使用体外细胞培养生产肉类的方法与流程

1.本发明的实施例涉及使用体外细胞培养生产肉类的改良方法。
2.背景
3.动物肉蛋白质含量高，足够提供构建用于支持身体所需蛋白质的所有氨基酸。传统食用肉是从农场饲养的动物或鱼类中获取的。然而，农业和水产养殖业消耗大量的能源和资源，其碳足印亦高。农业或水产养殖生产的肉类亦会对公共健康造成威胁，因为肉类可能在生产过程中接触到致病原、污染物和毒素。人口增长、肉类需求增加、环境问题、土地和水资源有限、生物多样性丧失以及反对动物屠宰等一系列问题促使科学家开发出替代生产肉类的技术。
4.体外细胞培养肉生产是指利用细胞培养技术在实验室中培养动物肌肉组织或器官组织以制造肉类和肉制品的过程。如本文所述，体外细胞培养肉和肉制品包括动物蛋白制品以及可溶性和固体的非肉制品。虽然体外细胞培养肉和肉制品仍处于早期开发阶段，但与传统肉类生产相比，体外细胞培养肉和肉制品具有更多优势，例如健康和环境上的优势，以及对动物的好处。体外细胞培养肉和肉制品是下一代新兴技术，属于比细胞农业或从细胞培养制造农产品更广阔的领域。
5.从动物活检中获取的细胞(例如肌肉细胞、体细胞、干细胞等)可以作为用于生产体外细胞培养肉的细胞，这些细胞被放在生物反应器或其他无菌环境的培养基中独立于动物活体生长。细胞可以通过在生物反应器中的可食用三维支架上，模仿动物器官生长成半固体或固体。起始细胞可以是直接从动物组织中获得的原代细胞，也可以是连续细胞系。如果在适当的培养基中生长，原代细胞将根据其细胞脱氧核糖核酸末端端粒的长度所限的次数生长和增殖。而连续细胞系则可以在体外长期培养。细胞生物学端粒研究已经能够将原代细胞转化为不朽的连续细胞系。通过利用病毒癌基因、化学处理或端粒酶逆转录酶的过度表达，我们可以将原代细胞转化为连续的细胞系，以防止端粒缩短。
6.培养基含有细胞增殖所需的成分，如氨基酸、盐、维生素、生长因子和缓冲系统，以控制ph值。目前的方法是向培养基中添加胎牛血清(fbs)，以提供重要的大分子、生长因子和免疫分子。然而，胎牛血清来自未出生的小牛不符合不含动物产品的指标。因此从事生产体外细胞培养肉研究的科学家认为在无动物成分的培养基中培养细胞是的一个重要的因素。而某些生长因子可能来自于人类。
7.目前的体外细胞培养肉生产涵盖大多数商品肉类种类，例如基于细胞的牛肉、猪肉和家禽肉类。然而，这些肉类具有复杂的组织结构和涉及多种细胞，当前的生物医学技术难以生产这些肉类，成本也很高。此外体外细胞培养肉生产还缺乏提高肉类蛋白质水平和生物产量的非转基因方法。如上所述，当前的细胞培养技术仍然依赖动物成分(如胎牛血清)作为营养源，以及昂贵的非食品级生长因子。
8.本发明提供可供人类食用的体外细胞培养肉类的生产方法，为上述挑战提供解决方案。
9.概要
10.根据本发明的一个实施例，体外细胞培养生产肉类的方法包括从动物或植物来源分离组织，并制备细胞悬浮液。该方法还包括在培养基中的食品级支架上增长细胞，使细胞模拟动物器官生长成固体或半固体结构。此外，该方法还包括通过调节蛋白质表达的一个或多个微核糖核酸的水平来增加增长细胞中蛋白质的表达。
11.根据发明的另外一个实施例，通过体外细胞培养生产肉类的方法包括从植物或动物源中分离组织，制备细胞悬浮液，并在培养基中的食品级支架上增长细胞，以使细胞生长成模拟动物器官的固体或半固体结构。该方法还将细胞与生物工程细胞一同培养。生物工程细胞会分泌营养物质、生长因子和细胞因子，以支持细胞生长。
12.本发明的实施例应用了供人类食用的体外细胞培养肉类生产方法，为上述挑战提供了解决方案。
13.附图简要说明
14.为更好地理解本发明，可以参考详细说明并结合附图一并考虑。图中的组件不一定按比例缩放，而是强调解说本发明背后的原理。
15.图1是根据本发明一个实施例的通过体外细胞培养进行肉类生产的方法的流程图。
16.图2是根据本发明一个实施例用于增强转录后蛋白质表达的方法的示意图。
17.图3是根据本发明一个实施例用于增强转录后表达胶原1型α1(col1a1)的方法的示意图。
18.图4是根据本发明一个实施例用于增强转录后表达胶原1型α2(col1a2)的方法的示意图。
19.图5是根据本发明一个实施例，用于体外细胞培养肉类生产的具有固相生物反应器的示意图或概念横截面图。
20.图6是根据本发明的一个与图5类似的实施例，但具有第二固相的生物反应器的示意图或概念横截面图。
21.图7是根据一个实施例的阴性对照微核糖核酸、微核糖核酸132抑制剂(mir-132抑制剂)、微核糖核酸133(mir-133抑制剂)和微核糖核酸21模拟物(mir-21模拟物)转染后24小时酵母碳源基础(ycb)细胞中col1a1信使核糖核酸表达的数据图示。
22.图8是根据一个实施例的关于阴性对照微核糖核酸、mir-132抑制剂、mir-133抑制剂和mir-21模拟物转染后24小时酵母碳源基础细胞中col1a2信使核糖核酸表达的数据的图形表示。
23.图9a是mir-21模拟物转染酵母碳源基础细胞72小时后col1a1表达的色谱图。图9b是根据一个实施例的关于mir-21模拟物转染后72小时col1a1在酵母碳源基础细胞中的表达的数据的图形表示。
24.图10a是阴性对照微核糖核酸、mir-21模拟物、mir-132抑制剂和mir-133抑制剂转染酵母碳源基础细胞72小时后结缔组织生长因子(ctgf)表达的色谱图。图10b是关于根据一个实施例的阴性对照微核糖核酸、mir-21模拟物、mir-132抑制剂和mir-133抑制剂转染后72小时在酵母碳源基础细胞中表达结缔组织生长因子的数据的图形表示。
25.图11是根据一个实施例阴性对照微核糖核酸和mir-21模拟物转染后24小时293细胞中col1a1信使核糖核酸表达的图示。*p《0.05与对照微核糖核酸相比。
26.详细说明
27.图1显示用于生产体外细胞培养肉的方法10。如本文所述，“体外细胞培养肉生产”是指基于细胞的肉类生产过程或基于细胞的农业过程，其中来自动物和/或植物的组织在实验室中使用细胞培养技术增长以制造肉类和肉类产品。在区块12，组织从动物或植物中分离。在一个实施例中，该组织源自硬骨鱼纲的骨性鱼，包括咸水鱼，例如石斑鱼、鲈鱼或黄鱼。在其他实施例中，其他类型的动物组织也可以被分离，例如牛组织。在一些实施例中，区块12可从鱼收集器官组织，例如鱼鳔，并制备细胞悬浮液。尽管以下描述主要源自鱼类的组织，但这些概念可应用于源自其他动物和/或植物的组织，以提供其他类型的体外细胞培养肉和/或动物蛋白产品，以及素食肉和/或蛋白产品。
28.许多分离的细胞是成体细胞，可以使用医学研究中已建立的各种方法使其持续增殖(区块14)。例如，特定基因，如山中(yamanaka)因子，可用于将成年细胞重新编程为干细胞，如诱导多能干细胞(ipsc)。作为替代选择，分离的成年细胞可以通过端粒酶逆转录酶的过度表达转化为连续的细胞系。在其他实施例中，可分离其他类型的细胞，例如成体干细胞和胚胎干细胞。在这方面，应当理解，本发明的方法包括细胞系的所有来源。
29.在下一个区块16中，通过在无菌室或容器(如生物反应器)中附着/粘附食品级生物兼容性支架，将细胞生长为模拟动物器官(如鱼器官)的固体或半固体结构。无菌室或容器可进行温度控制，并可具有入口和出口，用于引入和移除化学品、营养素和细胞等物质。食品级生物兼容性支架最终成为食用产品的一部分，由基于植物或基于真菌的材料制成，例如但不限于琼脂糖、海藻酸钠、壳聚糖、菌丝体和魔芋葡甘聚糖。海藻酸钠是一种从褐藻中自然提取的生物聚合物，具有生物兼容性。此外，从真菌中提取的植物基壳聚糖具有抗菌性能。在一些实施例中，区块16在没有抗生素或抗菌化合物的无菌容器中进行。区块18涉及向生物反应器提供培养基以支持细胞存活和生长。培养基可以是含有不同成分的缓冲溶液,所述成分包括但不限于无机盐(例如氯化钙(cacl2)、氯化钾(kcl)、氯化钠(nacl)、碳酸氢钠(nahco3)、磷酸二氢钠(nah2po4)、硫酸镁(mgso4)等)、氨基酸、维生素(例如硫胺素、核黄素、叶酸等)，和其他成分如葡萄糖，-巯基乙醇、乙二胺四乙酸(edta)和丙酮酸钠。生长培养基的非限制性示例包括但不限于莱柏维兹的l-15(leibovitz’s l-15)培养基、eagle’s培养基(mem)、培养基199、杜尔贝科的改良eagle培养基(dmem)、ham’s f12营养混合液、ham’s f10营养混合液、maccoy’s 5a培养基、glasgow改良eagle培养基(gmem)、iscove’s改良dulbecco培养基和rpmi 1640。
30.根据区块20，将食品级生长因子和细胞因子引入生物反应器中的培养基中能够支持细胞生长和增殖。生长因子和细胞因子可包括但不限于胰岛素生长因子1(igf-1)、胰岛素、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素6受体(il-6r)、白细胞介素11(il-11)、成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮生长因子(egf)和转铁蛋白。区块20可涉及在没有胎牛血清(fbs)的情况下将生物工程细胞与分离细胞共同培养。生物工程细胞被改造以分泌上述生长因子和细胞因子，并根据生长和增殖的需要向分离细胞提供这些生物分子。如本文所述，“生物工程”细胞并不等同于转基因细胞。生物工程细胞有一个特定的基因，该基因过度表达一种或多种特定的蛋白质。生物工程细胞可以是鱼细胞，也可以是其他类型的动物细胞，如牛细胞。生物工程细胞不存在于最终的肉制品中。作为非限制性示例，生物工程鱼细胞可与分离的鱼细胞共同培养，或生物工程牛细胞可与分离的牛细胞共同培养。本发明的共同培养方法消
除了培养基中对动物源性胎牛血清(fbs)的需要。此外，该共同培养方法为原位生长的细胞持续提供食品级特异性生长因子和细胞因子，并简化和降低生产过程的成本。然而，在其他实施例中，来自重组源的胎牛血清、其他血清或蛋白质可用于提供生长因子、细胞因子和其他营养素，以支持进行区块16期间的细胞生长。
31.此外，根据区块22，细胞中的蛋白质表达被增加以提高所得肉制品中的生物量产量。如本文所用，“生物量产量”是指所得肉制品中可消化物质(例如蛋白质)的量，该物质在消耗后可用于能源生产。更具体地说，区块22涉及通过改变细胞中的微核糖核酸水平来增加蛋白质表达，并在培养之前对细胞进行操纵。微核糖核酸是一种内源性的、短的、非编码的单链核糖核酸序列，涉及调节转录后基因的表达。区块22涉及通过促进信使核糖核酸(mrna)翻译增加蛋白表达的上调微核糖核酸的数量，和/或通过抑制信使核糖核酸翻译减少蛋白表达的下调微核糖核酸的数量。通过向细胞中引入微核糖核酸、微核糖核酸模拟物或微核糖核酸抑制剂，可以增加或减少微核糖核酸水平。微核糖核酸模拟物具有与微核糖核酸相同的功能，但在调节蛋白质表达方面可能更稳定和有效。在一些实施例中，电穿孔法可用于将游离型载体引入执行表达特定微核糖核酸指令的细胞。作为替代选择，或与此相互结合，腺相关病毒可以用作携带游离型指令的载体，以表达特定的微核糖核酸。通过转染将目标微核糖核酸抑制剂引入细胞，可以减少目标下调微核糖核酸的数量。要注意的是，根据本发明增加蛋白质表达/生物量产量的方法是在不修改细胞基因组的情况下进行的。
32.图2概要性地描绘了细胞系中增强转录后蛋白质表达的方法。可以增加一个或多个上调微核糖核酸(mirna)，以增加所选蛋白质的信使核糖核酸翻译和蛋白质生产。作为替代选择，或与此相互结合，一个或多个下调微核糖核酸可被抑制剂(抗微核糖核酸)阻断，以增加所选蛋白质的信使核糖核酸翻译和蛋白质生产。
33.鱼鳔主要包括成纤维细胞和胶原蛋白。i型胶原(胶原蛋白i)是鱼鳔中的主要蛋白质，增加培养的鱼鳔细胞中i型胶原的表达可能会提高生物产量。鱼鳔细胞中的i型胶原包括胶原1型α1(col1a1)和胶原1型α2(col1a2)。col1a1和col1a2的表达通过上调微核糖核酸21(mir-21)而增加，因此提高上调微核糖核酸21的水平可提高鱼游泳膀胱细胞中胶原1型α1和胶原1型α2的生成。此外，下调微核糖核酸133(mir-133)可降低胶原1型α1和胶原1型α2的表达，因此降低下调微核糖核酸133的水平或阻断下调微核糖核酸133的作用可提高鱼游泳膀胱细胞中胶原1型α1和胶原1型α2的生成。图3-4显示通过提高上调微核糖核酸21水平和通过使用抑制剂(抗mir 133)阻断下调微核糖核酸133的作用来提高胶原1型α1(图3)和胶原1型α2(图4)的生成。胶原1型α1和胶原1型α2产量的增加使肉制品的产量增加。类似的策略可用于提高其他类型动物细胞中的相关蛋白质水平。
34.图5显示用于培养分离细胞的示例性生物反应器30。细胞附着在由食品级支架34提供的固相支架32上并在其上生长，该支架34固定在生物反应器30的无菌室36中。支架34可以决定肉制品的形状。食品级支架34由基于植物或基于真菌的材料制成，例如但不限于琼脂糖、海藻酸钠、壳聚糖、菌丝体和魔芋葡甘聚糖。固相支架32可以是多孔的，以便细胞可以附着支架32的内表面并在其上生长。向细胞提供营养的培养基通过入口38引入生物反应器30，并通过出口40从生物反应器30中排空。
35.图6所示的生物反应器50类似于图5的生物反应器30，不同的是生物反应器50还包括第二固相52，而第二固相52通过细网54与固相支架32分隔开。第二固相52可包含或支持
生物工程细胞，该生物工程细胞会在其原本位置为固相支架32上生长的细胞分泌营养素、生长因子和细胞因子，并可将生物工程细胞与固相支架32上的细胞分离。第二固相52由基于植物的材料制成，类似于固相支架32。营养物质、生长因子和细胞因子可渗透网54，细胞则不能渗透网54。图6的生物反应器50允许生物工程细胞与生长细胞共同培养。在某些实施例中，图5和6可以串联布置。在其他实施例中，多个生物反应器30可以与多个生物反应器50或生物反应器30和50的混合串联布置，以扩大规模。生物反应器30可主要用于生物质生产，而生物反应器50则可用于向生长细胞提供营养、生长因子和细胞因子。
36.本发明的体外细胞培养肉生产方法提供了具有单个细胞类型的简单组织的肉制品。与其他具有多个细胞类型的养殖肉类相比，具有单个细胞类型的肉类产品更容易制造、开发和商业化。本发明的其他实施例提供了具有多个细胞类型的肉制品。此外，申请人发现一种通过改变生长细胞中的微核糖核酸水平或活性来增加生物质/蛋白质生产的方法。例如，两个关键的微核糖核酸(上调微核糖核酸21和下调微核糖核酸133)被用于提高鱼类游泳膀胱细胞中的主要蛋白质(胶原蛋白i)的水平。据申请人所知，改变微核糖核酸水平或活性以提高养殖肉制品中蛋白质/生物量产量的做法尚未被其他人用于开发养殖肉制品此领域。与已知的基因敲入或敲除方法相比，将目标放在微核糖核酸以增加蛋白质产量可能会对细胞造成更少的压力。生物工程细胞将会与生长中的动物细胞共同培养，为生长中的鱼类细胞提供用于原位细胞生长和增殖的食物级生长因子和细胞因子，减少或消除培养基中对源自于动物的胎牛血清需求。共同培养技术亦能够简化生产过程和降低生产成本。
37.此外，养殖肉制品中的营养素可以被定制成更健康的食品。例如，养殖肉制品可根据营养师以至个人基因测试的饮食建议来定制。在特定条件下培养细胞可以丰富肉制品中的高密度胆固醇、多不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸等健康营养素。作为替代选择，或与此相互结合，通过在特定条件下培养细胞来减少已知对健康有害的营养素，如低密度胆固醇和饱和脂肪酸。微量营养素，如维生素和矿物质，也可能得到加强。养殖肉制品的营养定制可通过各种方式取得，例如但不限于：1)在细胞培养过程中调整喂给生长细胞的营养，和/或2)控制带有不同细胞的分层支架的比例。
38.养殖食品的生产是在清洁、无菌和高度控制的过程中进行的。因此，食品中的营养素被微生物(如细菌或真菌)降解这不希望发生的情形会被最小化。因分解营养物质而产生的不良味道和气味亦会被最小化。这种特性使养殖食品在烹饪中有新的用途，并有助于创造出新的食谱。养殖食品的一个例子是从鱼鳔中提取的养殖鱼肚。传统鱼肚中的胺由于在生产过程中被细菌降解而产生不良的鱼腥味和气味。这种不受欢迎的特性限制食物的用途，导致鱼肚只能用于热食或暖食的菜肴。采用细胞培养技术生产的养殖鱼肚没有令人讨厌的鱼腥味和气味。除了热菜外，养殖鱼肚还可以用于甜品或在冷冻或室温下食用的即食菜。
39.例子一
40.使用微核糖核酸模拟物和抑制剂改善蛋白质表达
41.根据一个实施例，本例子阐述使用微核糖核酸和抑制剂改善胶原1型α1(col1a1)和胶原1型α2(col1a2)表达的策略。
42.本文中的“抑制剂”可以是微核糖核酸抑制剂,即是一些小的单链核糖核酸分子、它们被设计用于特异性结合和抑制内源性微核糖核酸分子，并通过下调微核糖核酸活性以
实现微核糖核酸竹的功能性分析。
43.材料和方法
44.试剂
45.以下试剂从赛默飞世尔科技公司获得：含glutamax
tm
的dmem/f12、胎牛血清(fbs)、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸、lipofectamine
tm 3000、阴性对照微核糖核酸(mirvana
tm
微核糖核酸模拟物，阴性对照#1；赛默飞世尔科技公司，目录号#4464058)，微核糖核酸21模拟物(mirbase登录号：mi0033728；序列号：1；mir-21模拟物)，微核糖核酸132抑制剂(mirbase登录号：mi0000449；序列号：2；mir-132抑制剂)，微核糖核酸133抑制剂(mirbase登录号：mi0000822；序列号：3；mir-133抑制剂)，rnalater
tm
溶液，purelink
tm
核糖核酸微型试剂盒，purelink
tm
脱氧核糖核酸酶组，和powerup
tm sybr
tm green mastermix试剂盒。m-mulvrt(核糖核酸酶h)互补脱氧核糖核酸合成试剂盒是购自依科赛生物有限公司。
46.如本文所用，“微核糖核酸21模拟物”具有与“微核糖核酸21”相同的核糖核酸序列。
47.细胞
48.黄鱼鱼鳔(酵母碳源基础)细胞系是自家培养的。293细胞从美国标准生物品收藏中心获得。在加湿培养箱(2-10％的二氧化碳，优选5％的二氧化碳；约90-98％空气，优选95％空气；温度约24-37℃，优选34℃)中使用完整培养基(dmem/f12，约2-20％胎牛血清，优选10％胎牛血清)维持两个细胞系。它们通常以1比2至1比10的分割比进行继代培养。分割比优选为1比4。
49.转染
50.按照制造商(赛默飞世尔科技公司)的操作程序，用lipofectamine
tm 3000将细胞转染阴性对照微核糖核酸、微核糖核酸21模拟物、微核糖核酸132抑制剂和微核糖核酸133抑制剂。再用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸分离细胞(当细胞汇合时约80％)。在约0.2至1.0毫升、优选0.5毫升的完整培养基中，以约1-10x105/24孔、优选约5x105/24孔(酵母碳源基础细胞)或约1-10x105/24孔、优选约6.5x105/24孔(293细胞)将它们接种。紧接着，将约0.01至0.10nmol、优选约0.06nmol的微核糖核酸与约0.5至5微升、优选约1.5微升的lipofectamine
tm 3000试剂在约50至300微升、优选约100微升的dmem/f12中混合。将混合物在室温(约20℃至26℃，优选约24℃)下培养约5至30分钟，优选约10分钟，以形成复合物，并逐滴添加至孔内的不同区域，以达到50至300μm，优选100μm的最终微核糖核酸浓度。将细胞放回培养箱，并在约18至36小时之间，优选在24小时左右，分析目标基因的表达。
51.总核糖核酸提取和反转录
52.在转染后大约18至36小时，优选在大约24小时，移除培养基，并向孔中添加rnalater
tm
溶液以保存核糖核酸，并将平板储存在大约4至10℃，优选大约4℃。为了提取总核糖核酸，根据制造商(赛默飞世尔科技公司)的操作程序，去除rnalater
tm
溶液，并使用purelink
tm
核糖核酸迷你试剂盒纯化核糖核酸，使用purelink
tm
脱氧核糖核酸酶组进行柱上脱氧核糖核酸酶处理和使用nanodrop
tm 2000c测量样本中的核糖核酸浓度。根据制造商(依科赛生物有限公司)的操作程序，使用m-mulvrt(核糖核酸酶h)互补脱氧核糖核酸合成试剂盒和oligo(dt)引物将约0.5至5微克核糖核酸、优选约2微克核糖核酸(293细胞)或约0.5微克核糖核酸(酵母碳源基础细胞)反向转录为互补脱氧核糖核酸。
53.实时pcr
54.通过罗氏lc480聚合酶连锁反应仪(罗氏诊断)分析胶原1型α1和胶原1型α2的表达。将cdna样品与约0.1至0.8μm，优选约0.4μm，的基因特异性引物(表1)和powerup
tm sybr
tm green mastermix混合。扩增程序如下：(a)在约45至55℃放置约1至10分钟，最好约50℃放置约2分钟；(b)在约90至98℃放置约1至5分钟，优选约95℃放置约2分钟；(c)约35至45次循环，优选40次循环(每个循环可包括以下步骤：(i)在约90至98℃放置约10至30秒，优选95℃放置约15秒；(ii)约50至60℃放置约10至30秒，优选55℃放置约15秒；和(iii)约66至74℃放置约15至60秒，优选72℃放置约30秒)；(iv)熔融曲线分析(包括以下步骤：(1)约90至98℃约10至30秒，优选约95℃约15秒；(2)约55至65℃约0.5至3分钟，优选约60℃约1分钟)；(3)升温速率：约每秒0.05至0.3℃，直至达到约90至98℃，最好约每秒0.15℃，直至达到约95℃；以及(4)在升温期间捕获信号)。通过(a)扩增子经熔融曲线分析后显示单峰，(b)聚合酶连锁反应产物凝经胶电泳分析后观察到大小正确的单一条带，(c)扩增效率约为90-110％；误差《约0.01至0.1确认聚合酶连锁反应的有效性。通过pfaffl方法确定每个样本中目标基因的表达，并通过管家基因ef1α的表达进行正规化。样品a中相对于样品b的相对基因表达以方程式(1)计算。
[0055][0056]
表1
[0057][0058][0059]
统计分析
[0060]
所有结果均以平均值
±
平均值标准误差表示。使用graphpad prism 5.0进行统计分析。对于酵母碳源基础细胞的基因表达数据，数据通过单因素方差分析进行分析，如果显着，则进行图基事后检定法。对于293细胞的数据，数据通过司徒顿t检定法进行分析。如果p值小于0.05，则认为结果有统计学差异。
[0061]
结果
[0062]
在本例中，我们用阴性对照微核糖核酸、微核糖核酸21模拟物、微核糖核酸132抑制剂或微核糖核酸133抑制剂转染酵母碳源基础细胞。然后，我们通过qpcr定量转染后约24小时两种不同类型的胶原,胶原1型α1和胶原1型α2,的信使核糖核酸表达。我们发现，与阴性对照微核糖核酸转染相比，微核糖核酸21模拟物或微核糖核酸133抑制剂转染增加了胶原1型α1(图7)和胶原1型α2(图8)信使核糖核酸表达。
[0063]
如图7所示，在微核糖核酸21模拟物和微核糖核酸133抑制剂转染后24小时，胶原1型α1的信使核糖核酸表达分别约为对照的1.5倍和1.5倍。在阴性对照微核糖核酸和微核糖核酸132抑制剂转染后约24小时，胶原1型α1的信使核糖核酸表达分别约为对照的1倍和1倍。
[0064]
如图8所示，在微核糖核酸21模拟物和微核糖核酸133抑制剂转染后24小时，胶原1型α2的信使核糖核酸表达分别约为对照的1.4倍和1.4倍。在阴性对照微核糖核酸和微核糖核酸132抑制剂转染后约24小时，胶原1型α2的信使核糖核酸表达分别约为对照的1倍和0.9倍。
[0065]
因此，它表明转染微核糖核酸21模拟物/微核糖核酸21或微核糖核酸133抑制剂可增加酵母碳源基础细胞中的胶原信使核糖核酸表达。
[0066]
现在转到图9a和9b，在微核糖核酸21模拟物转染后约72小时，胶原1型α1的蛋白表达增加，胶原1型α1蛋白的相对表达约为1.2。阴性对照微核糖核酸转染72小时后，胶原1型α1的相对表达约为1。
[0067]
现在转到图10a和10b，在微核糖核酸21模拟物和微核糖核酸132抑制剂转染后约72小时，结缔组织生长因子的蛋白表达增加，胶原1型α1的相对表达分别约为1.4和1.6。在阴性对照微核糖核酸和微核糖核酸133抑制剂转染后约72小时，结缔组织生长因子的相对表达分别约为1及1。
[0068]
这个例子表明，微核糖核酸可以控制鱼鳔细胞(即酵母碳源基础细胞)中的胶原蛋白表达。
[0069]
转染微核糖核酸21模拟物也增加了293细胞中的胶原信使核糖核酸表达。我们将微核糖核酸21模拟物转染至人类293细胞，并分析转染后约24小时胶原信使核糖核酸的表达。如图11所示，与阴性对照微核糖核酸组相比，微核糖核酸21模拟物增加了293细胞中胶原1型α1信使核糖核酸的表达。
[0070]
如图11所示，在mir-21转染后约24小时，胶原1型α1的信使核糖核酸表达约为对照的1.6-1.8倍。在阴性对照微核糖核酸转染后24小时，胶原1型α1的信使核糖核酸表达约为对照的1倍。
[0071]
这个例子表明，微核糖核酸对胶原表达的影响可以在其他类型的细胞中仿照。
[0072]
结论
[0073]
此实例显示，通过在游离体的程度上控制微核糖核酸，本发明可增加不同细胞类
型中的蛋白质表达。特异性微核糖核酸的上位体调控可用于提高养殖肉类生产中细胞的生产力。
[0074]
上述描述是说明性的而非限制性的。在阅读本发明的披露后，本领域技术人员可以清楚地看到本发明的实施例的许多变化。因此，实施例的范围不应根据上述描述来确定，而应参考待审的权利要求及其全部范围或等效范围来确定。
[0075]
任何实施例的一个或多个特征可以与任何其他实施例的一个或多个特征相结合，而不脱离实施例的范围。除非有明确相反的指示，否则“一个(a)”、“一个(an)”或“这(the)”的意思是“一个或多个”。除非另有明确相反的指示，否则“和/或”旨在代表该术语最具包容性的含义。
[0076]
虽然本发明可以以多种不同的形式体现，但应理解所提供的附图和讨论为本发明是一项或多项发明的原理的示例，并不旨在将任何一个实施例限制为所示的实施例。
[0077]
因此，在其更广泛的方面,本发明的披露不限于上述所示和所述的具体细节、代表性系统和方法以及说明性示例。在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以对上述披露进行各种修改和变更，并且本发明旨在涵盖所有此类修改和变更，前提是它们落入权利要求及其等效物的范围。
[0078]
示例性操作程序
[0079]
a.鱼鳔细胞系的开发
[0080]
1.从当地鱼市购买健康的黄鱼、鲈鱼或类似类别的鱼。
[0081]
2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
[0082]
3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
[0083]
4.在无菌条件下从鱼身上取出鱼鳔。
[0084]
5.用次氯酸清洗器官一次或多次。
[0085]
6.在抗生素培养基(含有400lu/ml青霉素、400pg/ml链霉素的leibovitz's l-15或dmem或emem)清洗器官一次或多次。
[0086]
7.清洗后，将器官切成小块(2-3立方毫米)。
[0087]
8.将切成小块的器官转移到含有0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。
[0088]
9.在室温下连续振荡孵育1小时。
[0089]
10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。
[0090]
11.将滤液以200克离心5分钟。
[0091]
12.用完全培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清的leibovitz's l-15或dmem或emem)重悬细胞沉淀物。
[0092]
13.将细胞接种到t25培养瓶中。
[0093]
14.在24至28℃下孵育。
[0094]
15.第二天去除未附上在组织培养瓶上的细胞。
[0095]
16.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基。
[0096]
17.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
[0097]
b.以组织外植体开发鱼鳔细胞系
[0098]
1.从当地鱼市购买健康的黄鱼、鲈鱼或类似类别的鱼。
[0099]
2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
[0100]
3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
[0101]
4.在无菌条件下从鱼身上取出鱼鳔。
[0102]
5.用次氯酸清洗器官一次或多次。
[0103]
6.在抗生素培养基(含有400lu/ml青霉素、400pg/ml链霉素的leibovitz's l-15或dmem或emem)清洗器官一次或多次。
[0104]
7.清洗后，将器官切成小块(1-2立方毫米)。
[0105]
8.将器官碎片分别放入含有完全培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清的leibovitz's l-15或dmem或emem)的24孔板中。
[0106]
9.在24至28℃下孵育。
[0107]
10.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基，不要干扰组织外植体。
[0108]
11.孵育组织外植体，直至观察到贴壁细胞。
[0109]
12.取出组织外植体。
[0110]
13.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
[0111]
c.以组织外植体开发鱼肌肉细胞系
[0112]
1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或类似类别的鱼。
[0113]
2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
[0114]
3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
[0115]
4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。
[0116]
5.用次氯酸清洗组织一次或多次。
[0117]
6.在抗生素培养基(含有400lu/ml青霉素、400pg/ml链霉素的leibovitz's l-15或dmem或emem)清洗组织一次或多次。
[0118]
7.清洗后，将组织切成小块(2-3立方毫米)
[0119]
8.将切成小块的组织转移到含有胶原酶和散酶的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。
[0120]
9.在室温下连续振荡孵育1小时。
[0121]
10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。
[0122]
11.将滤液以200克离心5分钟。
[0123]
12.用完全培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清的leibovitz's l-15或dmem或emem)重悬细胞沉淀物。
[0124]
13.将细胞接种到t25培养瓶中。
[0125]
14.在24至28℃下孵育。
[0126]
15.第二天去除未附上在组织培养瓶上的细胞。
[0127]
16.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基。
[0128]
17.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
[0129]
d.从组织外植体开发鱼肌肉细胞系
[0130]
1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或类似类别的鱼。
[0131]
2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
[0132]
3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
[0133]
4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。
[0134]
5.用次氯酸清洗组织一次或多次。
[0135]
6.在抗生素培养基(含有400lu/ml青霉素、400pg/ml链霉素的leibovitz's l-15或dmem或emem)清洗组织一次或多次。
[0136]
7.清洗后，将肌肉切成小块(1-2立方毫米)。
[0137]
8.将肌肉块分别放入含有完全培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清的leibovitz's l-15或dmem或emem)的24孔板中。
[0138]
9.在24至28℃下孵育。
[0139]
10.每2至3天用新鲜培养基更换一半培养基，不要干扰组织外植体。
[0140]
11.孵育组织外植体，直至观察到贴壁细胞。
[0141]
12.取出组织外植体。
[0142]
13.当细胞形成完整的单层时，细胞被认为已建立。已建立的细胞可以进行继代培养。
[0143]
e.成体干细胞分离和培养
[0144]
1.从当地鱼市购买健康的石斑鱼、鳕鱼、比目鱼、大比目鱼、比目鱼或6个月或更小的类似类别的鱼。
[0145]
2.将鱼放在冰上直到细胞分离。
[0146]
3.将鱼浸在10％的漂白剂中。
[0147]
4.在无菌条件下去除鱼的肌肉。
[0148]
5.用次氯酸清洗组织一次或多次。
[0149]
6.在抗生素培养基(含有400lu/ml青霉素、400pg/ml链霉素的leibovitz's l-15或dmem或emem)清洗组织一次或多次。
[0150]
7.清洗后，将组织切成小块(2-3立方毫米)。
[0151]
8.将切成小块的组织转移到含有胶原酶和散酶的磷酸盐缓冲生理盐水的离心管中。
[0152]
9.在室温下连续振荡孵育1小时。
[0153]
10.用100皮米网孔过滤上清液以去除未消化的组织。
[0154]
11.将滤液以200克离心5分钟。
[0155]
12.用完全培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清、100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的leibovitz's l-15或dmem或emem)重悬细胞沉淀。
[0156]
13.在24至28℃下将细胞铺板在未有涂层的板上1小时。
[0157]
14.收集上清液并置于涂有粘连蛋白、明胶、基质胶或类似基质的板上。
[0158]
15.在24至28℃下孵育。
[0159]
16.24小时后，洗去任何松散附着和未附上的细胞。
[0160]
17.每天用完全培养基更换培养基(含有200lu/ml青霉素、200pg/ml链霉素、10％牛血清、100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的leibovitz's l-15或dmem或emem)。
[0161]
f.生成和培养诱导性多能干细胞
[0162]
1.转染前2至4天，将细胞置于放有完整培养基(含10％胎牛血清的l15)的组织培养瓶中。转染当天(第0天)，细胞应约75至90％汇合。
[0163]
2.从涂有明胶的6孔板中吸取培养基，并在每孔更换2毫升新鲜完整培养基。将有涂层的板放置在37℃下，直到可以使用为止。
[0164]
3.置于37℃下解冻epi5
tm
载体，将其放置在湿冰上直到可以使用为止。使用前，对解冻的载体进行短暂离心，将其收集在试管底部。
[0165]
4.在磷酸盐缓冲生理盐水中清洗细胞。
[0166]
5.在含有细胞的培养瓶中添加3毫升0.05％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸。
[0167]
6.在室温下放置培养瓶3分钟。
[0168]
7.在每个培养瓶添加5至8毫升完整培养基。小心地将细胞转移到一个空的、无菌的15毫升锥形管中。
[0169]
8.用台盼蓝染料排斥细胞活性测定法检查活性。
[0170]
9.离心200克细胞2分钟。
[0171]
10.小心吸取大部分上清液，用完整培养基重新悬浮。
[0172]
11.将涂有明胶的培养皿上的细胞接种到6孔培养皿中，每孔培养50000至100000个细胞，在2毫升完整培养基中以30至60％的汇合度，并在24至28℃下培养过夜。
[0173]
12.预热opti-mem/减血清培养基至室温，并按如下所述制备试管a和试管b。
[0174]
13.在标记为试管a的1.5毫升微型离心管中,分别将1.2微升的两个epi5
tm
重新编程矢量混合物(总计2.4微升)添加到118微升的opti-mem培养基中。添加4.8微升的p3000
tm
试剂并充分混合。
[0175]
14.在标记为试管b含有预先加热121l的opti mem培养基的1.5毫升微型离心管中,稀释3.6微升的lipofectamine 3000试剂。
[0176]
15.为了制备转染主混合物，将试管a的内容物添加到试管b中，并充分混合。
[0177]
16.将转染主混合物在室温下培养5分钟。
[0178]
17.再混合一次，将250微升的转染主混合物加入到向每个孔中。
[0179]
18.在24-28℃下培养过夜。
[0180]
19.转染后24小时，从平板中吸取培养基。向每个孔中添加2毫升n2b27培养基(含有ix n-2补充剂，ix b27补充剂，100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子重组蛋白的l15)。
[0181]
20.每天以2毫升n2b27培养基更换旧培养基的方式更换n2b27培养基，共14天。
[0182]
21.第14天吸取用过的n2b27培养基，更换为完整培养基。随后每天在每个孔中更换2毫升的培养基。
[0183]
22.每隔一天在显微镜下观察培养板是否出现表明细胞已转化的细胞团。在转染后15至21天内，诱导性多能干细胞菌落将生长到合适的大小以进行转移。
[0184]
23.菌落在第21天是不同的，可以挑选出来进行进一步的培养和扩展。
[0185]
g.细胞继代培养方法
[0186]
1.取出并丢弃培养基。
[0187]
2.用磷酸盐缓冲生理盐水简短地冲洗细胞，去除所有含有胰蛋白酶抑制剂的微量血清。
[0188]
3.向培养瓶添加2至3毫0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液。
[0189]
4.在室温下培养1分钟。
[0190]
5.加入5至8毫升完整生长培养基。
[0191]
6.轻轻移液吸取细胞。
[0192]
7.以1比2至1比3的继代培养比率将适当等分的细胞悬浮液添加到新的培养瓶中。
[0193]
8.在24至28℃下培养。
[0194]
h.悬浮培养适应性
[0195]
1.以适合所述细胞的频率通过胰蛋白酶传代单层培养。
[0196]
2.每次传代时，用磷酸盐缓冲生理盐水清洗细胞单层，并用0.25％胰蛋白酶覆盖。
[0197]
3.室温孵育5分钟。
[0198]
4.用完全培养基灭活酶。
[0199]
5.收获细胞悬液，用台盼蓝染料排斥细胞活力测定法检测细胞活力。
[0200]
6.将细胞悬浮液接种到另一个培养瓶中。
[0201]
7.重复传代，直至悬浮细胞活力等于或大于90％。
[0202]
8.在细胞密度为每毫升0.1至0.5百万的旋转瓶或摇瓶中，用50毫升完整培养基建立悬浮培养基。
[0203]
9.在二氧化碳培养箱中，在最适合单层培养的相同温度、湿度和大气条件下，培养旋转瓶或摇瓶悬浮培养物。
[0204]
10.每隔2至3天用新鲜培养基将细胞密度调节到每毫升0.1至0.5百万。
[0205]
11.通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
[0206]
12.于可促进健康细胞生长的细胞密度下建立多个平行培养物。
[0207]
13.使用部分培养物将细胞密度逐渐增加至每毫升100万。
[0208]
14.如果细胞密度增加导致细胞死亡，则丢弃高密度培养物。
[0209]
15.从步骤12重新启动细胞高密度培养的适应。
[0210]
16.当细胞适应悬浮生长时，使用3l生物反应器扩大培养。
[0211]
i.适应无血清培养基(植物水解液)
[0212]
1.在dmem/f12完全培养基(1:1dmem培养基和ham's f12培养基，2至4mm谷氨酰胺，10％胎牛血清)中培养细胞。
[0213]
2.制备无血清培养基(1:1dmem培养基和ham's f12培养基，2至4mm谷氨酰胺，20％植物水解物例如大豆、棉籽、油菜、小麦、酵母或等效物)。
[0214]
3.当细胞达到汇合时，用适应培养基i(40％新鲜完整培养基，40％前代条件培养基，20％无血清培养基)代替培养基。
[0215]
4.每2至3天用台盼蓝染料排斥细胞活性测定法检查活性。
[0216]
5.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤3。
[0217]
6.当细胞达到汇合时，用适应培养基ii(30％新鲜完整培养基，30％步骤1中细胞的条件培养基，40％无血清培养基)替换培养基。
[0218]
7.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
[0219]
8.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤6。
[0220]
9.当细胞达到汇合时，用适应培养基iii(20％新鲜完整培养基，20％步骤1中细胞的条件培养基，60％无血清培养基)替换培养基。
[0221]
10.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
[0222]
11.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤9。
[0223]
12.当细胞达到汇合时，用适应培养基iv(10％新鲜完整培养基，10％步骤1中细胞的条件培养基，80％无血清培养基)替换培养基。
[0224]
13.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
[0225]
14.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤12。
[0226]
15.当细胞汇合时，用无血清培养基代替培养基。
[0227]
16.每2至3天通过台盼蓝染料排斥细胞活性测定检查活性。
[0228]
17.如果适应导致细胞死亡，则丢弃培养物并重复步骤15。
[0229]
18.无血清培养基的使用量可在每一步骤中逐步增加，即每一步骤增加20％或更少。
[0230]
j.适应无血清培养基(化学定义)
[0231]
1.在dmem/f12完全培养基中培养细胞(1:1dmem培养基和ham's f12培养基，2至4mm谷氨酰胺，10％胎牛血清)。
[0232]
2.制备无血清培养基(1:1dmem培养基和ham's f12培养基，2至4mm谷氨酰胺，65-130ug/ml抗坏血酸2-磷酸，550-1100ug/ml碳酸氢钠锭，14-28ng/ml亚硒酸钠，19-38ug/ml胰岛素，11-22ug/ml转铁蛋白，100-200ng/ml成纤维细胞生长因子，2-4ng/ml乙型转化生长因子)。
[0233]
3.当细胞达到汇合时，用适应培养基i(40％新鲜完全培养基、40％前传代条件培养基、20％无血清培养基)更换培养基。
[0234]
4.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
[0235]
5.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤3。
[0236]
6.当细胞达到汇合时，用适应培养基ii(30％新鲜完全培养基、30％步骤1中细胞的条件培养基、40％无血清培养基)更换培养基
[0237]
7.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
[0238]
8.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤6。
[0239]
9.当细胞达到汇合时，用适应培养基iii(30％新鲜完全培养基、30％步骤1中细胞的条件培养基、40％无血清培养基)更换培养基。
[0240]
10.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
[0241]
11.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤9。
[0242]
12.当细胞达到汇合时，用适应培养基iv(10％新鲜完全培养基、10％步骤1中细胞的条件培养基、80％无血清培养基)更换培养基。
[0243]
13.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
[0244]
14.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤12。
[0245]
15.当细胞达到汇合时，用无血清培养基更换培养基。
[0246]
16.每2至3天通过台盼蓝染料排除细胞活力测定检查活力。
[0247]
17.如果适应导致细胞死亡，丢弃培养物并重复步骤15。
[0248]
18.无血清培养基的用量可在每一步骤逐渐增加。例如，每一步骤增加20％或更少。
[0249]
l.细胞培养支架(魔芋+树胶)
[0250]
1.用几片藏红花烧开水，直至颜色变成淡黄色。
[0251]
2.取出藏红花，将溶液静置至温热。
[0252]
3.准备所有干料
[0253]
a.魔芋
–
0.5至5％，优选地3％
[0254]
b.泡打粉
–
0.3至3％，优选地3％
[0255]
c.完善的黄原胶
–
0.2至2％，优选地1.5％
[0256]
4.量取100毫升藏红花溶液。
[0257]
5.依次加入泡打粉、黄原胶。加入每种成分后，充分搅拌混合物。
[0258]
6.将魔芋一点一点洒在溶液上。继续搅拌。溶液应该变得糊状。
[0259]
7.将魔芋混合物铺在模具中，厚度约为1至15毫米。
[0260]
8.盖上模具，在室温下静置30分钟以上。
[0261]
9.将模具放入4℃冰箱4小时。
[0262]
10.将模具用小火蒸40分钟。
[0263]
11.将模具在室温下静置2小时。
[0264]
12.将支架在45至55℃下脱水15分钟。
[0265]
m.细胞培养支架(藻酸盐+魔芋)
[0266]
1.称取0.1至2克(0.1至2％)，优选地约1克(1％)海藻酸钠。
[0267]
2.在搅拌机中加入100毫升水。
[0268]
3.将海藻酸盐粉末加入搅拌机，搅拌至溶解。
[0269]
4.用塑料薄膜盖住容器，将藻酸盐溶液放入冰箱过夜，以消除气泡。
[0270]
5.称取0.5至5克，优选地3克左右的魔芋，放入模具中。
[0271]
6.将海藻酸盐溶液加入模具中，约1至15毫米，优选地约8毫米厚。
[0272]
7.搅拌混合物直至所有粉末溶解。
[0273]
8.用小火蒸30分钟直至定型。
[0274]
9.盖上模具，在室温下静置30分钟。
[0275]
10.称取0.1至2％，优选地1.5％的乳酸钙，搅拌溶解在水中。
[0276]
11.将支架浸入0.1至2％，优选地约1.5％的乳酸钙溶液中至少2.5小时，以便在支架周围形成膜。
[0277]
[0278]