寡胜肽，其检测套组，其医药组合物与医药组合物的用途的制作方法

id no.1、seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4的全长氨基酸序列中至少一者具有至少50％的一致性。
10.根据本发明的另一态样是一种检测套组，包含前述态样的寡胜肽。
11.根据本发明的又一态样是一种医药组合物，包含前述态样的寡胜肽以及一治疗分子或一干细胞，所述治疗分子或干细胞与寡胜肽结合。
12.根据本发明的再一态样是一种前述态样的医药组合物用以制备一治疗骨关节炎的药物的用途。
附图说明
13.通过阅读以下实施例的详细描述，并结合附图，可以更充分地理解本发明：
14.图1呈现活体内成像证明c5-24胜肽与骨关节炎软骨的结合能力的结果。
15.图2呈现c5-24胜肽在早期骨关节炎诊断中的应用结果。
16.图3呈现c5-24胜肽在关节润滑中的应用结果。
17.图4呈现c5-24胜肽在骨关节炎再生医学中的应用结果。
18.图5呈现用于追踪间充质干细胞的mri分析和普鲁士蓝染色的结果。
19.图6呈现c5-24胜肽的结合蛋白的鉴定结果。
具体实施方式
20.以下将通过下述的特定实施方式而更详细讨论本发明，以帮助本领域技术人员在无需过度解释和过度实验下完全利用和实践本发明。然而，这些实际细节是用于描述如何实现本发明的材料和方法，并且不是必需的。
21.一、结果
22.《鉴定靶向骨关节炎的胜肽》
23.使用噬菌体展示胜肽库，我们从接受全膝关节置换的患者的膝关节所切除的软骨下骨来探测骨关节炎关节软骨。骨关节炎软骨标本将被均质化以获取组织裂解物或切成大小为5mm
×
5mm的正方形组织块。通过五轮与组织裂解物和组织碎片结合的噬菌体展示胜肽(生物淘选)筛选，噬菌体的结合效价分别显著提高至388倍与864倍。从第五轮生物淘选中收集的噬菌体殖株进一步进行elisa筛选，而和组织裂解物或片段具有高亲和力的殖株将被选择、定序和比对。最后，我们确定了五组具有独特保留性模体的靶向噬菌体。噬菌体殖株的结合能力通过对人类软骨细胞株hpi-gl10进行免疫细胞荧光染色而获得验证。所有以m13-pe(与荧光染料偶联的抗体)标记的已鉴定的噬菌体殖株皆以剂量依赖性方式与hpi-gl结合。值得注意的是，c5-24和c5-91胜肽在 hpi-gl中表现出特异性和显著的结合情况。为了查找特异性结合于骨关节炎软骨但非与滑膜和半月板等其他软组织有特异性结合的噬菌体殖株，人体骨关节炎的组织切片进一步使用以山葵过氧化酶(hrp)-标记的噬菌体殖株进行免疫染色，然后对沉淀的3,3-二氨基联苯胺(dab)强度(-至+++)进行半定量。具体而言，c5-24胜肽(如seq id no.1的氨基酸序列所示)和c5-91胜肽(如 seq id no.2的氨基酸序列所示)对软骨呈现优异的结合活性，但是对半月板和滑膜并没有结合活性。再者，c5-24胜肽表现出靶向骨关节炎软骨的胞区质区域的最佳特异性，进而被选择使用于后续的研究中。
24.《靶向骨关节炎的活体成像》
25.为了证明c5-24胜肽对于骨关节炎的靶向活性，以罗丹明标记的c5-24 胜肽和扰码胜肽分别注入大鼠骨关节炎模型的关节中并以双-12光子显微镜观察荧光和二次谐波产生(shg)信号。扰码胜肽包含与原始胜肽相同的所有氨基酸，但以新的顺序随机排列。表面渲染的3d重建影像和软骨的横向复合影像显示，稀疏的红点随机出现于c5-24胜肽注射的对照软骨、扰码胜肽注射的对照软骨和扰码胜肽注射的骨关节炎软骨中。相反地，在注射c5-24胜肽的骨关节炎软骨中观察到诸多的红点。当以shg探查第ii型胶原蛋白时，红点位于无信号shg的区域(图1a)，即对应骨关节炎软骨的胞区质区域。从z轴平面可以确定c5-24胜肽在骨关节炎软骨中的深度至少达到50μm(图1a)。此外，所有切片中的总荧光胜肽结合面积(图1b)和结合强度(图1c)进一步被计算，其显示c5-24胜肽靶向骨关节炎和对照软骨的显著差异。前列数据证明了 c5-24胜肽靶向骨关节炎软骨的胞区质区域具有卓越的识别能力和特异性。
26.《于早期骨关节炎诊断中的应用》
27.为了证明骨关节炎靶向胜肽在骨关节炎早期诊断中递送诊断试剂的适用性，c5-24和扰码胜肽将与超顺磁性氧化铁(spio)偶联(图2a)。傅立叶变换红外线光谱(ftir)显示n-h波段/c-o拉伸比增加，表明spio已成功装载于 c5-24和扰码胜肽(图2b)，所述胜肽通过关节内注射至以酶切方式建立的大鼠骨关节炎模型的关节中。注射未与胜肽偶联的spio的骨关节炎膝关节的磁共振成像(mri)与伪对照组的膝关节相比并无差异，这揭示了在不严重剥蚀软骨的情形下，mri对骨关节炎早期诊断的挑战。同样地，不与骨关节炎软骨结合的扰码胜肽偶联spio及mri信号的降低亦无法将早期骨关节炎和伪对照组加以区分。相反地，c5-24胜肽偶联spio与骨关节炎软骨结合会导致骨关节炎软骨的mri信号降低，但此情形却未见于健康软骨中(图2c)。为了进一步接近临床状态，c5-24胜肽偶联spio用于早期骨关节炎诊断的可行性进一步在前交叉韧带横断的兰屿小型猪所建立的大型动物骨关节炎模型获得证实。在前交叉韧带横切2个月后，无论伪对照组是否接受c5-24胜肽偶联spio或不接受c5-24胜肽偶联spio处理，或骨关节炎膝关节不接受c5-24胜肽偶联 spio处理，在t1-和t2-加权mr影像中均无差异(图2d)，表明使用mri进行早期骨关节炎诊断的困难。然而，接受c5-24胜肽偶联spio的骨关节炎膝关节在其t1-和t2-加权mr影像中显示增强信号的减少，证明c5-24胜肽偶联spio对早期骨关节炎诊断的敏感性。综上所述，前列数据表明当与c5-24 胜肽偶联时，影像显影剂，如spio，可与mr成像系统结合并用于早期骨关节炎诊断。
28.《于关节润滑中的应用》
29.为了研究c5-24胜肽将透明质酸运送到骨关节炎软骨中用以润滑的潜力， c5-24胜肽或扰码胜肽将与透明质酸偶联，并分别简称为c5-24-ha和扰码-ha (图3a)。通过1h质子-nmr(核磁共振)测得ha-ma的甲基丙烯酸酯含量约为 28.1％，其被用以作为后续和c5-24胜肽(图3b)和扰码胜肽结合的中间产物。流变润滑性能，包括静摩擦系数(μs)和动摩擦系数(μk)，是改良先前技术中的旋转测试方法而进行评估，并于未经修饰的ha、扰码-ha或c5-24-ha处理的成对的人类骨关节炎软骨圆盘(从13个个体中收集)之间进行比较。未修饰的ha、扰码-ha和c5-24-ha在1.2秒松弛的情况下的总摩擦系数分别为：μs为0.065、0.073和0.044，μk为0.045、0.052和0.034，且与未修饰的ha 相比，c5-24-ha分别降低了32.3％和24.4％；在120秒松弛的情况下，μs分别为0.072、0.075和0.043，μk分别为0.045、0.052和
0.033，且与未修饰的 ha相比，c5-24-ha分别降低了40.3％和26.7％；在120秒松弛的情况下，μs 分别为0.077、0.079和0.044，μk分别为0.048、0.055和0.034，且与未修饰的ha相比，c5-24-ha降低了42.9％和29.2％；而在1200秒松弛的情况下，μs分别为0.094、0.102和0.066，μk分别为0.060、0.067和0.042，且与未修饰的ha相比，c5-24-ha分别降低了29.8％和30％(图3c)。简而言之，在所有松弛阶段中，c5-24-ha相较于未修饰的ha和扰码-ha具有统计上显著优越的静摩擦和动摩擦特性，说明其润滑效果卓越。而且，在流变预处理阶段和扭矩测量中，c5-24-ha的润滑性能优于未修饰的ha和扰码-ha。代表性的个人患者数据被放置在补充数据中，在预处理阶段的3600秒松弛时间内的软骨盘高度逐渐丧失亦显示的相同情况，但在接下来的四个松弛期中恢复到一致的软骨盘高度，这减少了影响摩擦测量的因素。前列数据共同表明，c5-24胜肽在开发新颖且有效的骨关节炎关节润滑剂中的适用性。
30.《于骨关节炎再生医学中的应用》
31.c5-24-ha可通过与cd44(ha的受体)结合并应用于间充质干细胞再生医学，cd44在间充质干细胞表面广泛地表达，并将间充质干细胞递送至骨关节炎软骨表面。再者，如先前研究所证实，ha的软骨形成活性很可能会诱导间充质干细胞形成软骨。为了证明这一点，大鼠间充质干细胞被施以spio以供随后的追踪并与荧光偶联的c5-24-ha或扰码-ha一起培养(图4a)。荧光显微镜观察表明，间充质干细胞被绿色荧光紧密包围(图4b，以黑白模式显示)。再者，在与c5-24-ha或扰码-ha一起培养后，间充质干细胞将立即被注射进大鼠骨关节炎模型的关节中，并在移植后8周对关节进行组织学检查。当骨关节炎组和伪对照组相比，组织形态计量学分析结果显示骨关节炎成功被诱导 (图4c、4d)。再者，接受由c5-24-ha递送之间充质干细胞的膝关节具有明显的软骨再生与明显的番红o染色(图4c)，而接受扰码-ha递送之间充质干细胞的膝关节仍表现出严重的骨关节炎，且软骨表面上出现多个裂缝，其番红o 染色亦消失。以修改后的mankin评分对骨关节炎程度进行量化的结果也表明，前者的骨关节炎改善优于后者(图4d)。为了追踪移植到骨关节炎关节中施以 spio的间充质干细胞，在移植后3天对大鼠进行mri扫描(图5a)和进行普鲁士蓝染色(图5b)，结果显示在c5-24-ha辅助的组别中，间充质干细胞在骨关节炎软骨中具有特异性归巢特性，但不在扰乱的ha辅助组别中出现。前列数据表明c5-24-ha在增强间充质干细胞再生医学中的适用性。
32.《结合蛋白的鉴定》
33.为了鉴定人类骨关节炎软骨组织中与c5-24胜肽结合的推定目标蛋白，我们使用与化学交联剂3,3'-dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)(dtssp)结合的生物素修饰的c5-24胜肽，并接着以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺钠凝胶电泳(sds-page)和液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)识别结合的目标(图6a)。银染显示了几个清晰的条带，例如共免疫沉淀蛋白coip-1、coip-3和coip-5 (图6b)，它们分别被收集、以胰蛋白酶降解并以lc-ms/ms进行分析。前述片段是以算法通过mascot和turbosequest搜索引擎检索swiss proteindatabase而鉴定。我们发现了几个候选蛋白，包括具有概率得分的胶原蛋白 alpha-1(xii)和胶原蛋白alpha-3(vi)片段，表明该肽属于某种蛋白质的可能性分别高达850和372，并高于大多数其他所鉴定出的胜肽。为了进一步确认这些蛋白质片段为c5-24胜肽的目标蛋白，我们使用elisa检测目标蛋白和生物素修饰的c5-24胜肽之间的相互结合活性。首先，我们使用特定浓度的胶原蛋白对elisa盘进行预涂布处理，以鉴定胜肽结合的最佳胶原蛋白浓
度(图 6c)，接着使用3.3μg/ml的胶原蛋白alpha-1(xii)来检查胜肽的结合(图6d)。我们发现生物素修饰的c5-24胜肽会与胶原蛋白alpha-1(xii)和胶原蛋白 alpha-3(vi)片段结合，但生物素修饰的扰码胜肽并不会。然而，相互性的剂量依赖性结合仅在胶原蛋白alpha-1(xii)和生物素修饰的c5-24胜肽之间观察得到(图6c、6d)。此外，生物素修饰的c5-24胜肽和生物素修饰的扰码胜肽与和牛血清白蛋白(bsa)的结合并无差异。综上所述，前列数据表明胶原alpha-1 (xii)是c5-24胜肽的目标蛋白。
34.为了预测蛋白质-胜肽复合物的结构，通过搜寻序列2的相似性，同源性建模和靶向人类胶原蛋白xii的几种可靠的结构模型辅助了蛋白质-胜肽的对接。这些结构模型随后将应用于计算最有潜力并可于本研究中被选用而供进一步实验的c5-24和c5-91胜肽链的可能分子对接构型。蛋白质-胜肽对接模型主要是基于在与目标蛋白的胜肽链结合后，符合最低吉布斯自由能和化学热力学的算法。我们的数据表明c5-24和c5-91胜肽链分别以构型125和构型68 靶向胶原蛋白xii中区域l1385-s2285的袋点，并分别以构型34和42靶向c 端的s2506-p2724，具有最高构型频率的c5-24和c5-91具有相同的对接位点 (图6e)。再者，这些预测构型共享重要的保留性结合模体，wxpxw，其可能主导胜肽链与胶原蛋白xii之间的主要对接亲和力。此外，人类、猪、兔、大鼠和小鼠的胶原蛋白xii的序列同源性达到90.3％的相似性和83.7％的一致性，且亲缘关系分析结果表明胶原蛋白xii在所述五物种之间具有高度的遗传相关性。c5-24胜肽在囓齿动物、兔和猪骨关节炎模型中的检查非常可靠。再者，根据表一中的保留性结构域，相同组别的胜肽序列共享重要且相同的模体，例如第1组和第3组中分别共享fvew和dth。
35.[0036][0037]
最后，我们证明了胶原蛋白xii在骨关节炎关节软骨中的专有表达。胶原蛋白xii的表达仅在大鼠骨关节炎软骨中观察得到，但未在正常关节软骨中观察而得。另外，胶原蛋白xii的表达仅在人类骨关节炎软骨中观察得到，而在人类非患有骨关节炎的软骨中则未观察到。胶原蛋白xii主要表达在成簇软骨细胞的胞区质区域中，其与c5-24胜肽结合的区域一致(图1a)。这些数据更获得161例骨关节炎患者和29例非骨关节炎患者的队列研究结果的支持。初步分析显示，与非骨关节炎软骨相比，骨关节炎髋关节和骨关节炎膝关节软骨联合中的col12a1 mrna水平显著增加。
[0038]
《在疾病缓解性骨关节炎药物(dmoads)中的应用》
[0039]
目前尚未有药物被批准为疾病缓解性骨关节炎药物。因此，骨关节炎可能是一种严重的疾病，未满足治疗上的医疗需求改变其基本的病理生理学，并转化为长期的、与临床相关的进展。目前，有几种药物处于第ii期、第iii期或临床前阶段，包含靶向软骨再生的纤维母细胞生长因子-18(sprifermin)与促进核心结合因子beta(cbfβ)解离和核内化并刺激级联软骨形成的kartogenin。所有发展中的疾病缓解性骨关节炎药物均可通过本研究中开发的骨关节炎靶向胜肽的协助而促进其递送至骨关节炎组织。此外，与全身性药物治疗相反，多数药物着重在关节内给药的途径，以提高药物的局部生物利用度并避开常规障碍，并可通过降低脱靶效应而使全身毒性最小化并提高安全性。然而，重要的是要了解局部关节内给药所产生的明显安慰剂作用，并使疗效的评估更具挑战性。将治疗剂递送到骨关节炎部位的技术精度提高，例如本研究中所发现的胜肽，将可能使骨关节炎有效疗法成功的开发。未来应致力于通过装备有骨关节炎靶向胜肽的复杂载体来提供缓解疾病的药物，以增
强疾病缓解性骨关节炎药物的发展。
[0040]
我们已经确定了几种噬菌体编码的胜肽模体(wxpxw和dth)，这些模体选择性地靶向骨关节炎关节，而未对其他的关节软组织，包含滑膜组织、半月板和韧带，进行任何有效的靶向。再者，我们鉴定了c5-24和c5-91胜肽与骨关节炎关节中软骨细胞的胞区质区域的特异性结合。c5-24已成功地与spio 和ha结合，并分别供予骨关节炎诊断和润滑的目的。尽管尚未确认c5-91胜肽可将诊断剂或润滑剂递送至骨关节炎关节的关节表面，然c5-91胜肽具有与 c5-24胜肽相同的大小和共享相同的模体，因此被认为具有相同的功能。
[0041]
尽管胶原蛋白ii是透明软骨的基础，且占关节软骨中所有蛋白质的 85-90％，但老化或骨关节炎将使胶原蛋白损伤，且所述损伤会由关节表面的软骨细胞(胞区质区域)开始，并随着进展中的退化而延伸到整个软骨。有鉴于胶原蛋白ii未在骨关节炎中具有特异性的表达，靶向胶原蛋白ii的胜肽可能不适用于骨关节炎的诊断、治疗、润滑和再生医学的应用。反之，如同本研究的揭示，实验与计算机仿真证明共享结合模体wxpxw的骨关节炎靶向胜肽选择性地归巢至胞区质区域并与仅在骨关节炎软骨中表达的胶原蛋白xii 结合。以抗体进行的免疫荧光研究说明胶原蛋白xii是位于胚胎组织中含有胶原蛋白i的密集结缔组织结构中，例如肌腱、韧带、软骨膜和骨膜(胶原蛋白 xii亦表达在角膜、椎间盘和气管的组织中)，表明其在关节的退化和再生中出现。胶原蛋白xii在骨关节炎再生中的作用仍需进一步的研究来阐明。总结上述，我们开发了针对胶原蛋白xii的新颖递送平台，用于改良骨关节炎的润滑、诊断、治疗和再生医学。
[0042]
虽然与胶原蛋白xii结合的胜肽已被开发于骨关节炎的诊断、润滑剂和再生医学，它们亦可能适用于其他疾病，例如在严重的干眼症中可能发生的角膜溃疡和穿孔，或与包含透明软骨的其他组织，例如椎间盘和气管软骨，相关的伤害或退化性疾病。例如，在角膜的鲍曼氏层中表达的胶原蛋白xii会于角膜溃疡和疤痕形成过程中过度表达，因此，功能化的胶原蛋白xii靶向胜肽可帮助输送润滑剂、抗炎药和干细胞，以治疗角膜溃疡。总结上述，我们开发了针对胶原蛋白xii的新颖递送平台，以改良骨关节炎的润滑、诊断、治疗和再生医学。所述平台还可用于治疗其他疾病，例如眼溃疡和其他包含透明软骨的组织的疾病。
[0043]
《材料与方法》
[0044]
本技术的上述实施例是基于以下方法和材料来执行的，其细节描述如下。
[0045]
《制备用于生物淘选和elisa筛选的软骨标本》
[0046]
为了避免患者间个体差异的干扰，我们在同一噬菌体展示实验中使用来自于同一骨关节炎患者的手术关节软骨标本以供噬菌体展示实验中进行五轮的生物淘选。下述处理将进行以确保用于五轮生物淘选的软骨的粒度组成一致。将重量为3.2g的人类手术骨关节炎标本加入两倍磷酸缓冲生理食盐水(pbs) 中并均质化。软骨均质液以800
×
g和4℃的条件离心10分钟，并收集沉淀物作为「大颗粒软骨样品(c1)」。上清液将添加至新的离心管中，接着以1,500
×
g 和4℃的条件离心10分钟，并收集沉淀物作为「带有中等颗粒(c2)的软骨样品」。接着将上清液以2,000
×
g和4℃的条件再次离心10分钟后，收集沉淀物作为「小颗粒软骨样品(c3)」。此时的上清液将分别被收集并作为「软骨组织裂解物」而进行另外五轮的生物淘选，此与在「软骨组织碎片」上进行的生物淘选并不相同。在「软骨组织裂解物」的生物淘选上，分别将c1、c2和c3 称重并等分为五等份。五轮的生物淘选的每一轮使用c1、c2和c3等份的混合物进行。
[0047]
在「软骨组织碎片」的生物淘选上，软骨样本同样被切成正方形碎片(尺寸为5
×
5mm)，并以每孔一个碎片的数量用指甲油黏附在96孔的elisa盘上，以进行软骨细胞的结合筛选。
[0048]
《对骨关节炎软骨组织裂解物与碎片的噬菌体殖株生物淘选》
[0049]
在「软骨组织裂解物」的生物淘选方面，组织裂解物的上清液以涂覆液[0.1 m nahco3,ph 8.6]稀释十倍，接着新鲜涂布于用于生物淘选的10厘米培养皿(和进行筛选的96孔elisa盘)上，并在使用前于4℃静置24小时。将组织裂解物涂覆的平板以包含1％bsa的pbs于4℃条件下封闭处理过夜，然后加入10pfu的ph.d.-12tm噬菌体(new england biolabs,ipswich,ma,usa)展示胜肽库并在4℃培养1小时。在洗涤后，将结合的噬菌体用1ml的er2738 的对数相培养物在37℃下以100rpm摇动20分钟而洗脱。所述洗脱的噬菌体库将在er2738中隔夜培养并扩增与滴定。回收的噬菌体将输入至下一轮的淘选，并从第五轮生物淘选中随机选择共130个噬菌体殖株进行培养以进行 elisa筛选。
[0050]
在「软骨组织碎片」的每一轮生物淘选中，软骨样品以包含1％的胎牛血清白蛋白(bsa)的pbs于4℃条件下封闭处理1小时。加入最初包含10个空斑形成单位(pfu)的ph.d.-12tm(new england biolabs,ipswich,ma,usa)噬菌体展示胜肽库，并在4℃下培养1小时。在洗涤后，将结合的噬菌体用1ml 的大肠杆菌er2738的对数相培养物(new england biolabs)在37℃下以 100rpm摇动30分钟而洗脱。所述洗脱的噬菌体库将在er2738中隔夜培养并扩增与滴定。回收的噬菌体将输入至下一轮的淘选，并从第五轮生物淘选中随机选择共95个噬菌体殖株进行培养以进行elisa筛选。
[0051]
《鉴定靶向骨关节炎软骨的氨基酸序列模体》
[0052]
所选择的噬菌体殖株与软骨组织裂解物和与软骨组织碎片的结合活性通过elisa进行检测。具有最高结合亲和力的噬菌体殖株(软骨组织裂解物的 a490值》0.15，且软骨组织碎片的a490值》2.0)将被选用并进行定序。通过氨基酸序列的比对，我们鉴定了五个具有不同保留性模体的组别(如表一所示)。
[0053]
《hpi-gl软骨细胞株以免疫荧光标记验证靶向骨关节炎软骨的胜肽》
[0054]
为了检测前列的噬菌体殖株，于室温下使用包含4％的多聚甲醛的pbs溶液固定培养于载玻片上的hpi-gl细胞15分钟，接着用pbs洗涤，并在室温下使用0.1％的triton x-100透化30分钟，以阻断与1％的bsa/pbst的非特异性结合。载玻片上培养的hpi-gl细胞将分别与4
×
108pfu、8
×
108pfu和109 pfu的选择的噬菌体殖株在4℃下培养1小时。在洗去未结合的噬菌体后，将细胞与作为一级抗体的抗m13小鼠单殖株抗体(ge healthcare,milwaukee, wi,usa)和作为二级抗体的r-藻红蛋白-affinipure f(ab')2片段山羊抗小鼠 igg(jackson immunoresearch inc.)分别在室温下培养1小时。接着，用pbst 洗涤，并在室温下用hoechst 33258(1μg/ml；sigma-aldrich)复染10分钟。细胞与噬菌体结合和定位将以共轭焦显微镜(zeiss lsm 700)进行荧光分析。
[0055]
《选择靶向骨关节炎软骨而非滑膜和半月板的胜肽》
[0056]
人类骨关节炎软骨标本将用以检验与关节组织结合的靶向噬菌体的定位。石蜡包埋切片的人类骨关节炎组织、滑膜和半月板是取自于经过中国医药大学暨附设医院研究伦理委员会核准的临床试验计划(irb编号为 cmuh108-rec1-046与t-cmu-23728)的人类骨关节炎手术治疗标本。前述试验已取得书面的知情同意书，并对所有人体组织样本进行了匿
名编码。所有切片皆以标准方法进行干燥、脱蜡与复水，接着与c5-87、c5-66、c5-83、c5-91、 c5-24、e5-8和c5-46噬菌体殖株或对照噬菌体(5
×
108pfu/μl)一起培养。在洗涤后，将切片于室温下以抗m13小鼠单殖株抗体(ge healthcare)处理1小时。在经过数个洗涤步骤后使用无生物素的超灵敏聚合物-hrp检测系统 (biogenex,fremont,ca,usa)检测其免疫反应性。所述载玻片将以苏木精进行微复染，并用aquatex(merck,darmstadt,germany)安装，而后用光学显微镜检验。选择在噬菌体殖株上显示与软骨细胞但未与滑膜或半月板具有显著结合的胜肽序列，并对其进行合成以用于后续的研究。
[0057]
《大鼠骨关节炎模型的建立》
[0058]
大鼠骨关节炎模型将以先前所述但稍作修改的方式建立。简而言之，本研究使用体重克的雄性sd大鼠。所有动物实验均获得中国医药大学实验动物照护及使用委员会的批准。大鼠于标准实验室的条件下(温度为24℃，明暗循环为12小时)饲养，并喂食标准餐食和饮用自来水。大鼠在每次注射前以流速70ml/min的2.5％异氟烷(abott,usa)麻醉。通过在每组大鼠的右膝中注射作为激活剂的0.2ml的4％木瓜蛋白酶溶液(sigma-aldrich,usa)与0.1ml的 0.03m半胱氨酸(sigma-aldrich,usa)，以诱导大鼠关节发生骨关节炎。而每组大鼠的左膝则注射相同剂量的食盐水。前述的注射分别在第四天和第七天重复进行，并在最后一次木瓜蛋白酶注射后两周，取大鼠膝盖进行组织学分析以确认骨关节炎的形成。在以下实验将进一步以建立的大鼠骨关节炎模型进行关节内注射。
[0059]
《制备罗丹明标记的c5-24胜肽及双光子显微镜观察》
[0060]
为了证明c5-24胜肽的骨关节炎特异性靶向活性，不能结合骨关节炎软骨的dylwqypditwh胜肽将作为扰码胜肽。罗丹明标记的c5-24胜肽和扰码胜肽分别注射至无骨关节炎(对照组)或以酶诱导的骨关节炎大鼠关节中。 c5-24胜肽和扰码胜肽是以化学方式相应地合成(abi,usa)，并通过点击反应在hepes缓冲溶液ph 8.0中以生物素-peg2-碘乙酰基桥连接分子修饰，再进一步与亲和素标记的罗丹明(jacksonimmuno,usa)连接，并在ddh2o中以截留分子量4k进行透析，以除去未标记的罗丹明，然后冻干并保存在-20℃条件下。于40μlpbs中的1μg罗丹明标记胜肽的等分试样将以30g针头进行关节内注射。
[0061]
大鼠的膝盖在注射后1天将被移除并彻底清洗其股骨和胫骨组织，而后将其浸入pbs中并精密地安装在3.5厘米的培养皿上以供双光子显微镜的观察。显微镜系统使用中心波长为810nm、脉冲重复频率为76mhz的近红外飞秒雷射(mira 900,coherent,usa)来运作，且于脉冲宽度为200fs下进行成像。雷射功率控制在足以产生shg和tpef的20mw，并可防止连续照明过程中所致的光损伤。因此，来自胶原蛋白纤维的shg波长为405nm，而来自胶原蛋白、弹性蛋白、fad和nadh的tpef波长则大约为450至650nm。所有影像通过雷射扫描仪(fluoview 300,olympus,japan)、用于雷射聚焦和收集光子的一双二物镜(uplansapo 20
×
/0.75,olympus,japan)以及两个分别用于侦测shg和 tpef的光电倍增管(r3896,hamamatsu,japan)而获得。shg和tpef通过带通滤镜(ff01-405/10,semrock,usa)和彩色玻璃(bg39,schott,germany)的组合而从强激发的雷射背景中滤除。接着，以二向分光镜(ff435-di01,semrock, usa)分开并回溯检测。在此需注意的是，我们使用立方偏振分束器(gt10-b, thorlabs,usa)结合半波长试板(ahwp05m-980,thorlabs,usa)与四分之一波长试板(aqwp05m-980,thorlabs,usa)来分别示例lp和cp成像。只有聚焦物镜后的线偏振消光比大于50：1且圆偏振的椭圆度(imax/imin)小于1.1才能用于后续的双光子成像。所获得的
影像主要使用imagej/fiji软件(nationalinstitutes of health,bethesda,md,usa)进行处理和分析。通过二次谐波生成影像重建的胶原蛋白ii的结构(图1a)呈现嵌合软骨细胞(黑色区域)周围的多孔胶原蛋白纤维互连结构(绿色)。
[0062]
《制备c5-24胜肽偶联超顺磁性氧化铁(spio)及红外光谱》
[0063]
c5-24胜肽和扰码胜肽是以化学方式合成，同时，直径50nm的氨基硅烷改性的spio颗粒(chemicellgmbh,germany)将先与琥珀酰亚胺基-[(n-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四甘醇]酯(thermo fisher scientific,usa)交联并于ph 8.5 的碳酸氢钠缓冲溶液中形成酰胺键，接着在ph 7.2的条件下与胜肽中半胱氨酸上的巯基相互作用而形成稳定的硫醚键，并在截流分子量为10k的ddh2o 中进行透析以除去游离形式的胜肽、桥连接分子、盐类和离去基团，并在减压状态下进一步浓缩，于pbs中再悬浮，并保存于4℃的环境中以供实验，且时间不得超过2周。为了分析胜肽在spio上的安装，部分制备而得的spios 将被冻干，并以1：100wt./wt.的溴化钾(kbr)彻底研磨，接着以200pound/inch2 的压力压缩而形成薄片以供红外光谱分析(perkin elmer,usa)。红外光谱将以 400-4000 1/cm的频率扫描，并分别记录透射模式下红外光谱的特征组和指纹区域分子组。
[0064]
《大鼠骨关节炎的磁共振成像(mri)分析》
[0065]
如结果所示，大鼠将在指定的时间点执行吸入性麻醉并进行mri扫描。 mri扫描是使用中国台湾地区“中央研究院生物医学研究所”的4.7t mr扫描系统 (bruker biospin,germany)。t1加权和t2加权的矢状截面将使用以下设定呈现：快速自旋回波序列，重复时间为2000ms，回波时间为72ms；切片厚度为 1mm；层间间隙为1mm；256矩阵；te为60；tr为2000；视场为60mm；平均数为2。使用体积60mm的谐振器和直径2cm的表面接收线圈来最大化影像分辨率和质量。mri的断层扫描仪dicoms以osirix md(osirix ltd.,usa) 进行分析。
[0066]
《小型猪骨关节炎模型、关节内注射c5-24胜肽偶联spio及3t-mri分析》
[0067]
关于利用前交叉韧带(acl)横断术建立骨关节炎的方面，中国台湾兰屿小型猪(9个月大，体重≈50-60kg)将通过肌内(i.m.)注射赐静宁(20mg/kg) 和硫酸阿托品(0.02mg/kg)而麻醉，接着在15分钟后肌内注射50(4 mg/kg,virbac animal health,france)。为了获得膝关节更均质的组别，本研究仅包含雌猪。在手术过程中继续使用含有氧气(流速为1.5l/min)、一氧化二氮(流速为1l/min)和1％异氟烷的气体来麻醉动物。动物的右后肢将被清洗并无菌地覆盖。在静脉注射头孢唑啉(2g)后，于髌骨至胫骨粗隆处切开约7 厘米的皮肤切口。然后将膝关节由内侧向髌骨韧带打开而使髌骨部分脱位。接着将前交叉韧带用夹子固定，并用手术刀在远程进行切割。为避免该横切后之前交叉韧带的自发性愈合，另使用电关节固定器进行近端切除。在成功地使用无菌的0.9％食盐水溶液润洗后，以缝线(ethicon,usa)将皮肤切口分层缝合。在此之后，迷你猪能够正常行走和活动。mri扫描是使用中国台湾实验仪器技术研究中心的3t mr扫描系统(achieva x 3.0,philips, germany)在指定的时间点进行。t1加权和t2加权的矢状截面将使用以下设定呈现：快速自旋回波序列，重复时间为2000ms，回波时间为72ms；切片厚度为3mm；512矩阵；te为200；tr为3500；视场为60mm；平均数为2。 mri断层扫描仪的dicoms以osirix md(osirix ltd.,usa)进行分析。
[0068]
《制备与c5-24胜肽和扰码胜肽偶联的透明质酸(ha)》
[0069]
胜肽偶联的ha是以前述方式合成，但稍作修改。简而言之，首先meha 通过甲基丙
烯酸酐(94％,m.w.154.17；sigma)与1％(wt/vol)的ha(透明质酸钠粉末，分子量≈110-150kda,kikkoman,japan)在ph值为8的去离子水中反应合成，并通过透析(截留分子量为6-8kda)进行纯化后冻干。中间体meha的大分子单体的甲基丙烯酸酯化效率是以1h nmr进行估算。c5-24胜肽和扰码胜肽皆在c端带有半胱氨酸残基，使巯基可以michael-addition反应与meha 反应。将meha大分子单体和胜肽溶解在三乙醇胺缓冲食盐水(teoa buffer, 0.2m teoa,0.3m total osmolarity,ph 8.0)中，并在37℃下保持过夜以进行胜肽偶联。胜肽偶联的ha在截止分子量为12k的ddh2o中进行透析，以除去游离形式的胜肽、teoa、盐类和ma后进一步冻干并在室温下保存。将偶联 ha的胜肽在0.1m的酸中裂解，并进行1h nmr以估算胜肽的偶联效率。
[0070]
《润滑剂性能分析》
[0071]
制备从股骨收集的人类关节软骨样品用于润滑的测试是将先前出版物的内容稍作修改。在中国医药大学暨附设医院研究伦理委员会的严格监督下，从接受全膝关节置换术的患者中切取人类骨关节炎软骨样品(irb编号： cmuh108-rec1-046与t-cmu-23728)，并小心避免在解剖过程中损坏关节表面。单一患者的骨关节炎软骨表层将保持完整，并打孔切割而分别获得直径为 8.0mm和6.0mm的圆盘，且在流变仪中进行摩擦测量时仅切割软骨的深层，以获得一个黏贴到经特别设计的测试模块的金属反面上。软骨是新鲜使用且无冻结或添加蛋白酶抑制剂，以免改变其表面润滑性能。将样品在pbs中剧烈洗涤过夜，以耗尽所有残留于软骨表面的润滑液，并将其分成至少3组。如结果所示，将软骨圆盘在1ml的原始ha或胜肽修饰的ha(pbs中的1％ha) 中预培养2小时，以使未修饰的ha或胜肽修饰的ha与软骨圆盘结合，接着将其浸入测试模块中的10ml pbs并安装在流变仪(hr-1,ta instrument ltd., usa)上以供摩擦测试。
[0072]
根据制造商的说明，流变仪依据使用标准方法而将初始值设置为零，接着我们在将样品加载到流变仪后使用电子卡尺计算软骨样品的初始高度。样品将以平行板构型而通过氰基丙烯酸酯胶黏附至顶部和底部的流变仪固定装置。软骨和金属固定装置表面仅黏有一层薄薄的胶水。6.0mm的样品表面将定位于 8.0mm表面的顶部。顶部样品将被降低并压在底部样品上，直到达到～0.01n 的载荷值，以避免样品表面之间接触不够、载荷值的波动与最小化高度测量的误差。流变仪自动感应的对应记录高度用于应变量的计算。仪器将进行设定以记录总软骨厚度并计算≈14％压缩时的高度。人类骨关节炎软骨样品的总厚度在≈2.5-3.5mm的范围内，其在覆有保护盖的ha/pbs溶液(10ml)水浴中进行测试以防止干燥。每个样品的正确对齐和表面不规则性皆被检查，并以具有平坦表面的样品进行实验。样品将浸入测试润滑剂中并压缩至其原始总高度的 86％，且通过在每个方向上以0.3mm/s的有效滑动速度旋转两圈而进行预处理，所述的速度定义为角速度乘以环状的有效半径reff＝ 2/3[(ro3-ri3)/(ro2-ri2)]。所述的预处理重复进行两次以上，随后进行3600秒的应力松弛期以使压缩软骨中的液体加压完全消退。对每个实验组的平衡法向应力数据进行记录与测量。润滑测试分14个阶段进行。前两个阶段可以忽略不计，并用以作为清理或预剪切阶段。进行阶段3、6、9和12以分析不同放松时间的影响。允许样品在测试之间放松1200、120、12和1.2秒。在阶段4-5、 7-8、10-11和13-14期间中记录润滑数据；每个阶段都以不同的旋转方向和恒定的剪切速率进行。在每次测试过程中皆测量扭矩(τ)和轴向力(n)，并根据以下公式确定动摩擦系数μk的瞬时测量值：μk＝τ/(reff
×
n)。将瞬时μk值在每个方向的第二
次旋转中取平均，以产生用于比对的平均μk。静摩擦系数在测试启动期间寻得最大扭矩值下被计算为瞬时μs＝τmax/(reff
×
n)。经实验后，由于软骨表面接受≈14％的压缩所致的中央凹痕将被验证。
[0073]
《大鼠间充质干细胞的分离和以spio标记，并通过c5-24胜肽偶联的ha 传递》
[0074]
大鼠间充质干细胞将如前述的方式进行分离与扩增。简而言之，从两只8 至10周大的sprague-dawley雌性大鼠(biolasco taiwan co ltd,taipei, taiwan)收集的股骨的软组织将被无菌分离。骨髓中的单核细胞将以密度梯度离心法分离并悬浮于完全培养基(ccm：16.6％的胎牛血清、100u/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素和2mm的l-谷氨酰胺的α-mem)之中，接着以 1
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105/cm2的密度植入培养皿。在24小时后以洗涤和更换培养基的方式除去非贴壁细胞。当细胞达到亚融合时，收集细胞(第0代)进一步进行继代培养。接着，将细胞以100个细胞/cm2的密度种植于ccm并于其中生长，并每周更换培养基两次。在这项研究中使用的间充质干细胞为第3-4代。
[0075]
在以超顺磁性氧化铁纳米颗粒(spio)标记的间充质干细胞的方面，将 50μg/ml的spio(chemicell gmbh,gemany)与0.75μg/ml的聚-l-赖氨酸 (sigma aldrich,usa)于培养基中预混合，并在室温下放置1小时。为了使spio 奈米颗粒被内吞，间充质干细胞将以每孔4
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104个细胞的密度种植在6孔盘中并生长24小时后，以pbs彻底洗涤。接着，将间充质干细胞收集到微量管中，以1
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106个细胞/200μl的浓度于37℃的条件下与无血清培养基中2％的c5-24 胜肽偶联ha一起培养30分钟。在关节腔内注射方面，ha封装的间充质干细胞的体积将被减小至25μl中包含1
×
106个细胞，并精密地注射到骨关节炎大鼠的膝关节滑液囊中。
[0076]
《组织学、免疫细胞荧光与免疫组织化学分析及共轭焦显微镜观察》
[0077]
在ha封装的间充质干细胞移植的组织学分析方面，如结果所示，大鼠将在移植后的时间点被牺牲并切除整个膝关节，膝关节以包含4％的多聚甲醛 (pfa)的pbs固定，接着在0.5m的edta中脱钙2周后包埋于石蜡中，并沿矢状方向连续切片为5μm的厚度。以标准方法制备的股骨中部的连续切片将进行h&e染色、普鲁士蓝染色和番红o染色，并以位相差显微镜(carl zeiss) 观察。在h&e染色方面，将脱石蜡的玻片进行连续复水处理后，以lillie mayer 苏木精(sigma aldrich,usa)染色10分钟，再以伊红y(sigma aldrich,usa)染色30秒，最后进行一系列的脱水、清洁和固定。普鲁士蓝染色的载玻片制备类似于h&e染色，其将复水的载玻片以含有5％的亚铁氰化钾的10％hcl溶液(sigma aldrich,usa)染色20分钟，再用fast red进行反染，最后脱水定型、清洗并用树脂固定凝胶和盖玻片。在番红o染色方面，复水的玻片先以0.05％的fast green溶液染色3分钟，然后再以0.1％的番红o染色溶液染色5分钟，最后清洗并用树脂凝胶固定。
[0078]
关于ha封装的间充质干细胞的共轭焦显微镜观察，ha将被甲基丙烯酸酯化并与以pbs制备的2％alexa-488荧光染料偶联。间充质干细胞被收集至微量管中并根据制造商的说明而以dil3荧光染料标记(invitrogen,usa)，并在 37℃的ha溶液中培养30分钟。随后，将其滴于载玻片上并立即以共轭焦显微镜(leica)观察，然后用imagej fiji(nih)重建3d影像。
[0079]
《以亲和吸附、液相层析串联质谱仪(lc-ms/ms)和elisa鉴定c5-24胜肽的目标蛋白》
[0080]
为了鉴定c5-24胜肽链的结合目标，人类骨关节炎软骨样品将被均质化以供亲和吸附。首先将pbs中的1mg/ml生物素修饰的c5-24胜肽添加至软骨均质液中，并在4℃下培养1小时。在洗涤后，加入dtssp溶液至最终浓度为 2mm，以使胜肽-目标蛋白交联。所述的反应混合物将于室温下旋转培养30 分钟。所述反应以1m tris碱终止。在用第一种裂解缓冲溶液(1m nacl in 100 mm tris acetate,ph 8.0)于4℃裂解软骨细胞24小时后离心裂解物，接着用第二种裂解缓冲溶液(4m guanidine hcl,65mm dtt,10mm edta in 50mmsodium acetate,ph 5.8)于4℃再反应24小时。在离心后，将胍提取物与100％的乙醇(体积比为5：1)于-20℃下混合16小时，以确保除去残留的盐酸胍。接着以16,000
×
g和4℃的条件下离心45分钟，以使目标蛋白分层沉淀，而后以90％的乙醇洗涤沉淀物后干燥，再以包含100μg/ml的胃蛋白酶的100mm 乙酸复溶。将myone链霉亲和素c1 dynabeads(invitrogen,carlsbad,ca,usa) 加入蛋白质裂解物中并彻底混合1小时。免疫磁分离法可提取胜肽-蛋白质复合物。最后，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳(sds-page) (bio-rad)分离纯化的蛋白质，并用silverquest银染试剂盒(invitrogen)进行银染。
[0081]
将染色的蛋白条带切成小块，并用含有50％的acn的10mm碳酸氢铵 (abc,sigma,st louis,mo)洗涤5分钟并重复三次。凝胶碎片以100％的can 脱水，并以含有1ng/μl的胰蛋白酶(promega,madison,wi)的25mm abc溶液 (ph 8.2)复水，而后于37℃下培养过夜。在降解后，胰蛋白酶胜肽将以含有 1％的fa的50％acn溶液而从凝胶中提取，并使用离心浓缩机进行干燥。胜肽片段将以lc-ms/ms鉴定。lc-ms/ms是使用离子阱质谱仪(hctultra ptmdiscovery,bruker,billerica,ma)在线连接ultimate 3000nanolc系统(dionex, sunnyvale,ca)而运行。样品被注入吸附管柱(c18,5μm,1mm
×
5mm,dionex, sunnyvale,ca)中并以流速300nl/min通过逆相管柱(atlantis c18,3μm,75μm
ꢀ×
150mm,waters,milford,ma)而在线分离。胜肽在6分钟内以h2o/acn梯度2至40％而以溶剂b(100％acn,0.1％fa)洗脱，并在24分钟内以40至70％而从的b洗脱。ms和ms/ms的扫描范围分别为400-1600m/z和100-2500m/z。经elisa验证后，使用mascot(matrix science,london,uk)和turbosequest 搜索引擎(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)检索swiss proteindatabase来鉴定蛋白质候选物。
[0082]
首先，elisa盘将在室温下以涂覆液(0.5m nahco3)中的胶原蛋白 alpha-3(vi)和胶原蛋白alpha-1(xii)涂覆2小时，并于4℃的条件下用5％的牛奶/tbst封闭过夜。生物素修饰的胜肽将被加入elisa盘中，并于室温下培养1小时。而后用pbs洗涤并用偶联有hrp的小鼠抗m13抗体(gehealthcare biosciences)探测生物素修饰的胜肽。生物素修饰的胜肽与公知的胶原蛋白alpha-3(vi)或胶原蛋白alpha-1(xii)的结合通过与hrp偶联的链霉亲和素(thermo pierce biotechnology scientific)而检测。所述孔盘将以pbs洗涤，然后与过氧化酶基质邻苯二胺二盐酸盐(opd；sigma)一起培养。所述反应以3n 的hcl终止，并用酵素免疫分析测读仪测量于490nm的吸亮度。
[0083]
《c5-24胜肽对接目标的同源性建模》
[0084]
依照开发人员的指示而利用dassault systems(biovia,discovery studiomodeling environment,release 2019,san diego,usa)进行分子建模，以进一步确认所选择的噬菌体殖株在软骨组织的结合目标。简而言之，从uniprot数据库检索到的人类、小鼠和猪的colxii标准序列代码分别为q99715、q60847 和f1rqi0。基于来自blast结果的模板
(pdb code:1fnf,2b2x,2uur)，使用modeler建立了三个人类colxii同源性模型的不同部分。第一个人类 colxii模型的长度是从l1385到s2285，与模板1fnf具有30％的一致性，这说明了纤连蛋白的结构，且由于高度保守的结构拓扑而可用于建模。第二个和第三个人类colxii模型分别是k2321至l2513和s2506至p2724，分别与模板2b2x和2uur具有31％和36％的序列一致性。所有同源性模型先通过pdf 总能量、dope(离散优化蛋白质能量)、得分验证及ramachandran图像检查，并优化结构以获得合理的主链和侧链构型。由于ihc中最有希望的结果，最有代表性的蛋白质模板将用于预测c5-24和c5-91胜肽链的结合位点和构型。随后，使用zdock进行蛋白质-胜肽对接以搜索潜在的结合区。z_dock得分和e_r_dock得分用于验证胜肽和目标蛋白模板的间的对接能力和正确性。
[0085]
《统计分析》
[0086]
前列数据表示为平均值
±
sd，通过学生t检验或单因子独立变异数分析 (anova)进行统计比对，p值《0.05被认为是显著的。所有计算均使用获得中国医药大学许可的统计分析系统(sas)进行。所示的所有体内数据皆代表进行至少3次独立实验。
[0087]
虽然本发明已以实施方式揭露如上，但是其他实施例也是可能的。因此，后附的权利要求的精神和范围不应限于所包含的实施例的描述。
[0088]
任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。