免疫刺激细菌递送平台及其用于递送治疗产物的用途的制作方法

发明领域提供了具有被修饰的基因组的减毒免疫刺激细菌，以例如降低毒性和提高抗肿瘤活性，例如通过增加在肿瘤微环境中、特别是在肿瘤驻留骨髓细胞中的积累，通过提高对补体失活的抗性，通过减少免疫细胞死亡，通过促进适应性免疫及通过增强t细胞功能而实现。吞噬细胞定植的增加改善了编码的治疗产物向肿瘤微环境和肿瘤的递送，并允许所述免疫刺激细菌的全身施用等途径。

背景技术：

0、发明背景

1、抗ctla-4、抗pd-1和抗pd-l1免疫检查点抗体的临床成功证明，癌症免疫治疗领域取得了长足进步(见例如buchbinder et al.(2015)j.clin.invest.125:3377-3383；hodiet al.(2010)n.engl.j.med.363(8):711-723；and chen et al.(2015)j.clin.invest.125:3384-3391)。肿瘤已经进化出一种极度的免疫抑制环境。其启动多种机制以逃避免疫监视，重新编程抗肿瘤免疫细胞以抑制免疫性，并且持续突变出对最新癌症疗法的抗性(见例如mahoney et al.(2015)nat.rev.drug discov.14(8):561-584)。设计克服免疫耐受和逃逸及同时限制目前的免疫疗法的自身免疫相关毒性的免疫治疗方法和癌症治疗方法在免疫肿瘤学领域是个挑战。因此，需要额外的和创新的免疫疗法和其它疗法。

技术实现思路

0、发明概述

1、提供了含有基因组修饰的免疫刺激细菌，和编码一种或多种治疗产物例如抗癌治疗剂或相关治疗剂的质粒。所述基因组修饰导致免疫刺激细菌在肿瘤微环境和肿瘤驻留免疫细胞中积累，并在其中表达编码的治疗产物。本文提供的免疫刺激细菌编码一种或多种互补产物，这些互补产物在受试者中刺激或诱导或导致强力的抗癌反应。

2、提供了含有在真核启动子控制下的编码治疗产物或治疗产物组合的质粒的免疫刺激细菌。所述细菌的基因组包含选自以下的修饰，例如一种、两种或更多种修饰：

3、a)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以产生五酰化脂多糖(lps)，其中：

4、通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分来修饰免疫刺激细菌的基因组，由此所述细菌被修饰以产生五酰化脂多糖；和/或

5、与野生型细菌相比，六酰化脂多糖显著减少至少10倍，或不存在；

6、b)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌具有减弱的toll样受体(tlr)的识别，所述受体为tlr2、tlr4和tlr5；

7、c)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌不激活卷曲菌毛和/或纤维素的合成；

8、d)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌不激活分泌的天冬酰胺酶的合成；

9、e)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌对于嘌呤、腺苷或atp是营养缺陷型的；

10、f)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌缺乏鞭毛；

11、g)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以特异性感染肿瘤驻留骨髓细胞；

12、h)缺失或破坏或失活一个或多个基因的全部或足够部分，由此所述细菌被修饰以特异性感染肿瘤驻留骨髓细胞，并且不能在肿瘤驻留骨髓细胞中复制；和

13、i)缺失或破坏或失活lppa和lppb之一或二者，以降低或消除脂蛋白在膜中的表达，由此编码的治疗性蛋白质在肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞中的表达增加。

14、例如，所述免疫刺激细菌含有a)、d)和f)的修饰，包括缺失、插入和置换，或c)和d)的修饰，或a)、c)、d)、e)和f)的修饰，或a)、c)、d)、e)、f)和i)的修饰，或a)、d)、f)和i)的修饰，或c)、d)和i)的修饰，或f)和i)的修饰，或a)至i)的修饰，或a)、b)、d)和f)的修饰，或a)、b)、c)和d)的修饰，以及a)至i)的其它组合。

15、在所有实施方案中，免疫刺激细菌还可以包含或进一步包含编码鞭毛的基因的缺失或破坏，由此所述细菌是鞭毛蛋白-(flic-/fljb-)并且不产生鞭毛，其中野生型细菌具有鞭毛。所述免疫刺激细菌可以是嘌呤营养缺陷型，例如腺苷营养缺陷型，或腺苷、腺嘌呤和/或atp营养缺陷型。所述免疫刺激细菌也可以是puri-。所述免疫刺激细菌也可以是pagp-。所述免疫刺激细菌也可以是asd-(天冬氨酸-半醛脱氢酶-)，例如当细菌是asd-时，由于编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)的内源基因的全部或部分破坏或缺失，从而内源性asd不表达。所述细菌可以在质粒上编码在细菌启动子控制下的天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)。所述免疫刺激细菌也可以是msbb-，或可以是pagp-/msbb-。例如，所述免疫刺激细菌可以是asd-、puri-、msbb-、鞭毛蛋白-(flic-/fljb-)和pagp-，或者可以是asd-、csgd-、puri-、msbb-、鞭毛蛋白-(flic-/fljb-)和pagp-。在一些实施方案中，所述免疫刺激细菌是ansb-、asd-、csgd-、puri-、msbb-、鞭毛蛋白-(flic-/fljb-)和pagp-。

16、提供了含有在真核启动子控制下编码治疗产物的质粒，或在多个真核启动子或单个启动子控制下编码多个产物的免疫刺激细菌。免疫刺激细菌的基因组通过缺失足够部分的基因或通过破坏基因而被修饰，由此所述细菌是ansb-、asd-、csgd-、puri-、msbb-、鞭毛蛋白-(flic-/fljb-)和pagp-中的一种或多种细菌。本文提供的免疫刺激细菌还包括具有缺失或破坏的基因lppa(lpp1)和/或lppb(lpp2)的那些细菌，其分别编码主要外膜脂蛋白lpp1(lppa)和lpp2(lppb)，以消除或基本上减少所编码的脂蛋白的表达。特别地，所述细菌是lppa-和lppb-。提供了免疫刺激细菌，其含有在真核调节序列控制下编码抗癌治疗剂的质粒，并且是lppa-和lppb-。例如，所述免疫刺激细菌可以是ansb-、asd-、csgd-、puri-、msbb-、鞭毛蛋白-(flic-/fljb-)、pagp-、lppa-和lppb-。

17、在本文的实施方案中，所述治疗产物是抗癌治疗剂或用于癌症治疗的治疗剂。编码的产物可以与编码分泌信号的核酸可操作地连接，由此当表达时，所述治疗产物被分泌，例如从肿瘤驻留免疫细胞中分泌。

18、任何免疫刺激细菌还可以具有涉及沙门氏菌(salmonella)致病岛1(spi-1)侵袭的一个或多个基因或操作子被缺失或失活，由此所述免疫刺激细菌不会侵入或感染上皮细胞。例如，所述一种或多种基因/操作子选自以下：avra、hila、hild、inva、invb、invc、inve、invf、invg、invh、invi、invj、iacp、iagb、spao、spaq、spar、spas、orga、orgb、orgc、prgh、prgi、prgj、prgk、sica、sicp、sipa、sipb、sipc、sipd、sirc、sopb、sopd、sope、sope2、sprb和sptp。

19、免疫刺激细菌中的质粒可以以低拷贝数或中等拷贝数存在。所述质粒可以含有中等至低拷贝数的复制起点，例如低拷贝数的复制起点。在一些实施方案中，所述质粒以较高的拷贝数存在。一般而言，中等拷贝数小于150或小于约150，大于20或约20，或介于20或25和150之间；低拷贝数小于25，或小于20，或小于约25，或少于约20个拷贝。具体而言，低至中等拷贝数小于约150个拷贝，或小于150个拷贝；低拷贝数小于约25个拷贝，或小于25个拷贝。

20、提供了核酸构建体，其是编码产物例如蛋白质的核酸分子，其被设计成引入细胞或质粒中以表达编码的产物。所述构建体含有编码多种抗癌产物的核酸，作为在单个启动子控制下的多顺反子序列。所述启动子可以是真核启动子。本文提供和描述了其它真核生物调节序列例如增强子和编码蛋白质转运信号例如分泌信号的核酸，以及其它调节控序列例如终止子，包括防止在所述构建体上的细菌启动子通读的细菌终止子，以及元件的特定构型和产物编码核酸开放阅读框和/或基因的顺序。在所述构建体中，多顺反子序列可以包括导致由多顺反子构建体编码的分立产物表达的信号或编码信号，例如肽。这种肽的实例是病毒肽的2a家族。所述构建体包括在编码每个产物的每个开放阅读框之间的这种肽或其它信号。所述2a肽包括t2a、p2a、e2a或f2a中的一种或多种。

21、抗癌产物包括用于治疗癌症或促进或有助于或刺激或帮助受试者的抗癌反应的任何产物。通常抗癌产物是蛋白质。编码的产物包括在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的一种或多种免疫刺激蛋白。示例的编码的产物是在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白，例如选自以下一种或多种中的任意：il-2，il-7，il-12p70(il-12p40+il-12p35)，il-15，具有减弱的与il-2ra结合的il-2，il-15/il-15rα链复合物，il-18，il-21，il-23，il-36γ，修饰的不结合il-2ra的il-2，cxcl9，cxcl10，cxcl11，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，ccl3，ccl4，ccl5，参与或影响或增强t细胞募集/持续性的蛋白质，共刺激蛋白，例如cd40，cd40配体(cd40l)，cd28，ox40，ox40配体(ox40l)，4-1bb，4-1bb配体(4-1bbl)，包括胞质结构域缺失或截短以消除免疫抑制反向信号传导的共刺激蛋白的形式，其具有促进细胞中正确方向(即细胞质中的细胞质结构域)的任选修饰；b7-cd28家族成员，cd47拮抗剂，抗il-6抗体或il-6结合诱饵受体，tgf-β多肽拮抗剂，包括可溶性tgf-β受体和tgf-β拮抗剂，以及肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族的成员。

22、其它产物包括在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白，其选自以下一种或多种：ifn-α，ifn-β，gm-csf，il-2，il-7，il-12，il-15，il-18，il-21，il-23，il-12p70(il-12p40+il-12p35)，il-15/il-15rα链复合物，il-36γ，与il-2ra结合减弱的il-2，经过修饰使其不结合il-2ra的il-2，cxcl9，cxcl10(ip-10)，cxcl11，ccl3，ccl4，ccl5，参与t细胞的潜在募集和/或持续性的分子，cd40，cd40配体(cd40l)，ox40，ox40配体(ox40l)，4-1bb，4-1bb配体(4-1bbl)，缺失胞质结构域(4-1bblδcyt)或部分缺失胞质结构域的4-1bbl，所述结构域被缺失或截短以消除免疫抑制反向信号传导，b7-cd28家族成员，和肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员。例如，所述构建体可含有编码具有缺失或部分缺失的胞质结构域或部分缺失的胞质结构域并且任选包括氨基酸修饰的4-1bbl的核酸，由此所得4-1bbl当在细胞中表达时假定是正确方向(见seq id no:389-392和下文的详细描述，提供了示例的具有截短的胞质结构域的修饰的4-1bbl变体，其中残基被带正电荷的残基(即k和l)置换以当在细胞中表达时赋予正确的方向)。所述胞质结构域被截短至足以消除或减少免疫抑制反向信号传导。因此，提供了构建体，所述构建体含有编码具有缺失或部分缺失的胞质结构域的4-1bbl的核酸或编码具有截短和修饰的胞质结构域的修饰的4-1bbl的核酸，其中4-1bbl的序列在seq id no:389-392中示出，并在下文的详细描述和实施例中举例说明了序列。构建体还可以含有编码以下任何产物和产物组合的核酸：

23、il-12、或il-15、或il12p70、或il-15/il-15rα链复合物中的一种或多种；

24、细胞因子和sting通路激动剂；

25、细胞因子、sting通路激动剂和共刺激分子或免疫检查点抑制剂；

26、细胞因子和sting通路激动剂，以及tgf-β多肽拮抗剂；

27、细胞因子、sting通路激动剂、tgf-β多肽拮抗剂和共刺激分子(受体或配体)或免疫检查点抑制剂，

28、其中sting通路激动剂是通过激活sting通路增加i型干扰素表达的任何产物。示例的是编码干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，sting)多肽或其变体或其嵌合体的构建体，如本文详细描述。其中的构建体是编码治疗产物组合的那些构建体，所述治疗产物组合选自以下组合：

29、抗ctla-4抗体和sting多肽，

30、il-15和sting多肽，

31、4-1bbl和sting多肽，

32、tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，和sting多肽，

33、il-12和sting多肽，

34、抗ctla-4抗体、il-15和sting多肽，

35、4-1bbl、il-15和sting多肽，

36、tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂、il-15和sting多肽，

37、抗ctla-4抗体、il-12和sting多肽，

38、4-1bbl、il-12和sting多肽，

39、tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂、il-12和sting多肽，

40、抗ctla-4抗体、il-15、tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂和sting多肽，

41、4-1bbl和il-15，tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，以及一种sting多肽，

42、抗ctla-4抗体，和il-12，tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，和sting多肽，

43、4-1bbl和il-12，tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，以及sting多肽，

44、抗ctla-4抗体、il-12、il-15和sting多肽，

45、4-1bbl、il-12、il-15和sting多肽，

46、tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂、il-12、il-15和sting多肽，

47、tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂、il-12、il-15和sting多肽，

48、抗ctla-4抗体、il-12、il-15、tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂和sting多肽，

49、4-1bbl、il-12、il-21、tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂和sting多肽，

50、抗ctla-4抗体、il-12、il-15和tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，

51、4-1bbl、il-12、il-21和tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，

52、il-12、il-15和sting多肽，

53、il-15、il-21和sting多肽，

54、il-12、il-21和sting多肽，

55、抗ctla-4抗体、il-15、il-21和sting多肽，

56、抗ctla-4抗体、il-12、il-21和sting多肽，

57、4-1bbl、il-15、il-21和sting多肽，

58、4-1bbl、il-12、il-21和sting多肽，

59、抗ctla-4抗体和il-15，

60、抗ctla-4抗体、il-15和tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，

61、4-1bbl和il-15，

62、4-1bbl、il-15和tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，

63、抗ctla-4抗体和il-12，

64、抗ctla-4抗体和il-12，以及tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，

65、4-1bbl和il-12，

66、4-1bbl、il-12和tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，

67、抗ctla-4抗体和tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，

68、4-1bbl和tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，

69、il-15和tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，

70、il-12和tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，

71、il-12、il-15和tgf-β诱饵受体或多肽拮抗剂，和

72、il-15和il-21，以及tgf-诱饵受体或多肽拮抗剂，其中：

73、抗ctla-4抗体是scfv或scfv-fc；

74、sting多肽包括野生型sting，或变体sting多肽，或嵌合sting多肽，以及具有赋予例如功能获得(gain-of-function)的氨基酸置换的嵌合sting蛋白；及

75、4-1bbl是具有缺失的胞质结构域的4-1bbl、具有修饰的胞质结构域的4-1bbl、具有截短的胞质结构域的4-1bbl，或具有截短和修饰的胞质结构域的4-1bbl。

76、其它构建体包括编码选自以下的治疗产物组合的那些构建体：

77、il-2和il-12p70；

78、il-2和il-21；

79、il-2，il-12p70，和sting功能获得(gof)变体；

80、il-2，il-21，和sting gof变体；

81、il-2，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)，其中δcyt是缺失的胞质结构域；

82、il-2，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

83、il-15/il-15rα，和sting gof变体；

84、il-15/il-15rα，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

85、il-15/il-15rα和il-12p70；

86、il-15/il-15rα和il-21；

87、il-15/il-15rα，il-12p70，和sting gof变体；

88、il-15/il-15rα，il-21，和sting gof变体；

89、il-15/il-15rα，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

90、il-15/il-15rα，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

91、il-12p70和il-21；

92、il-12p70，il-21，和sting gof变体；

93、il-12p70，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

94、il-12p70和sting gof变体；

95、il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

96、il-12p70和il-18；

97、il-12p70，il-18，和sting gof变体；

98、il-12p70，il-18，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

99、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-2，和il-12p70；

100、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-2，和il-21；

101、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-2，il-12p70，和sting gof变体；

102、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-2，il-21，和sting gof变体；

103、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-2，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

104、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-2，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

105、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-15/il-15rα，和sting gof变体；

106、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-15/il-15rα，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

107、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-15/il-15rα，和il-12p70；

108、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-15/il-15rα，和il-21；

109、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-15/il-15rα，il-12p70，和sting gof变体；

110、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-15/il-15rα，il-21，和sting gof变体；

111、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-15/il-15rα，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

112、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-15/il-15rα，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

113、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-12p70，和il-21；

114、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-12p70，il-21，和sting gof变体；

115、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-12p70，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

116、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽和il-12p70；

117、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-12p70，和sting gof变体；

118、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

119、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-12p70，和il-18；

120、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-12p70，il-18，和sting gof变体；

121、tgf-β诱饵受体或拮抗剂多肽，il-12p70，il-18，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

122、tgf-β诱饵受体和sting gof变体；

123、抗-ctla-4抗体，il-2，和il-12p70；

124、抗-ctla-4抗体，il-2，和il-21；

125、抗-ctla-4抗体，il-2，il-12p70，和sting gof变体；

126、抗-ctla-4抗体，il-2，il-21，和sting gof变体；

127、抗-ctla-4抗体，il-2，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

128、抗-ctla-4抗体，il-2，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

129、抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，和sting gof变体；

130、抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

131、抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，和il-12p70；

132、抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，和il-21；

133、抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，il-12p70，和sting gof变体；

134、抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，il-21，和sting gof变体；

135、抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

136、抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

137、抗-ctla-4抗体，il-12p70，和il-21；

138、抗-ctla-4抗体，il-12p70，il-21，和sting gof变体；

139、抗-ctla-4抗体，il-12p70，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

140、抗-ctla-4抗体和il-12p70；

141、抗-ctla-4抗体，il-12p70，和sting gof变体；

142、抗-ctla-4抗体，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

143、抗-ctla-4抗体，il-12p70，和il-18；

144、抗-ctla-4抗体，il-12p70，il-18，和sting gof变体；

145、抗-ctla-4抗体，il-12p70，il-18，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

146、抗-ctla-4抗体和sting gof变体；

147、cd40激动剂，il-2，和il-12p70；

148、cd40激动剂，il-2，和il-21；

149、cd40激动剂，il-2，il-12p70，和sting gof变体；

150、cd40激动剂，il-2，il-21，和sting gof变体；

151、cd40激动剂，il-2，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

152、cd40激动剂，il-2，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

153、cd40激动剂，il-15/il-15rα，和sting gof变体；

154、cd40激动剂，il-15/il-15rα，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

155、cd40激动剂，il-15/il-15rα，和il-12p70；

156、cd40激动剂，il-15/il-15rα，和il-21；

157、cd40激动剂，il-15/il-15rα，il-12p70，和sting gof变体；

158、cd40激动剂，il-15/il-15rα，il-21，和sting gof变体；

159、cd40激动剂，il-15/il-15rα，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

160、cd40激动剂，il-15/il-15rα，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

161、cd40激动剂，il-12p70，和il-21；

162、cd40激动剂，il-12p70，il-21，和sting gof变体；

163、cd40激动剂，il-12p70，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

164、cd40激动剂和il-12p70；

165、cd40激动剂，il-12p70，和sting gof变体；

166、cd40激动剂，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；

167、cd40激动剂，il-12p70，和il-18；

168、cd40激动剂，il-12p70，il-18，和sting gof变体；

169、cd40激动剂，il-12p70，il-18，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；及

170、cd40激动剂和sting gof变体，其中：

171、4-1bbl是具有缺失的胞质结构域的4-1bbl(4-1bblδcyt)、具有修饰的胞质结构域的4-1bbl、具有截短的胞质结构域的4-1bbl或具有截短和修饰的胞质结构域的4-1bbl；和

172、抗-ctla-4抗体是scfv或scfv-fc。

173、sting多肽的示例是其中sting多肽被修饰以导致i型干扰素的表达增加或组成型表达的那些多肽，或者是一种嵌合多肽，其包含具有来自不同物种的c末端尾区的人sting多肽，其nf-κb信号传导活性低于人sting的nf-κb信号传导活性，其中例如ctt中的traf6结合位点任选缺失；且人sting蛋白具有seq id no:305-309所示序列。编码的产物的特定组合包括其中所编码的治疗性蛋白质包含il-12p70和嵌合人sting多肽的那些组合，所述嵌合人sting多肽具有来自袋獾的ctt和导致i型干扰素表达增加或组成型表达的氨基酸置换，或者是具有导致i型干扰素表达增加或组成型表达的氨基酸置换的sting多肽，其中导致i型干扰素表达增加或组成型表达的突变是功能获得性突变。示例的是具有在详细描述部分中描述的置换的sting蛋白质或多肽，例如参考与示出人sting蛋白的seq id no:305-309任一的比对，在sting多肽中的氨基置换对应于r284g或n154s/r284g。这些构建体可以另外编码il-36γ和/或免疫检查点抑制剂抗体。如本文所述，抗体包括其抗原结合部分，以及任何各种形式的抗体，例如但不限于scfv和scfv-fc(通常为igg fc)，其中fc的存在使所得产物多聚化，由此其具有两条链。靶向的免疫检查点包括但不限于ctla-4或pd-1或pd-l1，并且其抗体形式包括scfv和scfv-fc双链多肽。

174、提供了含有上述构建体以及贯穿本文的质粒。质粒包括细菌质粒，其中构建体与真核转录调节序列可操作地连接。

175、提供了组合物，例如药物组合物，其含有由所述构建体或质粒编码的抗癌蛋白产物的混合物，作为所述组合物中唯一的抗癌蛋白。因此，在这些组合物中提供了含有治疗性蛋白质的互补组合的组合物；所述混合物包括独特的药剂组合。这些组合包括本文提供和描述的药剂组合。

176、还提供了含有任何所述构建体和/或质粒的免疫刺激细菌。所述构建体和质粒可以在本文提供的、包括上文和下文讨论的任何免疫刺激细菌中提供或引入其中。还可以将所述构建体和质粒引入本领域已知的合适细菌中，例如在出版物例如国际申请公开号wo2020/172461和wo2020/172462以及美国专利号10,449,237、10,286,051和9,616,114中描述的细菌。

177、本文提供的免疫刺激细菌包括基因组修饰，例如缺失、破坏和改变，例如改变全部或部分基因的方向，从而不表达功能性基因产物。其中提供的免疫刺激细菌是经过修饰以使所得细菌是msbb-/puri-的那些。在一些实施方案中，所述细菌是msbb-和puri-，由此msbb-和/或puri-基因的至少编码部分的全长被缺失。也可以修饰细菌的基因组，使细菌缺乏鞭毛。这是在通常表达鞭毛的细菌中实现的。在这样的细菌中，例如沙门氏菌中的基因或其它物种中与flic-/fljb-相当的基因，可以被缺失或进行其它修饰，从而不表达功能性基因产物。细菌还可以被修饰为腺苷营养缺陷型和/或是msbb-/pagp-。还提供了免疫刺激细菌和含有其的药物组合物，其中所述细菌不表达l-天冬酰胺酶ii，由此所述细菌是ansb-。

178、提供了含有在真核启动子控制下编码治疗产物的质粒的免疫刺激细菌，其中所述免疫刺激细菌的基因组通过缺失或破坏一个或多个基因的全部或足够部分而被修饰，由此所述细菌不激活分泌的天冬酰胺酶的合成。这种细菌的实例是其中天冬酰胺酶是由基因ansb编码的l-天冬酰胺酶ii的那些细菌。

179、本文表明，在是msbb-和puri-的亲本菌株vnp20009中，基因没有完全缺失。在所提供的免疫刺激细菌中，细菌的基因组被修饰，由此msbb-和puri-基因的至少编码部分的全长被缺失。这些菌株比亲本菌株更适合、更快和/或更大程度生长。在本文的所有实施方案中，可以修饰细菌以使天然asd基因产物失活或不表达。为了帮助产生所述菌株，将asd基因在原核启动子如诱导型启动子控制下的质粒上编码。

180、在实施方案中，所述菌株包括修饰使得细菌缺乏鞭毛，并且是pagp-、ansb-和csgd-。此外，所述细菌是puri-和asd-。因此提供了菌株，包括修饰的亲本菌株，其已经是msbb-和puri-，和/或具有其它修饰，特别是修饰lps的那些修饰，所述菌株也是δasd/δflg/δpagp/δansb/δcsgd。所述菌株也可以是腺苷营养缺陷型或腺苷和腺嘌呤营养缺陷型。

181、编码的治疗产物包括核酸和蛋白质。质粒可以编码两种或更多种治疗产物。示例的产物包括但不限于细胞因子、组成型诱导i型干扰素(ifn)的蛋白质和共刺激受体或配体。下文描述了进一步的示例组合。在一些实施方案中，共刺激分子缺乏在抗原呈递细胞(apc)上表达的全部或部分胞质结构域，由此截短的分子能够通过共刺激受体向t细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失或截短或以其它方式修饰的胞质结构域或其部分而不能向抗原呈递细胞(apc)发出反调节信号。其它产物包括激活治疗性蛋白质的酶，例如激活前药的那些。如本文和下文所述，本文提供的免疫刺激细菌编码抗癌治疗剂，包括组合的治疗产物组合以提供强大的抗癌反应。编码的蛋白质是上文和下文列出的每一种产物，以及来自不同类别的产物的组合。包括共刺激蛋白，例如4-1bbl，特别是具有截短或缺失的胞质结构域以消除免疫抑制反向信号传导以及还具有任何补偿性突变以确保所得蛋白质在细胞中表达时在细胞膜中正确定向的那些。其它产物包括sting通路激动剂以诱导或导致i型干扰素组成型表达。这些产物包括sting蛋白，特别是本文提供和描述的修饰的和嵌合的sting蛋白。一种或多种细胞因子例如il-12、il-15、il-21、l-12p70(il-12p40+il-12p35)、与il-2ra结合减弱的il-2、il-15/il-15rα链复合物及其它例如il-18、il-21、il-23、il-36γ也在质粒上编码。除共刺激产物外，sting通路激动剂蛋白如sting和细胞因子、抗体如检查点抑制剂抗体包括抗ctla-4抗体均可在质粒上编码。所述抗体可以是scfvs和scfvs-fc双链形式，以及其它形式。此外，在其它产物中，可以包括tgf-β拮抗剂和tgf-β受体诱饵。

182、编码的治疗产物可以与编码真核宿主识别的调节序列的核酸例如分泌信号可操作地连接，以实现从包含所述细菌或质粒的细胞中分泌。在免疫刺激细菌编码两种或更多种产物的实施方案中，每种产物的表达可以在单独启动子的控制下。或者，可以在单个启动子的控制下表达两种或更多种产物，并且每种产物由编码例如内部核糖体进入位点(ires)或2a肽的核酸分开，以实现每种编码的治疗产物的单独表达。示例的2a肽是t2a、f2a、e2a或p2a，其可以在编码治疗产物的核酸的侧翼，以实现在单个启动子的控制下表达的治疗产物的单独表达。治疗产物在真核启动子如rna聚合酶ii启动子或rna聚合酶iii启动子的控制下表达。这些启动子包括是病毒启动子的rna聚合酶ii启动子，或哺乳动物rna聚合酶ii启动子，例如但不限于巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、epstein-barr病毒(ebv)启动子、疱疹病毒启动子、腺病毒启动子、延伸因子-1(ef-1)α启动子、ubc启动子、pgk启动子、cagg启动子、腺病毒2或5晚期启动子、eif4a1启动子、cag启动子或cd68启动子。所述质粒进一步可包括其它真核调节序列，例如选自sv40、人生长激素(hgh)、牛生长激素(bgh或bgh)、mnd(一种合成的启动子，其含有用骨髓增殖性肉瘤病毒增强子修饰的momulv ltr的u3区)、鸡β-球蛋白和rbglob(兔球蛋白)基因的终止子和/或启动子，以控制治疗产物的表达。其它调节序列包括polya尾、土拨鼠肝炎病毒(whp)转录后调节元件(wpre)和乙型肝炎病毒转录后调控元件(hpre)。可以包括额外的调节元件，例如插入适当基因座中的细菌终止子，如本文所述，以减少或消除来自细菌启动子的通读。

183、编码的治疗产物包括本文和原始权利要求中描述的任何产物，例如编码是导致i型干扰素(ifn)表达的胞质dna/rna传感器途径的一部分的蛋白质的核酸，或其变体。i型干扰素包括干扰素-α和干扰素-β。变体包括当在受试者中表达时导致i型ifn组成型表达的那些。这些包括不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸来导致i型ifn表达的功能获得(gof)变体。这些蛋白质的示例是选自以下的蛋白质：sting，rig-i，mda-5，irf-3，irf-7，trim56，rip1，sec5，traf3，traf2，traf6，stat1，lgp2，ddx3，dhx9，ddx1，ddx9，ddx21，dhx15，dhx33，dhx36，ddx60和snrnp200，及其具有增加的活性或导致i型干扰素(ifn)组成型表达的变体。变体包括sting、rig-i、irf-3或mda5的变体，其中由于病毒感染而被磷酸化的一个或多个丝氨酸(s)或苏氨酸(t)残基被天冬氨酸(d)置换，由此产生的变体是组成型诱导i型ifn的磷酸模拟物，以及本领域技术人员已知和/或本文所述的任何变体。变体包括例如其中突变选自以下的那些变体：a)在sting中，参考seq id no:305-309，选自以下的一个或多个突变：s102p，v147l，v147m，n154s，v155m，g166e，c206y，g207e，s102p/f279l，f279l，r281q，r284g，r284s，r284m，r284k，r284t，r197a，d205a，r310a，r293a，t294a，e296a，r197a/d205a，s272a/q273a，r310a/e316a，e316a，e316n，e316q，s272a，r293a/t294a/e296a，d231a，r232a，k236a，q273a，s358a/e360a/s366a，d231a/r232a/k236a/r238a，s358a，e360a，s366a，r238a，r375a和s324a/s326a；b)在mda5中，参考seq id no:310，选自以下一个或多个突变：t331i，t331r，a489t，r822q，g821s，a946t，r337g，d393v，g495r，r720q，r779h，r779c，l372f和a452t；c)在rig-i中，参考seq id no:311，e373a和c268f之一或二者；及d)在irf-3中，参考seq id no:312，s396d，如含有参考seq id no:305-309选自以下一个或多个氨基酸置换的变体sting：s102p，v147l，v147m，n154s，v155m，g166e，c206y，g207e，s102p/f279l，f279l，r281q，r284g，r284s，r284m，r284k，r284t，r197a，d205a，r310a，r293a，t294a，e296a，r197a/d205a，s272a/q273a，r310a/e316a，e316a，e316n，e316q，s272a，r293a/t294a/e296a，d231a，r232a，k236a，q273a，s358a/e360a/s366a，d231a/r232a/k236a/r238a，s358a，e360a，s366a，r238a，r375a，n154s/r284g和s324a/s326a，及其保守置换，及其组合。

184、免疫刺激细菌还可以编码在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白。这些包括但不限于细胞因子、趋化因子或共刺激分子。这些的实例是选自以下一种或多种的蛋白质：il-2，il-7，il-12p70(il-12p40+il-12p35)，il-15，il-36γ，与il-2ra结合减弱的il-2，il-15/il-15rα链复合物，il-18，il-21，il-23，经过修饰而不与il-2ra结合的il-2，cxcl9，cxcl10，cxcl11，干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ，ccl3，ccl4，ccl5，参与或实现或增强t细胞募集和/或持续性的蛋白质，cd40，cd40配体(cd40l)，cd28，ox40，ox40配体(ox40l)，4-1bb，4-1bb配体(4-1bbl)，b7-cd28家族成员，cd47拮抗剂，抗il-6抗体或il-6结合诱饵受体，tgf-β多肽拮抗剂和肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族的成员。选自cd40，cd40配体，cd28，ox40，ox40配体，4-1bb和4-1bb配体的共刺激分子可以被截短，使得该分子缺乏在抗原呈递细胞(apc)上表达的胞质结构域(或其一部分)；并且截短的基因产物能够通过共刺激受体参与向t细胞发出组成型免疫刺激信号，并且由于缺失的胞质结构域或部分缺失或截短的胞质结构域而不能向抗原呈递细胞(apc)发出反调节信号，以消除免疫抑制反向信号传导。其它这种蛋白质是tgf-β多肽拮抗剂，例如抗tgf-β抗体或抗体片段，抗tgf-β受体抗体或抗体片段，可溶性tgf-β拮抗剂多肽或tgf-β结合诱饵受体。

185、质粒可以编码治疗性抗体或其抗原结合片段，例如fab、fab’、f(ab’)2、单链fv(scfv)、scfv-fc、fv、dsfv、纳米抗体(nanobody)、双特异抗体(diabody)片段或单链抗体。实例包括但不限于pd-1、pd-l1、ctla-4、vegf、vegfr2或il-6的拮抗剂。

186、在一些实施方案中，本文提供的免疫刺激细菌含有编码两种或更多种治疗性蛋白质的质粒，所述治疗性蛋白质选自：a)在肿瘤微环境中赋予或有助于抗肿瘤免疫反应的免疫刺激蛋白质；b)一种或多种蛋白质，其是导致i型干扰素(ifn)表达的胞质dna/rna传感器途径的一部分，或其具有增加的增加i型干扰素表达的活性的变体，或其导致i型ifn组成型表达的变体；和c)抗癌抗体或其抗原结合部分。例如，免疫刺激蛋白可以是共刺激分子，其是缺乏在抗原呈递细胞(apc)上表达的胞质结构域或其足够部分的分子，由此截短的共刺激分子能通过共刺激受体参与向t细胞发出组成型免疫刺激信号，并且不能向抗原呈递细胞(apc)发出反调节信号。在一些实施方案中，免疫刺激细菌编码至少两种治疗产物，所述治疗产物选自细胞因子、组成型诱导i型ifn的蛋白质、共刺激分子和抗癌抗体或其抗原结合部分，其可以在单个启动子的控制下。例如，编码至少两种或所有产物的核酸的表达在单个启动子的控制下，并且编码每种产物的核酸被编码2a多肽的核酸分开，由此在翻译时，每种产物单独表达。编码每种产物的核酸可以与编码指导所表达的产物从细胞中分泌的序列的核酸可操纵地连接。

187、提供了编码两种或更多种治疗产物的免疫刺激细菌，其中至少一种产物选自a)和至少一种产物选自b)，并且a)是il-2、il-7、il-12p70(il-12p40+il-12p35)、il-15、il-23、il-36γ、与il-2ra结合减弱的il-2、il-15/il-15rα链复合物、il-18、经修饰使其不与il-2ra结合的il2、cxcl9、cxcl10、cxcl11、干扰素-α、干扰素-β、ccl3、ccl4、ccl5、参与或影响或增强t细胞募集和/或持续性的蛋白质、cd40、cd40配体(cd40l)、ox40、ox40配体(ox40l)、4-1bb、4-1bb配体(4-1bbl)、b7-cd28家族成员、tgf-β多肽拮抗剂或肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员；以及b)是sting、rig-i、mda-5、irf-3、irf-5、irf-7、trim56、rip1、sec5、traf3、traf2、traf6、stat1、lgp2、ddx3、dhx9、ddx1、ddx9、ddx21、dhx15、dhx33、dhx36、ddx60或snrnp200。其还可以编码tgf-β抑制性抗体、tgf-β结合诱饵受体、抗il-6抗体和il-6结合诱饵受体中的一种或多种。

188、示例的编码的治疗产物的组合是以下治疗产物组合中的任何一种：il-2和il-12p70；il-2和il-21；il-2，il-12p70，和sting gof变体；il-2，il-21，和sting gof变体；il-2，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt，其中δcyt是缺失的胞质结构域，和具有截短的胞质结构域的4-1bbl(4-1bblcyt trunc))；il-2，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt，和具有截短的胞质结构域4-1bbl)；il-15/il-15rα，和sting gof变体；il-15/il-15rα，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyttrunc)；il-15/il-15rα和il-12p70；il-15/il-15rα和il-21；il-15/il-15rα，il-12p70，和sting gof变体；il-15/il-15rα，il-21，和sting gof变体；il-15/il-15rα，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；il-15/il-15rα，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；il-12p70和il-21；il-12p70，il-21，和sting gof变体；il-12p70，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；il-12p70和sting gof变体；il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；il-12p70和il-18；il-12p70，il-18，和stinggof变体；il-12p70，il-18，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyttrunc)；tgf-β诱饵受体，il-2，和il-12p70；tgf-β诱饵受体，il-2，和il-21；tgf-β诱饵受体，il-2，il-12p70，和sting gof变体；tgf-β诱饵受体，il-2，il-21，和sting gof变体；tgf-β诱饵受体，il-2，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyttrunc)；tgf-β诱饵受体，il-2，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；tgf-β诱饵受体，il-15/il-15rα，和sting gof变体；tgf-β诱饵受体，il-15/il-15rα，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；tgf-β诱饵受体，il-15/il-15rα，和il-12p70；tgf-β诱饵受体，il-15/il-15rα，和il-21；tgf-β诱饵受体，il-15/il-15rα，il-12p70，和sting gof变体；tgf-β诱饵受体，il-15/il-15rα，il-21，和sting gof变体；tgf-β诱饵受体，il-15/il-15rα，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；tgf-β诱饵受体，il-15/il-15rα，il-21，stinggof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；tgf-β诱饵受体，il-12p70，和il-21；tgf-β诱饵受体，il-12p70，il-21，和sting gof变体；tgf-β诱饵受体，il-12p70，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；tgf-β诱饵受体和il-12p70；tgf-β诱饵受体，il-12p70，和sting gof变体；tgf-β诱饵受体，il-12p70，stinggof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；tgf-β诱饵受体，il-12p70，和il-18；tgf-β诱饵受体，il-12p70，il-18，和sting gof变体；tgf-β诱饵受体，il-12p70，il-18，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；tgf-β诱饵受体和sting gof变体；抗-ctla-4抗体，il-2，和il-12p70；抗-ctla-4抗体，il-2，和il-21；抗-ctla-4抗体，il-2，il-12p70，和sting gof变体；抗-ctla-4抗体，il-2，il-21，和sting gof变体；抗-ctla-4抗体，il-2，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；抗-ctla-4抗体，il-2，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt)；抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，和sting gof变体；抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和具有截短的胞质结构域的4-1bbl)；抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，和il-12p70；抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，和il-21；抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，il-12p70，和sting gof变体；抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，il-21，和sting gof变体；抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；抗-ctla-4抗体，il-15/il-15rα，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；抗-ctla-4抗体，il-12p70，和il-21；抗-ctla-4抗体，il-12p70，il-21，和sting gof变体；抗-ctla-4抗体，il-12p70，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；抗-ctla-4抗体和il-12p70；抗-ctla-4抗体，il-12p70，和sting gof变体；抗-ctla-4抗体，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；抗-ctla-4抗体，il-12p70，和il-18；抗-ctla-4抗体，il-12p70，il-18，和sting gof变体；抗-ctla-4抗体，il-12p70，il-18，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；抗-ctla-4抗体和sting gof变体；cd40激动剂，il-2，和il-12p70；cd40激动剂，il-2和il-21；cd40激动剂，il-2，il-12p70，和sting gof变体；cd40激动剂，il-2，il-21，和sting gof变体；cd40激动剂，il-2，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyttrunc)；cd40激动剂，il-2，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；cd40激动剂，il-15/il-15rα，和sting gof变体；cd40激动剂，il-15/il-15rα，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；cd40激动剂，il-15/il-15rα，和il-12p70；cd40激动剂，il-15/il-15rα，和il-21；cd40激动剂，il-15/il-15rα，il-12p70，和sting gof变体；cd40激动剂，il-15/il-15rα，il-21，和sting gof变体；cd40激动剂，il-15/il-15rα，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；cd40激动剂，il-15/il-15rα，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；cd40激动剂，il-12p70，和il-21；cd40激动剂，il-12p70，il-21，和sting gof变体；cd40激动剂，il-12p70，il-21，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyt trunc)；cd40激动剂和il-12p70；cd40激动剂，il-12p70，和stinggof变体；cd40激动剂，il-12p70，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyttrunc)；cd40激动剂，il-12p70，和il-18；cd40激动剂，il-12p70，il-18，和sting gof变体；cd40激动剂，il-12p70，il-18，sting gof变体，和4-1bbl(包括4-1bblδcyt和4-1bblcyttrunc)；及cd40激动剂和sting gof变体。

189、在包括4-1bbl的所有组合中，4-1bbl分子可以是全长蛋白质(见例如，人和小鼠4-1bbl分别为seq id no:389和393)；具有胞质结构域缺失的4-1bbl变体(4-1bblδcyt；见例如，人和鼠4-1bblδcyt分别为seq id no:390和394)；具有截短(即未完全缺失)的胞质结构域的4-1bbl变体(4-1bblcyt trunc；见例如，人和小鼠4-1bblcyt trunc变体为seq idno:391-392和seq id no:395-396)；或具有修饰的胞质结构域的4-1bbl分子，其中作为磷酸化位点的一个或多个ser残基在适当的一个或多个基因座处被置换，例如对于人4-1bbl，参照seq id no:389，ser5和ser8用降低或消除反向信号传导的残基置换。此外，包括抗ctla-4抗体的所有组合均可以包括抗ctla-4抗体片段，例如抗ctla-4 scfv(见例如，对于人和小鼠抗ctla-4 scfv片段分别为seq id no:403和404)，或抗ctla-4 scfv-fc(见例如，人和小鼠抗ctla-4 scfv-fc片段分别为seq id no:402和405)。

190、还提供了修饰的非人干扰素基因刺激因子(sting)蛋白和sting蛋白嵌合体，以及递送载体，包括本文中描述的任何一种，药物组合物，编码或含有这些sting蛋白的细胞，及其治疗癌症的用途和方法。具体而言，本文提供的免疫刺激细菌编码如本文所述的修饰的非人sting蛋白、非人sting蛋白和嵌合体。这些由免疫刺激细菌编码的sting蛋白在本文中提供并在全文中进行了描述。本文提供的是：

191、1.修饰的非人sting蛋白，其中所述非人sting蛋白具有低于人sting蛋白的nf-κb活化活性，并且任选与野生型(wt)人sting蛋白相比具有较高的i型干扰素活化活性。这些非人sting蛋白经过修饰以包括一个或多个突变，由此其具有增加的活性，或在没有胞质核酸信号传导的情况下组成型起作用。所述突变通常是发生在人干扰素病中的氨基酸突变，例如上文针对人sting描述的那些突变。将相应的突变引入非人物种sting蛋白中，其中通过比对鉴定相应的氨基酸残基。此外，在一些实施方案中，sting蛋白的c末端尾区(ctt)中的traf6结合位点被缺失，从而降低了nf-κb信号传导活性。

192、2.修饰的sting蛋白，特别是人sting蛋白，其是嵌合体，其中来自一个物种例如人的sting蛋白中的ctt(c末端尾)区域被来自具有与人sting相比较低nf-κb信号传导活性和/或较高i型ifn信号传导活性的另一个物种的sting蛋白的ctt置换。此外，在这些嵌合体中任选缺失traf6结合位点。

193、3.上述2的修饰的sting蛋白也包括上述1的突变。

194、4.本文提供的或本领域技术人员已知的任何递送载体，例如免疫刺激细菌，包括例如外来体、纳米颗粒、微细胞、细胞、脂质体、溶酶体、溶瘤病毒和其它病毒载体，其编码上述1至3任一项的修饰的sting蛋白。

195、5.本文提供的或本领域技术人员已知的任何递送载体，例如免疫刺激细菌，包括例如外来体、纳米颗粒、微细胞、细胞、脂质体、溶酶体、溶瘤病毒和其它病毒载体，其编码来自非人物种的未经修饰的sting，所述非人物种sting蛋白与人sting相比具有降低的nf-κb信号传导活性降低并且任选与人sting相比具有增加的i型干扰素刺激/信号传导活性。

196、6.细胞(如果是人的话，不是受精卵)，例如用于细胞治疗的细胞，例如t细胞和干细胞，以及用于产生上述1至3任一项的sting蛋白的细胞。

197、7.药物组合物，其含有上述1至3任一项的sting蛋白，或4和5的递送载体，或6的细胞。

198、8.通过施用上述1至7任一项治疗癌症的用途和方法，如本文针对免疫刺激细菌所述。

199、本文描述了评估sting的nf-κb活性(信号传导活性)和i型干扰素刺激活性或干扰素-β刺激活性的测定法和方法，并且也是本领域技术人员已知的方法。方法包括例如在deoliveira mann et al.(2019)cell reports 27:1165-1175中描述的方法，其中特别描述了来自不同物种包括人的sting蛋白的干扰素-β和nf-κb信号传导活性，从而鉴定了来自不同物种的具有低于人sting的nf-κb活性的sting蛋白，以及具有相当于或高于人sting的干扰素-β活性的那些sting蛋白。de oliveira mann et al.(2019)提供了每种物种中sting的物种比对和鉴定域，包括ctt域(另见de oliveira mann et al.(2019)的补充信息)。

200、非人sting蛋白可以是但不限于来自以下物种的sting蛋白：袋獾(sarcophilusharrisii；seq id no:349)，狨猴(callithrix jacchus；seq id no:359)，牛(bos taurus；seq id no:360)，猫(felis catus；seq id no:356)，鸵鸟(struthio camelus australis；seq id no:361)，朱鹮(nipponia nippon；seq id no:362)，腔棘鱼(latimeriachalumnae；seq id no:363-364)、野猪(sus scrofa；seq id no:365)、蝙蝠(rousettusaegyptiacus；seq id no:366)、海牛(trichechus manatus latirostris；seq id no:367)、鬼鲨(callorhinchus milii；seq id no:368)，和小鼠(mus musculus；seq id no:369)。这些脊椎动物sting蛋白很容易激活人体细胞中的免疫信号传导，表明sting信号传导的分子机制在脊椎动物中是共有的(见de oliveira mann et al.(2019)cell reports27:1165-1175)。

201、本文示出凭借感染骨髓细胞例如肿瘤驻留和组织驻留巨噬细胞的能力，并在至少有限的时间内保持活力，和/或递送质粒(所述质粒编码导致i型ifn表达的治疗产物和/或其它免疫刺激产物，例如不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸以使i型ifn表达的功能获得(gof)变体)，本文提供的免疫刺激细菌可以将具有m2表型的巨噬细胞转化为m1或m1样以及免疫抑制特性降低或消除、而免疫刺激、抗肿瘤或抗病毒特性增强或增加的巨噬细胞。提供了含有编码治疗产物的质粒的免疫刺激细菌，其中所述细菌对巨噬细胞、包括人巨噬细胞的感染，将m2巨噬细胞转化为m1表型或m1样表型巨噬细胞。提供了含有编码治疗产物的质粒的免疫刺激细菌，所述治疗产物在巨噬细胞中的表达导致m2巨噬细胞例如人m2巨噬细胞转化或转化为m1或m1样表型。具有这种特性的免疫刺激细菌包括本文提供的任何细菌，其含有导致肿瘤驻留(在患有癌症的受试者中)和组织驻留骨髓细胞感染的基因组修饰。这些基因组修饰包括导致细菌不具有鞭毛的那些修饰，其中野生型细菌有鞭毛，以及其它修饰，例如导致细菌是pagp-/msbb-的那些修饰。其它修饰包括导致天冬酰胺酶活性消除的修饰，例如在感染骨髓细胞的细菌中产生ansb-细菌的修饰，从而增强t细胞活性，以及改变脂多糖(lps)的其它修饰。

202、包括在巨噬细胞中编码治疗产物的免疫刺激细菌，所述治疗产物促进或导致m2巨噬细胞的转化，或将m2巨噬细胞转化为m1或m1样表型。示例的治疗产物是导致i型干扰素(ifn)表达、特别是组成型表达的胞质dna/rna传感器途径的一部分的那些。这包括治疗产物的功能获得(gof)变体，其是胞质dna/rna传感器途径的一部分，并且不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环二核苷酸来导致i型ifn的表达，例如本文描述和提供的变体和非人sting蛋白。免疫刺激细菌包括可以如本文所述进行修饰的任何细菌，包括本文列出的物种，例如沙门氏菌物种和菌株。

203、还提供了免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物例如蛋白质与赋予改善的药理学性质如药代动力学或药效学性质例如增加的血清半衰期的部分连接。因此，提供了免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物包含fc结构域或半衰期延长部分，例如人血清白蛋白或其一部分。半衰期延长方式或方法包括例如peg化，糖基化修饰，唾液酸化，pasylation(用长度约为100-200个残基的pas氨基酸的聚合物进行修饰)，elpylation(见例如floss et al.(2010)trends biotechnol.28(1):37-45)，hapylation(用甘氨酸均聚物修饰)，与人血清白蛋白融合，与glk融合，与ctp融合，glp融合，与人免疫球蛋白(igg)的恒定片段(fc)结构域融合，与转铁蛋白融合，与非结构化多肽融合，例如xten(也称为rpeg，其是含有a、e、g、p、s和t的非精确重复肽序列的基因融合；见例如schellenberger et al.(2009)nat.biotechnol.27(12):1186-1190)，以及增加尺寸、增加流体动力学半径、改变电荷或靶向受体以再循环而不是清除以及这种修饰的组合等其它这种修饰和融合。

204、还提供了免疫刺激细菌，其中编码的治疗产物包含b7蛋白跨膜结构域，或其中治疗产物通过内源的或添加的gpi锚而是gpi锚定的。编码的治疗产物可包含与胶原蛋白的融合物。

205、任何和所有实施方案中的免疫刺激细菌可以是任何合适的物种。在提及特定基因和基因修饰的情况下，所述基因和修饰是对应于作为示例物种的沙门氏菌所提及的基因和修饰的那些基因和修饰。物种和菌株包括例如以下物种的菌株：立克次体属(rickettsia)，克雷伯氏菌属(klebsiella)，博德特氏菌属(bordetella)，奈瑟菌属(neisseria)，气单胞菌属(aeromonas)，弗朗西斯氏菌属(francisella)，棒状杆菌属(corynebacterium)，柠檬酸杆菌属(citrobacter)，衣原体属(chlamydia)，嗜血杆菌属(haemophilus)，布鲁氏菌属(brucella)，分枝杆菌属(mycobacterium)，支原体属(mycoplasma)，军团菌属(legionella)，红球菌属(rhodococcus)，假单胞菌属(pseudomonas)，螺杆菌属(helicobacter)，弧菌属(vibrio)，芽孢杆菌属(bacillus)，和丹毒丝菌属(erysipelothrix)。例如立克次氏体立克次体(rickettsia rickettsiae)，普氏立克次氏体(rickettsia prowazekii)，恙虫立克次体(rickettsia tsutsugamuchi)，莫塞氏立克次氏体(rickettsia mooseri)，西伯利亚立克次体(rickettsia sibirica)，支气管炎博德特菌(bordetella bronchiseptica)，脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)，淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)，嗜泉气单胞菌(aeromonas eucrenophila)，杀鲑气单胞菌(aeromonas salmonicida)，土拉弗朗西斯氏菌(francisella tularensis)，假结核棒状杆菌(corynebacterium pseudotuberculosis)，弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)，肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae)，睡眠嗜血杆菌(haemophilus somnus)，流产布鲁氏菌(brucella abortus)，胞内分枝杆菌(mycobacterium intracellulare)，嗜肺军团菌(legionella pneumophila)，马红球菌(rhodococcus equi)，铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，鼬鼠螺杆菌(helicobacter mustelae)，霍乱弧菌(vibrio cholerae)，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)，小肠结肠炎耶尔森杆菌(yersinia enterocolitica)，五日热罗卡利马氏体菌(rochalimaeaquintana)或根癌农杆菌(agrobacterium tumerfacium)。

206、通过本文所述的修饰，可以使细菌减毒，或使其具有低毒性或无毒。示例的细菌是沙门氏菌种，例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)菌株。本文提供的免疫刺激细菌包括内源性编码和表达或被修饰以编码和表达编码补体杀伤抗性(rck)基因例如沙门氏菌rck基因的那些免疫刺激细菌。治疗性大肠杆菌经过修饰以编码rck，由此其可以全身施用。如本文所述并且如权利要求中所述，还提供了治疗癌症、特别是人癌症的递送载体、细胞、药物组合物、方法、用途和治疗。还提供了伴随诊断和选择治疗对象的方法，以及监测治疗的方法。这些在下文以及权利要求中进行了描述，这些权利要求全部并入本节中。