改善土壤的植物生产性的微生物的使用的制作方法

1.本发明涉及使用属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌的用于改善土壤的植物生产性的组合物、方法、和堆肥，以及用于增大植物的抗氧化活性的组合物、微生物、和堆肥。


背景技术：

2.通过工业的氮固定而制造的氨、石灰氮是氮质化学肥料或其原料，在现代农业中广泛用于作物栽培。然而，工业的氮固定中反应底物的一部分和反应所需的能量依赖于化石资源，其可持续性有限。另外，化石碳的大规模利用是损害地球环境的稳定性的主要原因之一。因此，因为增进生物的氮固定的农业利用的技术对于可持续的农业体系是不可缺少的，因此到目前为止广泛进行了关于给植物供应氮、促进植物的生长的微生物的研究。
3.已知土壤的菌相影响土壤的植物生产性，具体地，属于根瘤菌目(rhizobiales)、iii1-15目的细菌的存在比率与土壤的植物生产性显示正相关，另外，报告了属于酸杆菌目(acidobacteriales)、索利氏菌目(solibacterales)的细菌的存在比率与土壤的植物生产性显示负相关(非专利文献1)。然而，到目前为止，尚未确立人工地操作土壤的菌相的方法，因而使用这样的方法来改善土壤的植物生产性是困难的。
4.现有技术文献
5.非专利文献
6.非专利文献1：wang et al.,plos one,13,e0204085(2018)
7.非专利文献2：fujita et al.,soil science and plant nutrition,60,156-161(2014)
8.非专利文献3：kumar et al.,bmc research notes,5,137(2012)
9.非专利文献4：mohammed et al.,agronomy journal,109,309-316(2017)
10.非专利文献5：czarnik et al.,emirates journal of food and agriculture,29,988-993(2017)
11.非专利文献6：waraich et al.,australian journal of crop science,7,1551-1559(2013)


技术实现要素：

12.发明要解决的课题
13.本发明要解决的课题是通过操作土壤的菌相，改善土壤的植物生产性，以及通过增大植物的抗氧化活性，改善植物的生产性、其收获物的品质。
14.用于解决课题的手段
15.本技术发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究，反复实验的结果发现了，通过在土壤中添加属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌，从而土壤的菌相变化，由此能够有意义地改善植物的生产性这样的令人惊讶的知识。进而，本技术发明者们发现了，属于芽孢杆菌属(bacillales)的细菌、属于原小单孢菌属(promicromonospora)的细菌或属于橄榄
形菌属(olivibacter)的细菌增大植物的抗氧化活性这样的令人惊讶的知识。基于这些知识，完成了本发明。
16.本发明如下。
17.[1]用于改善土壤的植物生产性的组合物，包含属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌。
[0018]
[2]改善土壤的植物生产性的方法，该方法包括在所述土壤中添加属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌。
[0019]
[3]根据2所述的方法，所述植物是十字花科植物。
[0020]
[4]根据3所述的方法，所述十字花科植物是亚麻荠或小松菜。
[0021]
[5]根据2～4的任一项所述的方法，通过所述土壤的植物生产性改善，从而每株植物的鞘数、每株植物的种子数、和/或植物体的重量增大。
[0022]
[6]堆肥，包含属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌、以及属于放线菌目(actinomycetales)的细菌、属于芽孢杆菌目(bacillales)的细菌、属于gaiellales目的细菌、属于粘球菌目(myxococcales)的细菌、属于iii1-15目的细菌、属于土壤红杆菌目(solirubrobacterales)的细菌、属于黄单胞菌目(xanthomonadales)的细菌、属于伯克氏菌目(burkholderiales)的细菌和属于gemmatales目的细菌。
[0023]
[7]根据6所述的堆肥，所述堆肥中的所述属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌的存在比率为9％以上，且所述属于iii1-15目的细菌的存在比率为6％以下。
[0024]
[8]根据6或7所述的堆肥，用于栽培十字花科植物。
[0025]
[9]根据8所述的堆肥，所述十字花科植物是亚麻荠或小松菜。
[0026]
[10]用于增大植物的抗氧化活性的组合物，该组合物包含属于芽孢杆菌属(bacillales)的细菌、属于原小单孢菌属(promicromonospora)的细菌或属于橄榄形菌属(olivibacter)的细菌。
[0027]
[11]根据10所述的组合物，所述属于芽孢杆菌属(bacillales)的细菌是蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)，所述属于原小单孢菌属(promicromonospora)的细菌是柠檬原小单孢菌(promicromonospora citrea)，所述属于橄榄形菌属(olivibacter)的细菌是橄榄形菌种(olivibacter sp.)。
[0028]
[12]根据11所述的组合物，蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)是在专利微生物保藏中心以保藏号nite bp-02974保藏的菌株，柠檬原小单孢菌(promicromonospora citrea)是在专利微生物保藏中心以保藏号nite bp-03025保藏的菌株，橄榄形菌种(olivibacter sp.)是在专利微生物保藏中心以保藏号nite bp-03026保藏的菌株。
[0029]
[13]在专利微生物保藏中心以保藏号nite bp-02974保藏的菌株。
[0030]
[14]在专利微生物保藏中心以保藏号nite bp-03025保藏的菌株。
[0031]
[15]在专利微生物保藏中心以保藏号nite bp-03026保藏的菌株。
[0032]
[16]包含13～15的任一项所述的菌株的堆肥。
[0033]
发明的效果
[0034]
根据本发明，通过土壤的植物生产性改善、每株植物的鞘数、每株植物的种子数、和/或植物体的重量增大，从而有意义地提高植物的产量，以及通过植物的抗氧化活性增大，从而能够有意义地改善与氧化胁迫相关的植物的生产性、其收获物的品质(例如，功能
性、耐病性、保存性等)。
附图说明
[0035]
图1：(a)是使用本发明所涉及的堆肥而栽培的亚麻荠的照片。(b)是收获的亚麻荠的照片。左侧是试验区的照片，右侧是对照区的照片。
[0036]
图2：表示试验区和对照区、以及以下文献中公开的各国：日本(非专利文献2)、印度(非专利文献3)、美国(非专利文献4)、波兰(非专利文献5)、加拿大、法国、澳大利亚、德国和智利(非专利文献6)的亚麻荠的产量的比较。
[0037]
图3：表示试验区和对照区中的小松菜的植物体重量的比较。误差棒显示标准误差(n＝6)。2个区间之间通过学生t检验而以1％水平有显著性差异。
具体实施方式
[0038]
本发明的方案中，提供用于改善土壤的植物生产性的组合物，包含属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌。
[0039]
本发明中，所谓“改善土壤的植物生产性”，是指促进土壤本来具有的植物的生长能力，由此增大植物的产量，例如每株植物的鞘数、每株植物的种子数、和/或植物体的重量。
[0040]
根瘤菌目(rhizobiales)是属于α-变形菌纲(alphaproteobacteri)的目，是超过17科130属的大型的目。根瘤菌目(rhizobiales)包含多个物种。在与植物共生的种之中，有形成根瘤的，这种物种给植物供应氮，在农业上是重要的。作为农业上重要的根瘤菌目(rhizobium)的种，可列举例如，能够介由共生的氮固定而在豆科植物的根上形成小瘤的n2固定细菌根瘤菌属(rhizobium)的种，将大气的n2转换成与大气的n2相对的能够被植物作为氮源使用的氨。
[0041]
本发明的组合物中所包含的属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌的浓度典型地为106cfu/g以上、优选为107cfu/g以上、最优选为108cfu/g以上。
[0042]
本发明的组合物既可以是固体也可以是液体，除了作为活性成分的属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌以外，也可以包含付与增加的稳定性、湿润性、或分散性等多种特性的载体。载体典型地为农业用载体，可列举土壤、植物生长培养基、水、肥料、植物系油、湿润剂、或它们的组合。
[0043]
本发明的其他方案中，提供改善土壤的植物生产性的方法，包括在所述土壤中添加属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌。
[0044]
属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌向土壤的添加，例如可以通过将上述本发明的组合物在所期望的植物的栽植之前进行添加，或者栽植时与土壤混合而进行添加。
[0045]
作为通过该方法而生产性改善的植物，不特别限制，典型地为农作物，可列举十字花科、禾本科、豆科、菊科、茄科、蔷薇科、葫芦科、旋花科等的植物，优选为十字花科植物。作为十字花科植物，可列举亚麻荠或小松菜。特别是亚麻荠是为了获得油而自古以来在欧洲栽培的作物之一，在具有高的油生产能力的同时，具有短期成熟、水和营养素的低要求性、对病原体和害虫的耐性等农业上的数个优点，近年来其油作为生物燃料原料受到关注。实际上，进行了利用由亚麻荠油制造的生物喷气式发动机燃料的战斗机、客机的多次试飞，已
经报告了性能上没问题。为了增大亚麻荠的产量，以土壤成分、播种时期的最佳化为目标的栽培试验、基因重组试验在各国进行，认为亚麻荠油是生物燃料原料的有力候选之一。
[0046]
通过土壤的植物生产性改善，能够增大每株植物的鞘数、每株植物的种子数、和/或植物体的重量。
[0047]
本发明的进一步其他方案中，提供包含属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌、以及属于放线菌目(actinomycetales)的细菌、属于芽孢杆菌目(bacillales)的细菌、属于gaiellales目的细菌、属于粘球菌目(myxococcales)的细菌、属于iii1-15目的细菌、属于土壤红杆菌目(solirubrobacterales)的细菌、属于黄单胞菌目(xanthomonadales)的细菌、属于伯克氏菌目(burkholderiales)的细菌和属于gemmatales目的细菌的堆肥。
[0048]
属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌典型地是属于红游动菌属(rhodoplanes)、慢生根瘤菌属(bradyrhizobium)、土微菌属(pedomicrobium)、例如优美红游动菌(pedomicrobium)、粘甲基杆菌(methylobacterium adhaesivum)的细菌。属于放线菌目(actinomycetales)的细菌典型地是属于土壤球菌属(terracoccus)、分枝杆菌属(mycobacterium)、链霉菌属(streptomyces)、例如酒红马杜拉放线菌(actinomadura vinacea)、苔草草拉氏杆菌(rathayibacter caricis)、actinoallomurus iriomotensis的细菌。属于芽孢杆菌目(bacillales)的细菌典型地是属于芽孢杆菌属(bacillus)、拉梅尔芽胞杆菌属(rummeliibacillus)、扁平丝菌属(planifilum)、例如蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)、软骨酸类芽孢杆菌(paenibacillus chondroitinus)、克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)的细菌。属于gaiellales目的细菌典型地是属于gaiellaceae科、ak1ab1 02e科的细菌。属于粘球菌目(myxococcales)的细菌典型地是属于堆囊菌属(sorangium)、邻囊菌属(plesiocystis)、侏囊菌属(nannocystis)、例如纤维素堆囊菌(sorangium cellulosum)的细菌。属于iii1-15目的细菌典型地是属于rb40科、mb2424科的细菌。属于土壤红杆菌目(solirubrobacterales)的细菌典型地是属于康奈斯氏杆菌属(conexibacter)的细菌。属于黄单胞菌目(xanthomonadales)的细菌典型地是属于甾体杆菌属(steroidobacter)、藤黄单孢菌属(luteimonas)、独岛杆菌属(dokdonella)、例如微嗜酸寡养单胞菌(stenotrophomonas acidaminiphila)、墨西哥假黄单胞菌(pseudoxanthomonas mexicana)的细菌。属于伯克氏菌目(burkholderiales)的细菌典型地是属于伯克氏菌属(burkholderia)、极单胞菌属(polaromonas)、甲基养菌属(methylibium)的细菌。属于gemmatales目的细菌典型地是属于gemmata属的细菌。
[0049]
堆肥中的各细菌的存在比率只要改善植物生产性就不特别限定，优选所述属于根瘤菌目(rhizobiales)的细菌的存在比率为9％以上、且所述属于iii1-15目的细菌的存在比率为6％以下。
[0050]
堆肥化可以使用本领域技术人员习惯的方法来进行，一般通过在污泥、家畜粪尿、稻草、枯草等堆肥化原料中混合分解它们的需氧性微生物，在需氧性条件下使其发酵来进行。堆肥化中，含水率、ph、碳与氮的比例(c/n比)、温度和氧等影响有机物分解速度，另外成为导致作物的氮饥饿的主要原因，因此调整这些条件变得重要。
[0051]
如果堆肥的含水率为约60％以上，则假比重大、附着性也变大，因而装袋、运输变得困难。相反，如果含水率变为约30％以下，则导致发生粉尘。另外，如果使堆肥化不完全的堆肥干燥，则分解停止而形成未熟的堆肥，因而进行干燥优选在堆肥完全完成之后进行干
燥。堆肥的含水率典型地为约30～60％，优选为约25～55％。
[0052]
在堆肥为酸性的情况下，发生矿物的过度伤害、磷酸的固定、吸收障碍等，堆肥的ph优选为约5.5～8.5。
[0053]
堆肥所包含的钾、钠、氯、硝酸等的离子的量(ec)优选较低。对树皮堆肥，优选为约3.0ds/m以下，对家畜粪尿，优选为约5.0ds/m以下。
[0054]
关于堆肥中的碳与氮的比例(c/n比)，其值越大，则越可能引起土壤氮饥饿，因而优选为约10～40。然而，关于c/n比，因为同时测定易分解性有机物和难分解性有机物的碳与氮，因而例如，锯末的c/n比为非常高的约340～1250，混合了锯末作为副资材的堆肥的c/n比也倾向于变大。
[0055]
氨在堆肥化的初期产生，成为恶臭和作物生长阻碍的原因，因而堆肥中的氨态氮较少为好。另一方面，在堆肥中的无机量氮中，作为硝酸态氮所占的比例的硝酸态氮比例的值较大为好。硝酸态氮是将氨硝化而产生的，该反应主要在二次发酵中发生。
[0056]
堆肥中的肥料成分平衡(以总氮量为1时的钾的比例)较低为好，适当值为5以下。另外，重金属(特别是铜和锌)对于作物而言是必要的微量元素，但如果过多则对作物有害，因而堆肥中的重金属浓度的适当值是铜为300ppm以下，锌为900ppm以下。
[0057]
本发明的堆肥对上述的植物具有极高的生产性。
[0058]
本发明的进一步其他方案中，提供用于增大植物的抗氧化活性的组合物，该组合物包含属于芽孢杆菌属(bacillales)的细菌、属于原小单孢菌属(promicromonospora)的细菌或属于橄榄形菌属(olivibacter)的细菌。
[0059]
植物的生产性会由于强光、干燥、温度、盐、重金属、臭氧等非生物的环境胁迫、或病害等生物的环境胁迫而大幅降低。作为这样的环境胁迫使植物枯死的原因，与由活性氧种(ros)的蓄积造成的氧化胁迫(伤害)有关。已知如果受到氧化胁迫，则依赖于ros的生成与清除的平衡的细胞内氧化还原状态的变化作为信号发挥作用，以环境胁迫应答时的防御系统的表达为代表，参与程序性细胞死亡、生长/发育等生理现象的控制，但本发明者们这次发现，属于芽孢杆菌属(bacillales)的细菌、属于原小单孢菌属(promicromonospora)的细菌或属于橄榄形菌属(olivibacter)的细菌增大植物的抗氧化活性这样的令人惊讶的知识。
[0060]
所述属于芽孢杆菌属(bacillales)的细菌优选为蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)，最优选为在专利微生物保藏中心以保藏号nite bp-02974保藏的菌株。所述属于原小单孢菌属(promicromonospora)的细菌优选为柠檬原小单孢菌(promicromonospora citrea)，最优选为在专利微生物保藏中心以保藏号nite bp-03025保藏的菌株。所述属于橄榄形菌属(olivibacter)的细菌优选为橄榄形菌种(olivibacter sp.)，最优选为在专利微生物保藏中心以保藏号nite bp-03026保藏的菌株。
[0061]
通过增大植物的抗氧化活性，从而能够有意义地改善与氧化胁迫相关的植物的生产性、其收获物的品质(例如，功能性、耐病性、保存性等)。
[0062]
以下显示实施例，进一步详细地说明本发明。但是，本发明不限于以下实施例，可以加入适当变更而实施。
[0063]
实施例
[0064]
例1亚麻荠的栽培试验
[0065]
1.1栽培条件
[0066]
亚麻荠(camelina sativa)的栽培从2018年3月25日到6月24日在群马县涉川市(36.53n、139.01e)的旱田进行。亚麻荠品种使用calena。在旱田中以1.5kg/m2播撒通过后述的方法制造的堆肥，不使用其他化学肥料。测定收获时的鞘数、种子产量，与其他栽培收获量进行比较。试验区以15m2进行栽培，对照区以1m2进行栽培。试验区的栽培密度为167株/m2，对照区的栽培密度为169株/m2。
[0067]
1.2堆肥的制造
[0068]
亚麻荠栽培中使用的堆肥如下制造。在试验区使用的堆肥中作为原料使用猪粪，作为副资材使用锯末，进一步作为添加的菌使用单独分离/培养的属于根瘤菌目(rhizobiales)的菌。通过将猪粪、菌培养液、和锯末混合而开始堆肥化。含水率用锯末调整为约60％，混合物进行随时搅拌，历时三个月制成堆肥。对照区中使用的堆肥也除了不进行菌的添加这点之外通过同样的方法制造。
[0069]
1.3栽培后的土壤的成分的分析
[0070]
土壤成分参照japan soil association(2010)，分别通过以下所示的方法进行了分析。氮总量(n)：
マクロコーダー
(jm1000cn)；磷酸总量(p)：硝酸-高氯酸分解、钼钒酸铵法；钾总量(k)：硝酸-高氯酸分解、原子吸光测光法、石灰总量(ca)：硝酸-高氯酸分解、原子吸光测光法、镁总量(mg)：硝酸-高氯酸分解、原子吸光测光法。
[0071]
1.4利用新一代测序仪的栽培土壤的菌相分析
[0072]
使用vd-250r冻干机(taitec)，将栽培土壤样品冷冻干燥。使用shake master neo(bms)，将冷冻干燥样品粉碎。然后，由粉碎样品使用mpure bacterial dna extraction kit(mp bio)提取dna。文库制作使用2步tailed pcr法来实施。第1次pcr以16s rrna基因的可变区v4(约250bp)作为靶标，使用引物1st_515f_mix(5
’‑
acactctttccctacacgacgctcttccgatct-nnnnn-gtgccagcmgccgcggtaa-3’：序列号1)和1st_806r_mix(5
’‑
gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-nnnnn-ggactachvgggtwtctaat-3’：序列号2)。为了提高品质，序列分析时使用的引物是插入了0～5个碱基的不同长度的随机序列的混合引物。在第1次pcr产物的纯化之后，在第2次pcr中，使用与位于第1次pcr产物的两末端的共有序列结合、添加了样品识别用索引的引物2nd f(5
’‑
aatgatacggcgaccaccgagatctacac-index2(tatagcct)-acactctttccctacacgacgc-3’：序列号3)和2nd r(5
’‑
caagcagaagacggcatacgagat-index1(gcagcgta)-gtgactggagttcagacgtgtg-3’：序列号4)扩增第1次pcr产物。各pcr产物通过agencourt ampure xp(beckman cou-lter)进行了纯化。使用miseq(illumina)实施所得的文库的序列分析。
[0073]
通过测序而得的碱基序列数据如下进行分析。使用fastx toolkit的fastq_barcode_spliltter仅提取出序列的阅读起始部位(読
み
始
め
)与使用引物完全一致的序列。删除所提取的序列的引物序列。然后，除去品质(quality)值小于20的序列，破坏长度为40碱基以下的序列及其配对序列。使用配对内兼并脚本(pair-endo merge script)flash，兼并通过了品质过滤的序列。兼并的条件是兼并后的片段长260碱基、read的片段长230碱基、最低重叠(overlap)长10碱基。将能够兼并的序列根据片段长进行过滤(filtering)，仅将246碱基至260碱基用于以后的分析。将通过了全部过滤(filtering)的序列使用usearch的uchime算法校验嵌合体序列。数据库为菌群分析用流水线qiime所附属的greengene的
97％out，提取未判断为嵌合体的全部序列用于以后的分析。otu制成与系统推定使用qiime的工作流脚本(workflow script)。
[0074]
2.1栽培结果
[0075]
使用添加了作为与土壤生产性显示相关的菌的根瘤菌目(rhizobiales)的堆肥进行栽培。图1显示栽培中的亚麻荠的样子和收获后的试验区的株和对照区的株。图2和表1将由本发明产生的栽培量与国内外的栽培量进行比较的结果。由该结果可以确认每株植物的鞘数多于除了印度的栽培例以外的其他栽培的数倍的结果。由于本发明中的每pod的种数为中程度，因而认为每株植物的种子数变多了。另外，由于种子重量与其他栽培结果未见大的差异，因此认为每株植物的种子产量变多了。这从图1(b)的照片也能明确。因为栽培密度为中程度，所以可知最终的每单位面积的产量增大至6.75吨/公顷。由图2可知，该值比国内外的任何栽培例的都多，与收量最多的法国的2.8吨/公顷相比也为2.4倍以上。
[0076]
表1
[0077]
表1亚麻荠的栽培结果的比较
[0078][0079]
2.2土壤菌相分析
[0080]
通过将从土壤提取的dna提供给新一代测序仪来分析土壤中的菌相。作为本次在试验区添加的菌的根瘤菌目(rhizobiales)最多被检测出，为全体的9.42％。作为除了根瘤菌目(rhizobiales)以外的检出量多的菌，可列举放线菌目(actinomycetales)(7.61％)、芽孢杆菌目(bacillales)(7.02％)、gaiellales目(6.58％)、粘球菌目(myxococcales)(4.89％)、iii1-15目(3.32％)、土壤红杆菌目(solirubrobacterales)(3.09％)、黄单胞菌目(xanthomonadales)(2.40％)、伯克氏菌目(burkholderiales)(2.33％)、gemmatales目(2.30％)。
[0081]
另一方面，在对照区检测出的根瘤菌目(rhizobiales)为全体的5.75％，少于试验区。另外其他检出量多的菌为放线菌目(actinomycetales)(7.52％)、gaiellales目(7.21％)、芽孢杆菌目(bacillales)(6.01％)、粘球菌目(myxococcales)(5.11％)、iii1-15目(3.26％)、土壤红杆菌目(solirubrobacterales)(3.25％)、伯克氏菌目(burkholderiales)(2.53％)、gemmatales目(2.45％)、nitrososphaerales目(2.42％)。
[0082]
判明了在亚麻荠栽培中随着栽培密度的增加而每株植物的鞘数、和种子重量倾向于减少(非专利文献5)。关于每1株的产量，印度的栽培例显示非常高的值，但这是极低的密度(17.6植物/m2)下的栽培结果，每单位面积的产量则低至1.31吨/公顷。另一方面，本试验
中，尽管栽培密度为中等程度，每株植物的鞘数也高。该结果是每单位面积的产量为6.75吨/公顷的非常高的结果。另一方面，对照区的每单位面积的产量与现有的栽培例没有大的差异。
[0083]
播撒了堆肥的土壤的菌相分析的结果是，根瘤菌目(rhizobiales)在全体中以9.42％最多被检测出，与对照区相比也增加。由该结果推定，向堆肥的菌添加使土壤中的根瘤菌目(rhizobiales)增加，有助于提高土壤生产性。
[0084]
关注于与土壤生产性显示正相关的根瘤菌目(rhizobiales)和iii1-15目、以及显示负相关的酸杆菌目(acidobacteriales)和索利氏菌目(solibacterales)的4个菌目，将试验区和对照区、以及非专利文献1中报告的12个地点的细菌的比例进行比较。表2是其结果。此外，表3是非专利文献1中表示各土壤的采集地点的代码与纬度和经度的对应表。
[0085]
表2
[0086]
表2菌的存在比与土壤生产性的相关性
[0087][0088]
表3
[0089]
表3土壤的采集地点
[0090][0091]
在该12个地点、与试验区和对照区的土壤中比较4个菌目的存在比率。试验区的土壤在14种土壤之中根瘤菌目(rhizobiales)第2(9.42％)多，iii1-15目第8(3.32％)多。另
一方面，酸杆菌目(acidobacteriales)第3(0.82％)少，索利氏菌目(solibacterales)第2(1.02％)少。另一方面，对照区的土壤在14种土壤之中根瘤菌目(rhizobiales)第8(5.75％)多，比试验区少。关于根瘤菌目(rhizobiales)以外的菌的存在比例，iii1-15目第9(3.26％)多，酸杆菌目(acidobacteriales)第4(1.10％)少，索利氏菌目(solibacterales)第3(1.26％)少。无论如何，可以认为试验区的土壤具有生产性极高的菌组成。
[0092]
在上述试验中使用添加了菌的堆肥，进行亚麻荠的栽培，确认了与国内外的已有报告相比，每单位面积获得了2.4倍以上的产量。分析土壤所包含的菌的结果是，观察到所添加的菌大量存在。发现了通过在堆肥制造时添加特定的菌，从而操作栽培土壤的菌相，提高生产物的产量这样的方法的可能性。
[0093]
例2.小松菜的栽培试验
[0094]
在小松菜栽培中使用的堆肥如下制造。在试验区使用的堆肥中，作为原料，使用猪粪、锯末、以及单独分离、培养的属于根瘤菌目(rhizobiales)的菌的培养液。通过将猪粪、菌培养液、和锯末混合从而开始堆肥化。用锯末将含水率调整为60％，混合物随时进行搅拌，经过三个月而制成堆肥。在对照区使用的堆肥除了不进行菌的添加这点之外，通过同样的方法制造。
[0095]
制造堆肥提供给小松菜(brassica rapa var.perviridis)盆栽培试验。在小松菜盆栽培试验中使用将制造堆肥与赤玉土以3:7混合而得的土。另外将包含氨性氮、可溶性磷酸、水溶性钾各8％的化学肥料对土1l使用0.84g。栽培从种子开始在室温、荧光灯下进行，观察其生长。
[0096]
本试验中，使用根瘤菌目(rhizobiales)菌制造堆肥，在与亚麻荠同为十字花科的小松菜中进行栽培试验。其结果观察到，使用了菌添加堆肥的小松菜中，植物体重量增加到约1.7倍。
[0097]
例3.小松菜的抗氧化力的评价
[0098]
3.1蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)
[0099]
对小松菜，接种由申请人分离的蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)的菌株2764-01-s16(保藏号nite bp-02974)，进行小松菜的栽培试验。具体地，菌的接种通过对在蛭石栽培的第10天的小松菜苗的根浸泡菌的悬浮液约30秒来进行。此外在对照区使用灭菌水。栽培使用将蒸汽灭菌后的农场土与蛭石以1:1混合而得的土，将液体肥料约1周给与1次。此外，栽培在塑料大棚内实施。
[0100]
将上述栽培的小松菜的可食部位作为分析试样，切成1cm见方，将其与4倍重量的水混合，用榨汁机进行破碎，在80℃加热30分钟之后，冷却然后过滤，制备试样溶液。将试样溶液25μl、44.4mm 2,2,6,6-四甲基-4-哌啶(tmpd)50μl、2.5mm二甲基亚砜(dmso)100μl、和55.5mm核黄素50μl混合，对该混合液照射紫外线20秒，然后通过测定条件设定为field＝336.4
±
5mt(磁场的范围)、power＝3mw、modulation width＝0.1mt、sweep time＝1分钟、time constant＝0.1秒、amplify＝250的电子自旋共振(esr)法测定试样溶液的单线态氧清除活性，评价小松菜的抗氧化力。
[0101]
从上述的设定而得的信号，可以测定被作为补充剂的tmpd所补充了的自由基的强度。从使用组氨酸作为观察单线态氧清除活性(抗氧化力)的标准物质而事先制成的标准曲
线，可以基于该强度而推定实际的物质量。如果试样的抗氧化力高，则更多的自由基被清除，而不被补充剂补充，因而信号变小。
[0102]
与没有接种菌的小松菜株比较重量和抗氧化力，结果没有接种菌的小松菜株的重量为3.15g、抗氧化力为1560μmol组氨酸/g，接种了菌的小松菜株的重量为4.07g、抗氧化力为1890μmol组氨酸/g，因而在接种了菌的小松菜株中，观察到重量和抗氧化力的有意义改善。
[0103]
3.2柠檬原小单孢菌(promicromonospora citrea)
[0104]
对小松菜，接种由申请人分离的柠檬原小单孢菌(promicromonospora citrea)的菌株27624-02-c06(保藏号nite bp-03025)，进行小松菜的栽培试验。具体地，菌的接种通过对在蛭石栽培的第10天的小松菜苗的根浸泡菌的悬浮液约30秒来进行。此外在对照区使用灭菌水。栽培使用将蒸汽灭菌后的农场土与蛭石以1:1混合而得的土，将液体肥料约1周给与1次。此外，栽培在塑料大棚内实施。
[0105]
将上述栽培的小松菜的可食部位作为分析试样，切成1cm见方，将其与4倍重量的水混合，用榨汁机进行破碎，在80℃加热30分钟之后，冷却然后过滤，制备试样溶液。将试样溶液50μl、5.7m 5,5-二甲基-1-吡啶n-氧化物(dmpo)20μl、和2.5mm过氧化氢90μl混合，对该混合液照射紫外线30秒，然后通过测定条件设定为field＝335
±
5mt、power＝3mw、modulation width＝0.1mt、sweep time＝1分钟、time constant＝0.1秒、amplify＝50的esr法来测定羟基自由基清除活性，评价小松菜的抗氧化力。
[0106]
从上述的设定而得的信号，可以测定被作为补充剂的dmpo所补充了的自由基的强度。从使用dmso作为观察羟基自由基清除活性(抗氧化力)的标准物质而事先制成的标准曲线，可以基于该强度而推定实际的物质量。如果试样的抗氧化力高，则更多的自由基被清除，而不被补充剂补充，因而信号变小。
[0107]
与没有接种菌的小松菜株比较重量和抗氧化力，结果没有接种菌的小松菜株的重量为3.51g、抗氧化力为1670μmol dmso/g，接种了菌的小松菜株的重量为4.29g、抗氧化力为2350μmol dmso/g，因而在接种了菌的小松菜株中，观察到重量和抗氧化力的有意义改善。
[0108]
3.3橄榄形菌种(olivibacter sp.)
[0109]
对小松菜，接种由申请人分离的橄榄形菌种(olivibacter sp.)的菌株27624-02-c07(保藏号nite bp-03026)，进行小松菜的栽培试验。具体地，菌的接种通过对在蛭石栽培的第10天的小松菜苗的根浸泡菌的悬浮液约30秒来进行。此外在对照区使用灭菌水。栽培使用将蒸汽灭菌后的农场土与蛭石以1:1混合而得的土，将液体肥料约1周给与1次。此外，栽培在塑料大棚内实施。
[0110]
将上述栽培的小松菜的可食部位作为分析试样，切成1cm见方，将其与4倍重量的水混合，用榨汁机进行破碎，在80℃加热30分钟之后，冷却然后过滤，制备试样溶液。将试样溶液50μl、8.55m 5,5-二甲基-1-吡啶n-氧化物(dmpo)30μl、1.25mm次黄嘌呤50μl、4.37mm二甲基亚砜(dmso)20μl、和0.1u/ml黄嘌呤氧化酶50μl，搅拌而使其反应60秒，然后通过测定条件设定为field＝335
±
5mt、power＝3mw、modulation width＝0.079mt、sweep time＝1分钟、time constant＝0.1秒、amplify＝250的esr法测定超氧化物自由基清除活性，评价小松菜的抗氧化力。
[0111]
从上述的设定而得的信号，可以测定被作为补充剂的dmpo所补充了的自由基的强度。从使用超氧化物歧化酶作为观察超氧化物自由基清除活性(抗氧化力)的标准物质而事先制成的标准曲线，可以基于该强度而推定实际的物质量。如果试样的抗氧化力高，则更多的自由基被清除，而不被补充剂补充，因而信号变小。
[0112]
与没有接种菌的小松菜株比较重量和抗氧化力，结果没有接种菌的小松菜株的重量为3.51g、抗氧化力为122单位sod/g，接种了菌的小松菜株的重量为4.47g、抗氧化力为190单位sod/g，因而在接种了菌的小松菜株中，观察到重量和抗氧化力的有意义改善。
[0113]
在国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(地址：〒292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)将2764-01-s16以保藏号nite bp-02974进行了保藏(原保藏日：2019年6月20日)。另外，将27624-02-c06以保藏号nite bp-03025进行了保藏(原保藏日：2019年9月20日)、将27624-02-c07以保藏号nite bp-03026进行了保藏(原保藏日：2019年9月20日)。
[0114]
保藏号
[0115]
nite bp-02974
[0116]
nite bp-03025
[0117]
nite bp-03026