2通道的进料。第2通道的进料用作后续再循环通道中进料供应的输入。尽管未示出，但第2道进料可生成流出物，其可被收集用于另一次后续再循环通道。可以使用任何数量的再循环。本文讨论的每个实例系统和流化床都可以配置为具有多个再循环通道。
129.参考图15，图1500示出了具有多个再循环进料通道的流化床系统中的纯度(p)和回收率(r)。图1500显示，纯度保留在高水平，对于1次和2次通道循环，纯度大于90％，对于3次通道循环，纯度大于80％。细胞的回收率随着每一次再循环通道而增加，在第三次再循环时接近100％。
130.参考图16，示出了具有功能化材料的珠的示例性实施方式。珠被配置为对细胞上的cd3受体具有亲和力。珠可以用链霉亲和素、单体亲和素、蛋白a和/或抗cd3包被。生物素-抗cd3复合体可用于为细胞上的cd3受体提供亲和靶标。抗-cd3-生物素抗体可以被抗-tcr-生物素抗体替代或取代。链霉亲和素包被的珠可以提供比其他类型的包衣更大的结合表面积。例如，与其他包衣相比，链霉亲和素包被的珠可以具有更高的细胞结合/cm2比率。术语包衣用于指代珠表面上的功能化材料，并且可以覆盖珠的部分或全部表面。可替代地，或者另外地，珠的一部分可以用链霉亲和素包被，而另一部分可以用另一种功能化材料包被以实施多重亲和过程。
131.参考图17，其中图示了不同类型珠的尺寸分布。y轴以百分比表示，而x轴以微米为单位表示大小。该图说明了ge sepharose珠和abt珠的不同的尺寸分布。珠分布在大于细胞尺寸的尺寸上。珠和细胞之间的尺寸差异可以用作声学对比因子以区分和分离珠和细胞。
132.参考图18，其中图示了不同种类的珠的结合率。结合率是针对100,000个细胞的初始细胞群。y轴代表细胞/cm2，x轴代表不同类型的珠。如图所示，平均直径为34μm的sepharose珠，获得了超过30,000个细胞/cm2的结合率。平均直径为65μm的promega珠，获得了约65,000个细胞/cm2的结合率。平均直径为70μm的pluribeads，获得了高于sepharose
珠，但低于40,000个细胞/cm2的结合力。
133.参考图19，图示了不同亲和系统之间的比较分析的图。一个系统使用apc和抗cd3，而另一个系统使用apc、抗生物素、生物素和抗cd3。如图所示，包含生物素的系统导致约65％的结合，而不含生物素的系统导致约55％的结合。比较实施例包括抗cd3-荧光团与抗cd3-生物素+抗生物素-荧光团。
134.参考图20，图示了多个图表，表示不同抗体滴定比的细胞计数。如图所示，随着滴定比的增加，细胞群具有更大的分离度。
135.参考图21，其中示出了每毫升细胞计数与柱体积的关系的色谱图。柱体积是指夹带被送入流化床的或在流化床中再循环的材料的流体量。理想的是在流体流过柱时实现活塞流。
136.参考图22，其中示出了柱流出物的细胞数随时间变化的曲线图。柱流出物的浊度与细胞浓度密切相关。
137.进行了几个声亲和细胞分离的实验测试。测试的结果列于下文的表中作为实例。
138.实施例1
139.在测试的第一天，使用不同的细胞浓度(100e6/ml和10e6/ml)和不同的捕获抗体组合(仅抗tcr a/b对比抗tcr a/b和抗cd52)进行了四次流化床平台测试。初始进料浓度(100e6/ml和tcr a/b-群体为74-78％)。
140.将所有样品与表1中列出的相应捕获抗体组合在2％bsa的pbs中，在ika滚轴混合器(30rpm)上孵育20分钟。细胞用2％bsa的pbs洗涤两次，最后重悬于10ml的2％bsa的pbs中。取出一个样本进行流式细胞术，并用作测试a到d的初始群体。接下来，将4ml50％固体promega珠浆装入流化床柱中，并用30ml的2％bsa的pbs溶液洗涤以去除残留的乙醇和颗粒。该初始洗涤步骤以1ml/min的流速和0.75w的功率进行。
141.然后使用装有亲和素缀合的甲基丙烯酸酯珠(promega)的流化床装置对进料细胞群进行分离，该装置在以下条件下运行：流速-1ml/min以及功率-0.75w。在将整个样品装入流化床后收集第一级分，标记为流出物。在用30ml 2％bsa的pbs溶液以1ml/min和0.75w冲洗流化床后，收集第二级分，标记为冲洗液。执行此冲洗步骤以确保回收所有未捕获的细胞。一旦这个过程完成，柱的剩余内容物被回收并做为第三级分收集，标记为滞留物。收集来自所有三个级分的样品用于流式细胞术。为了进行质量平衡，记录了每个级分的质量和细胞计数。
142.表1流化床(fb)平台测试参数
[0143][0144]
在通过流化床单元进行分离后，所有样品的纯度提高了约15％，其中初始细胞群由76％tcr敲除细胞组成。在较高细胞浓度(100e6个细胞/ml)进行的测试中，样品a和b在流
出物中的纯度分别为13％和10％，在冲洗液中分别为11％和8％，这显示在第二级分中纯度略有下降。样品a和b的滞留物(holdup)级分的纯度分别为73.2％和68.1％，表明未达到100％纯度。在较低细胞浓度(10e6个细胞/ml)进行的测试中，在样品c和d中获得了更高纯度的流出物级分，分别为90.5％和92.4％，冲洗液级分的纯度甚至更高，分别为94.8％和93.2％。该结果表明，在流化床装置使用的当前条件，较低的细胞浓度是更好的。总体而言，与使用抗tcr作为唯一的捕获抗体相比，使用抗tcr和抗cd52的组合作为捕获抗体没有产生显著不同的纯度。
[0145]
表2流化床测试的tcr a/b-纯度和回收率
[0146][0147]
每次测试的总tcr回收率等于流过和冲洗级分中tcr细胞的总和除以起始tcr细胞计数(参见附录中的公式6)。tcr-细胞可以通过两种机制保留在流化床系统中：声学保留和低效冲洗。与流体流动施加的拖拽力相比，当自由细胞经受来自声场的更大的力时，发生声学保留。这种情况在高功率流速比时产生，并可以通过优化操作条件来防止。细胞还倾向于分散到系统的体积中，因此需要进行冲洗步骤以提高回收率。冲洗步骤应当具有均匀的速度分布，否则当进入的洗涤缓冲液与流化床混合时，需要大体积的缓冲液来回收tcr细胞。可以通过提高冲洗速度和体积以及改进流化床入口设计来减少这种类型的细胞保留。
[0148]
对于每次流化床测试，总tcr-cell回收率见表2。
[0149]
在测试高细胞密度(100e6/ml)时，回收率最低。测试a和b的tcr回收率分别为7％和5％。在这些测试中可观察到柱中的“堵塞”效应，其中珠和细胞以非常大的团簇凝聚在一起。这些固体团块并不表现为流体，而是在柱中形成沟流并阻止细胞逃逸。当柱被污染时，也可能发生非特异性结合。
[0150]
测试c和d具有相似的回收率，分别为34％和33％。10e6/ml的两次测试表现如预期，但tcr细胞回收率仍然相对较低。这是由于前文所述的低流体速度和低效冲洗步骤，并且可以通过优化操作条件和改进流化床入口设计来改善。改变抗体对细胞回收率的影响很小。
[0151]
实施例2
[0152]
使用不同的亲和珠类型(promega、dynabead、polystyrene 6μm和14μm)进行了四次声学分离器单元测试。在第2天，使用固定抗体组合(抗tcr和抗cd52)和分别为0.15ml和0.052ml的抗体体积。初始tcr a/b-群体为77％。
[0153]
所有样品与抗tcr和抗cd52一起在2％bsa的pbs中，在ika滚轴混合器(30rpm)上孵育20分钟。用2％bsa的pbs洗涤细胞两次。取出一个样品进行流式细胞术，并用作测试a到d
的初始群体。将样品与表3中列出的相应珠候选物一起，在ika滚轴混合器上(30rpm)在10ml的2％bsa的pbs中孵育30分钟，然后使用在以下条件下操作的声学分离器单元进行分离；流速-1ml/min以及功率-0.75w。在整个样品通过声场后收集第一级分，标记为流出物。在用30ml2％bsa的pbs溶液冲洗流化床后，收集第二级分，标记为冲洗液。执行此冲洗步骤以确保回收所有未捕获的细胞。一旦这个过程完成，柱的剩余内容物被回收并做为第三级分收集，标记为滞留物。收集来自所有三个级分的样品用于流式细胞术。为了进行质量平衡，记录了每个级分的质量和细胞计数。
[0154]
表3声学分离器(ac)平台测试参数
[0155][0156]
在通过声学分离器单元进行分离后，所有样品的纯度提高了约13％，其中初始细胞群由77％tcr敲除细胞组成。与dyna珠一起孵育的样品在流出物级分中的纯度最高，为89.4％，而与聚苯乙烯(10-14μm)珠一起孵育的样品的纯度最低，为84.3％。这种趋势在冲洗级分中也被观察到，其中与dyna珠孵育的样品纯度为91.1％，与聚苯乙烯珠孵育的样品纯度为84.5％。所有样品的纯度从流出物(84.3％-89.8％)到冲洗级分(84.6％-91.1％)略有增加。
[0157]
表4流化床测试的tcr a/b-纯度和回收率
[0158][0159]
每次声学分离器系统测试的总tcr-细胞回收率见表4。在该图表中，回收率似乎受珠类型的影响，50μm的promega珠具有80％的tcr-细胞回收率，而4.5μm的dyna-珠仅具有17％的回收率。两种聚苯乙烯颗粒具有相似的回收率，6μm和14μm珠的回收率分别为26％和27％。由于每次测试都是在相同的操作条件下进行的，获得相似的回收率，因此这种关系应该在未来的工作中得到确认。与在流化床中一样，可以通过提高流速和改进入口和收集器设计来增加声学分离器系统中的tcr回收率。
[0160]
实施例3
[0161]
执行了两个流化床(fb)过程和两个声学分离器(as)过程。在流化床单元上测试了
不同的泵系统(注射泵和蠕动泵)，并在测试的第一天在声学分离器单元上测试了两个新的珠候选物。初始进料浓度为107个细胞/ml，tcr a/b-群体约为80％。
[0162]
样品制备和声学单元操作程序与前面的实施例相同。简而言之，将流化床的进料样品与生物素化的抗tcr a/b抗体(表5)在2％bsa的pbs中，在ika滚轴混合器上孵育20分钟(30rpm)。细胞用2％bsa的pbs洗涤两次，最后重悬于10ml的2％bsa的pbs中。对于声学分离器单元的进料样品，珠孵育之后是抗体细胞孵育。分别收集来自每个进料样品的1x106个细胞用于流式细胞术，并用作每个测试的初始群体。
[0163]
流化床柱装有2ml promega珠浆(亲和素缀合的甲基丙烯酸酯珠)，然后用30ml的2％bsa的pbs溶液洗涤以去除残留的乙醇和颗粒。该初始洗涤步骤以3ml/min和2.25w进行。第1天评估了两种不同的泵(注射泵-fb_a和蠕动泵-fb_b)。然后使用填充有promega珠的流化床单元分离进料细胞群，其在3ml/min和4ml柱体积下操作。对于声学分离器单元操作，在以下条件分离带有珠标记的进料；流速-1ml/min以及功率-0.75w。
[0164]
为了进行性能评估，从三个不同的级分收集和分析两个单元的处理的样品——流出物、冲洗液和滞留物(表6)。在将整个样品装入流化床后收集处理的样品的第一级分，标记为流出物。在用30ml2％bsa的pbs溶液冲洗流化床后，收集第二级分，标记为冲洗液。对于确保回收所有未捕获的细胞，此冲洗步骤是必要的。一旦这个过程完成，柱的剩余内容物被回收并做为第三级分收集，标记为滞留物。收集来自所有三个级分的样品用于流式细胞术。记录每个级分的质量和细胞浓度计数以用于细胞回收率评估。
[0165]
表5流化床(fb)和声分离器(as)单元测试参数(珠体积＝1cc，浆液体积＝4ml。
[0166][0167]
通过流化床单元分离后，所有样品的纯度增加了约11～12％，而通过声学分离器单元分离后几乎没有变化，其中初始细胞群由80％tcr敲除细胞组成(表6)。对于流化床测试，在流出物和冲洗液级分中，蠕动泵(fb_a)和注射泵(fb_b)导致相似的纯度水平(90～92％)。除了流化床测试，两种不同的微米级生物可降解颗粒候选物(as_a
–
plga和as_b
–
蜡)在声学分离器单元中进行了测试。
[0168]
表6还示出了回收率结果。采用蠕动泵(fb_a)和注射泵(fb_b)的流化床分别显示78％和61％的tcr
–
回收率。根据该结果，fds决定使用蠕动泵用于即将进行的平台验证。蠕动泵可实现进一步工艺优化和封闭系统开发的灵活性。用于plga和wax的声学分离器导致低的回收率(分别为50％和38％)。
[0169]
表6流化床(fb)和声学分离器(as)单元测试参数
[0170][0171]
实施例4
[0172]
使用不同的操作程序进行了四次流化床单元测试。通过处理样品的再循环或通过将样品在柱中保留更长的时间来增加进料细胞在柱中的保留时间。初始进料浓度为107个细胞/ml，tcr a/b-群体约为80％。
[0173]
对流化床单元的进料和初始珠加载执行与第1天相同的程序。表7示出了四种不同的操作程序，无再循环(fb_e，no recirc.)，一次再循环(fb_f，1recirc.)，4次再循环(fb_g，4recirc.)以及停止和流动(fb_h，stop and flow)。具体而言，在停止和流动条件，将2.5ml的进料样品加载(3ml/min)并停止流动3分20秒。重复此过程，直到所有进料体积都加载到柱中。所有进料细胞在高功率条件(4.5w)下保留在柱中总共13分20秒。一旦再循环步骤和停止和流动步骤完成，用30ml 2％bsa溶液冲洗柱。在第1天收集和分析处理的样品。
[0174]
表7流化床(fb)平台和声学分离器(as)单元测试参数(珠体积＝1ml)
[0175][0176]
分离后，所有样品的纯度增加了约9-18％，其中初始细胞群由80％tcr敲除细胞组成(表8)。一次再循环(fb_f)在流出物和冲洗液部分中分别得到95.6％和97.7％的纯度。值得注意的是，4次再循环(fb_g)显示出低的纯度，并且我们观察到由于4次再循环，温度有所升高。温度升高也发生在停止和流动条件(fb_h)。
[0177]
表8流化床和声学分离器测试的tcr a/b-纯度和回收率
[0178][0179]
对于tcr a/b-回收率，再循环以及停止和流动条件显示出良好的结果。添加更多的再循环步骤显示出更好的回收率(1次再循环-82.64％，并且4个再循环98.89％)，并且停止和流动条件也导致高的回收率(85.75％)。
[0180]
根据本公开，讨论了提供许多有利特征的声学亲和系统。例如，本文讨论的系统和方法可以提高靶细胞材料的回收率和纯度。该系统和方法是可扩展的，能够处理相对宽范围的材料体积。可以根据本公开实施阳性选择和阴性选择。阳性选择可以包括使用血液成分除去法的产物的实施方式。可以在多重的基础上实施阴性选择和阳性选择，其中可以在一次通道选择多种类型的细胞材料。本文讨论的系统和过程可以是完全自动化的，并且可以被认为与消耗性组件一起使用。声学亲和细胞选择系统可以与细胞浓缩物洗涤装置和/或系统集成，以用于下游应用。
[0181]
基因和细胞疗法在治疗癌症和自身免疫等危及生命的疾病方面显示出巨大的希望。治疗开发，例如用于血癌的干细胞移植或嵌合抗原受体t细胞(car-t)疗法，可能会使用来自血液或血液成分除去法的产物的初始群体的细胞选择。
[0182]
为了开发car-t疗法，需要从血液或血液成分除去法的产物中分离外周血单核细胞(pbmc)，包括t细胞、b细胞、单核白血球、nk细胞和其他细胞，例如嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞。现有的分离技术包括密度梯度离心(物理的、无标记选择)和基于表面标记物表达的选择(亲和、标记选择)。这些技术可用于分离cd3+t细胞或cd3+t细胞的cd4+/cd8+亚群。t细胞，其数量可能在从约5亿到约10亿的范围内，可以被活化，用病毒转导以表达靶向嵌合抗原受体(car)的癌细胞，并在最终配制给患者的剂量之前进一步扩增。将配制的细胞产品输注到收集细胞的同一患者体内进行自体治疗，或输注到多名患者体内进行同种异体治疗。
[0183]
用于此类基于细胞的疗法的上述技术往往涉及复杂、漫长且昂贵的制造过程。此外，在这种car-t制造中的最终产品的质量控制过程会增加总时间，其可能会耗时两周，每位患者的成本约为40万美元。随着对细胞亚型的更精细分离的实施，该过程变得更长且成本更高。例如，动物研究强烈表明，使用cd4+和cd8+群体中的定义的t细胞亚群可能具有治疗优势，例如car-t疗法的体内持久性，而包括效应和记忆显型的t细胞亚群的其他组合可以影响t细胞治疗的短期效率和长期持久性。在一个商业实施例中，juno therapeutics正在使用定义的cd4/cd8 t细胞亚群来靶向cd19+b细胞，以治疗非霍奇金淋巴瘤。
[0184]
密度梯度离心是目前较流行的细胞分离技术之一，是一种手动的、低分辨率和不可扩展的过程。使用磁性活化细胞分选(macs)进行细胞选择，其通过潜在的细胞毒性磁性纳米颗粒进行标记，具有有限的通量。在实践中，多个macs细胞选择是按顺序进行的(例如，
首先选择cd4+，然后选择cd8+)，并且它们倾向于收集所有靶向细胞。这种条件意味着用于car-t制造的任何所需的起始比率都是手动准备的，方法是对从macs过程中获得的每种细胞类型计数，然后将正确数量的细胞混合在一起以获得所需的起始比率。考虑到患者之间的pbmc成分的可变性，这个过程变得更加成问题。
[0185]
本文讨论的声学导向的细胞选择过程提供了许多优于现有细胞选择技术的优点。本文讨论的应用于细胞选择的声学技术倾向于创建更快、更安全的过程，例如更小毒性的、封闭的、成本效益高的、稳健且能够更好地进行更精细的子分离，以更好的质量获得更易实现的细胞和基因疗法，包括改进的car-t细胞疗法。
[0186]
一种细胞选择技术包括使用基于角度声波的技术，用于从血液成分除去法的产物中捕获和洗脱免疫细胞。该技术有可能大大降低用于细胞和基因疗法的细胞分离和生产的成本和处理时间。该技术能够基于物理特性，例如如密度、大小、可压缩性和其他因素实现无标记分离，并允许在高通量和低剪切速率下对定义的细胞亚群进行多重选择。
[0187]
前面讨论的流化床系统可以实现声学亲和细胞选择(aacs)细胞分选。本文讨论的aacs使用施加在细胞上的声辐射力，用于在工艺规模上进行亲和标记的细胞选择，工艺规模例如是每秒超过一百万个细胞。这种细胞操作方法是可扩展的并且名义上是无剪切的。aacs流化床由含有亲和珠的柱组成，由于底部入口流动拖拽力和由声驻波产生的压力之间的平衡，亲和珠悬浮在柱中。流化床可以作为膨胀床系统操作，其中柱中的珠在整个柱体积中膨胀。由于珠之间的通道狭窄，填充的床系统(如macs)总是会产生高剪切或低流速。由于aacs流化床可以作为膨胀床操作，因此剪切力显著地降低，并且可以获得更高的流速。该系统的更高流速和可扩展性有助于减少car-t制造中亲和细胞选择的时间限制。例如，现有的细胞选择技术可能需要八小时的处理时间，这可能会损害细胞产品的质量。aacs系统有可能在两小时内完成这些细胞分离。
[0188]
aacs系统可用于car-t制造，具有多重细胞选择的有利优势。该系统可以配置为允许以定义的比率选择t细胞亚群。之前的细胞选择系统无法实现这种多重细胞选择。例如，macs系统有一个填充床，其由大珠组成，这些珠被磁化以吸引附着在亲和靶向细胞上的顺磁性纳米颗粒。填充柱会吸引所有纳米颗粒，而不考虑要选择的实际抗体-抗原对，这意味着如果要分离一种以上的靶标细胞类型，则可以使用顺序标记步骤。aacs系统可以具有针对不同靶标的采用抗体功能化的珠。流化床允许细胞和珠的自由移动和混合，同时使用声学将珠保留在柱中。可以在柱中使用采用不同抗体功能化的珠的比例，这样获得具有被分离的相应不同抗原的细胞的比例，从而能够实现例如以定义的比例的cd4/cd8细胞的同时、多重的选择。
[0189]
本文讨论了基于aacs的多重阳性细胞选择系统。多重aacs从所需的起始细胞群开始工作，所需的起始细胞群由t细胞总数和cd4与cd8 t细胞的比率定义。假设使用总共2亿个t细胞，以1:1的比例启动一个过程，则从血液成分除去法的产物中分离出1亿个cd4+和一亿个cd8+t细胞。可能希望获得这个数量的三倍，例如，每种t细胞亚型有3亿个，这样在制造失败的情况下，总是可以选择用剩余的细胞重新开始制造过程。在实践中，患者的pbmc数量和在血液成分除去法的产物中获得的cd4/cd8细胞的比率存在显著的差异。亚型可能是从患者的单采袋中获得的总pbmc的5％，并且优选至少占总数的5％。假设患者血液中pbmc的最低数量为100亿，预计每个单采袋中至少有5亿个cd4+和5亿个cd8+t细胞。因此，在aacs多
重细胞选择系统中，所需的总cd4+和cd8+细胞回收率至少为60％(包括最终纯度)。
[0190]
可以采用两种不同的方法来获得不同细胞表面标记物细胞类型的预定比例。第一种方法是使用不同比例的珠，以平等地结合和洗脱细胞(“珠比例法”)。第二种方法由以下组成：通过使用第一和第二次洗脱，对两种不同的珠类型使用不同的释放机制或操作。第一洗脱缓冲液1用于从珠1中洗脱细胞类型1，例如cd4，而洗脱缓冲液2将从珠类型2中洗脱细胞类型2，例如cd8，其中1和2由靶细胞表面标记物定义，在本例中为cd4和cd8。第二种方法被称为差异释放法。
[0191]
在这两种方法中，优选抗体附着在珠上而不是细胞上，尽管可以使用其中任一种附着。在某些情况下，例如当使用生物素-生物素化抗体排列时，抗体与细胞的附着可能导致两种靶细胞类型的捕获。使用的结合可以是i)细胞-生物素化抗体结合，然后是单体亲和素珠结合系统(“细胞优先”)或ii)单体亲和素珠-生物素化抗体结合，然后是流化床柱中的亲和细胞捕获(“珠优先”)。优选珠优先技术，以实现基于采用不同抗体功能化的珠的多重细胞选择。在一些实施方式中，可以使用多个柱(例如，一个柱用于cd4，一个柱用于cd8)。其他实施方式可以使用单柱(例如，cd4/cd8单柱混合物)。根据实施方式，可以使用不同的释放方法。例如，在多柱的情况下可以采用串联柱释放，而对于单个柱可以采用差异释放方法。在一些实施方案中，可以使用可切割的珠-抗体接头。多重细胞选择aacs过程可以使用具有cd4+和cd8+细胞的原代细胞的血液成分除去法的产物t细胞(或pbmc)进行，或者可以使用混合细胞系(例如，具有两种不同的标记物)来选择所需的细胞类型。
[0192]
参考图23和24，图示了用于多重细胞选择的过程。在图23中，可能是声驻波的声场用于阻拦珠离开柱，同时将含有不同细胞类型的样品施加到柱子上。在图24中，由珠功能化所靶标的类型的细胞，在这种情况下为链霉亲和素-生物素键，与珠结合以保留在柱中。非靶细胞穿过声场并离开柱。这些非靶细胞可以被输入到包含珠的连续的柱中，这些珠被功能化以捕获与图23和24中所示的采用柱靶标的细胞类型不同的特定细胞类型。被珠靶标的细胞被阳性选择，未被珠靶标的细胞被阴性选择(穿过声场，在柱外被收集)。
[0193]
上面讨论的方法、系统和设备是示例。各种配置可以适当地省略、替换或添加各种程序或组件。例如，在替代的配置中，可以以不同于所描述的顺序来执行方法，并且可以添加、省略或组合各种步骤。此外，关于某些配置所描述的特征可以结合在各种其他配置中。配置的不同方面和要素可以以类似方式组合。此外，技术不断发展，因此，许多要素是实施例，并不限制本公开或权利要求的范围。
[0194]
描述中给出了具体细节，以提供对实施例配置(包括实施方法)的透彻理解。然而，可以在没有这些具体细节的情况下实施配置。例如，众所周知的工艺、结构和技术已在没有不必要的细节的情况下显示，以避免使配置变得模糊。该描述仅提供实施例配置，并且不限制权利要求的范围、适用性或配置。相反，配置的前述描述提供了用于实现所描述的技术的描述。在不脱离本公开的精神或范围的情况下，可以对要素的功能和布置进行各种改变。
[0195]
此外，可以将配置描述为过程，该过程描述为流程图或框图。尽管每个都可以将操作描述为顺序过程，但许多操作可以并行或同时执行。此外，可以重新排列操作的顺序。一个过程可能具有图中未包含的其他阶段或功能。
[0196]
已经描述了若干实施例配置，在不背离本公开的精神的情况下，可以使用各种修改、替代构造和等价物。例如，上述要素可以是更大系统的组件，其中其他结构或过程可以
优先于或以其他方式修改本发明的应用。此外，可以在考虑上述要素之前、期间或之后进行许多操作。因此，以上描述不限制权利要求的范围。
[0197]
一个值超过(或大于)第一阈值的陈述等价于该值达到或超过比第一阈值稍大的第二阈值的陈述，例如，第二阈值是在相关系统的分辨率中比第一阈值高的一个值。一个值小于第一阈值(或在第一阈值以内)的陈述等价于该值小于或等于稍低于第一阈值的第二阈值的陈述，例如第二阈值是在相关系统的分辨率中比第一阈值低的一个值。