改进的AAV-ABCD1构建体和用于治疗或预防肾上腺脑白质营养不良(ALD)和/或肾上腺脊髓神经病(AMN)的用途的制作方法

背景技术：

1、本发明描述了治疗x连锁肾上腺脑白质营养不良(x-linkedadrenoleukodystrophy，x-ald)的基因治疗，x-ald是由过氧化物酶体膜atp结合盒转运蛋白(abcd1)基因的突变引起的进行性单基因神经退行性疾病，该abcd1基因编码负责将coa激活的极长链脂肪酸(very long-chain fatty acid，vlcfa)转运到过氧化物酶体中进行降解的肾上腺脑白质营养不良蛋白(aldp)。人aldp例如由ncbi参考序列：nm_000033或nm_000033.4标识的核酸序列编码。

2、aldp是具有位于过氧化物酶体膜的细胞质表面的atp结合结构域的完整的过氧化物酶体膜蛋白，并负责将vlcfa-coa跨过氧化物酶体膜转运到过氧化物酶体基质中。aldp缺乏导致vlcfa降解受损。因此，x-ald患者表现出血液(可以从血浆或血清中检测到)以及脑、脊髓、肾上腺皮质的组织和其他组织中高水平的饱和极长链脂肪酸(very long chainfatty acid，vlcfa)(例如链长为大于20个碳的饱和vlcfa(即c>20，例如“c24:0”和“c26:0”))的积累。

3、x-ald的临床表型包括肾上腺脊髓神经病(amn)和脑性肾上腺脑白质营养不良(ccald)。症状可以在儿童期或成人期开始。成人ald患者通常在二十多岁时发展成肾上腺脊髓神经病(amn)，这是一种使人衰弱的神经病症(engelen et al.,orphanet j raredis.2012；7:51)。abcd1敲除小鼠发展出与amn相似的表型，表现出脊髓轴突变性以及由于受影响的背根神经节神经元(dorsal root ganglia neuron，drg)引起的周围神经病(pujol et al.,hum mol genet.2002；11:499-505)。

4、儿童脑性肾上腺脑白质营养不良(ccald)是在男孩(平均发病年龄7岁；范围3至15岁)中的非常罕见的、有时进展迅速的x连锁遗传性神经病症，其不经治疗会导致植物状态并最终在确诊之后5年(中位数)内死亡。ccald通常最初表现为艾迪生病(addison'sdisease)，但诊断通常基于注意力、思维、专注和其他脑功能的“突然”下降以及磁共振成像(magnetic resonance imaging，mri)上脑脱髓鞘的确认性发现作出。在脱髓鞘之前，患者脑mri正常，并且无神经发育异常。临床过程起初可能是“缓慢的”，但随着脑中髓鞘的广泛丧失，可能会迅速进展且不可逆转。术语“缓慢的”和“突然”是相对的，因为脱髓鞘的持续时间尚不清楚，但认知和运动功能的快速下降可随时发生并且原因不明。事实上，mri的变化先于症状出现，并且可在疾病的临床表现非常少时出现广泛脱髓鞘这样充分发展的异常。在美国，x连锁ald的发生率为约1:21,000男婴，其中约35％发展为ccald；每年约有35至40名男孩被诊断出患有ccald。该疾病的原因是atp结合盒亚家族d成员1(atp-bindingcassette,sub-family d,member 1，abcd1)基因的突变，其导致肾上腺脑白质营养不良蛋白(aldp)基因产物功能失调或缺失。aldp定位于细胞过氧化物酶体，在那里aldp通过β氧化参与将极长链脂肪酸(vlcfa)(链长>20个碳)降解成较短的脂肪酸，其用于维持细胞结构和功能。

5、目前，ald通过提供产生功能性aldp的细胞的同种异体造血干细胞移植(hct)来治疗，并且使用产生功能性aldp的细胞进行完全匹配的相关供体人干细胞移植可以潜在地改善或阻止脱髓鞘的进展。然而，同种异体hct需要12到18个月才能稳定疾病，并且由于疾病的进行性特点，诊断之后应尽快进行移植。这有时是有困难的，因为寻找相关或不相关的匹配骨髓干细胞供体需要提前时间。同种异体干细胞的使用也存在移植失败以及发生急性和慢性移植物抗宿主病(graft versus host disease，gvhd)的风险。当不相关的供体被用作同种异体造血干细胞的来源时，这些并发症会导致死亡并且发生率提高。

6、aldp替代的另一个来源是使用匹配的或更典型地部分匹配的脐带血细胞移植物。然而，脐带血干细胞(cord blood stem cell，cbsc)的使用有困难，存在移植失败的风险，并且植入时间延长，需要延长输血支持。事实上，所有形式的同种异体hct都涉及10％至15％的移植相关死亡率风险，以及高至30％的慢性移植物抗宿主病风险。

7、腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)是有缺陷的非致病性人细小病毒，由于其温和的免疫应答和缺乏致病性而通常用于基因递送。aav病毒可以指导长期转基因表达，但通常不会永久整合到宿主基因组中。鉴于这样的能力，aav为安全且有效的基因治疗提供了可行的选择。虽然先前报道了使用重组腺相关病毒血清型9(raav9)载体在体外和体内转导中枢神经系统细胞以递送人abcd1基因，但本领域对更安全且更有效的肾上腺脑白质营养不良治疗的需求尚未得到满足。鉴于不同的aav血清型显示出不同的细胞趋向性，选择最佳血清型以建立基因转移系统是重要的。本发明通过提供安全且有效的改进的腺相关病毒载体和递送系统(即，其可用于在患有x-ald或amn的患者中递送无毒水平的abcd1)而提供了对这些和其他问题的解决方案。

技术实现思路

1、本发明的一个特定目的是提供用于治疗或预防ald或amn的安全且有效的方法和材料，其涉及施用新的且改进的aav dna构建体。

2、本发明提供了改进的腺相关病毒(aav)构建体。本发明还提供了通过共转染包含编码atp结合盒亚家族d成员1(abcd1)基因的raav载体基因组(“raav基因组载体”)的质粒以及编码aav rep和cap蛋白的第二质粒(“rep/cap质粒”)以及一种或更多种病毒辅助质粒来产生改进的重组aav(raav)载体的方法。本发明还提供了包含这些aav构建体的细胞和组合物，其可用于在有此需要的对象中治疗和/或预防肾上腺脑白质营养不良和/或肾上腺脊髓神经病。

3、本发明还提供了用于制备这样的改进的aav构建体的方法，该构建体编码表达ald蛋白(“aldp”，在本文中也称为“abcd1”蛋白)的abcd1基因。此外，本发明提供了使用表达ald蛋白的对象改进的aav构建体和包含其的细胞和组合物用于在有此需要的对象中治疗和/或预防肾上腺脑白质营养不良和/或肾上腺脊髓神经病的方法，例如，其中这样的改进的aav构建体例如通过鞘内、脑室内(intracerebroventricular，icv)、鞘内-腰(intrathecal-lumbar，it-l)、血管内、肌内或脑池内施用进行施用的方法。

4、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)与编码人abcd1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子；(c)经修饰的土拨鼠转录后调节元件，其中x-蛋白失活(wpre x-失活)；(d)至少一个终止子；(e)至少一个polya信号和(f)3’末端反向重复(3’itr)。

5、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)增强子，其与(c)可操作地连接；(c)启动子，其还在3’端包含内含子并且与(d)可操作地连接；(d)编码人abcd1基因的多核苷酸；(e)经修饰的土拨鼠转录后调节元件，其中x-蛋白失活(wpre x-失活)；(f)至少一个终止子；(g)至少一个polya信号和(h)3’末端反向重复(3’itr)。

6、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)与编码人abcd1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子，所述启动子还在其5’端包含增强子或在其3’端包含内含子；(c)经修饰的土拨鼠转录后调节元件，其中x-蛋白失活(wpre x-失活)；(d)至少一个终止子；(e)至少一个polya信号和(f)3’末端反向重复(3’itr)。

7、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)与编码人abcd1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子；(c)至少一个终止子；(d)至少一个polya信号和(e)3’末端反向重复(3’itr)。

8、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)增强子，其与(c)可操作地连接；(c)启动子，其还在其3’端包含内含子；(d)与编码人abcd1基因的多核苷酸可操作地连接；(e)至少一个终止子；(f)至少一个polya信号和(g)3’末端反向重复(3’itr)。

9、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)与编码人abcd1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子，所述启动子还在其5’端包含增强子或在其3’端包含内含子；(c)至少一个终止子；(d)至少一个polya信号和(e)3’末端反向重复(3’itr)。

10、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)与编码人abcd1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子，所述启动子还在其5’端包含科扎克共有序列(kozak consensus sequence)('ccacc'或'gccacc'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物(approch)：‘gccrccatgg’的任何序列)；(c)至少一个终止子；(d)至少一个polya信号和(e)3’末端反向重复(3’itr)。

11、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)增强子，其与(c)可操作地连接；(c)启动子，其还在其3’端包含内含子并且与(d)可操作地连接；(d)编码人abcd1基因的多核苷酸，所述多核苷酸还在其5’端包含科扎克共有序列('ccacc'或'gccacc'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘gccrccatgg’的任何序列)；(e)至少一个终止子；(f)至少一个polya信号和(g)3’末端反向重复(3’itr)。

12、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)与编码人abcd1基因的多核苷酸可操作地连接的启动子，所述启动子还在其5’端包含科扎克共有序列('ccacc'或'gccacc'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘gccrccatgg’的任何序列)；(c)任选地，在科扎克序列5’端的增强子或在启动子3’端的内含子；(d)至少一个终止子；(e)至少一个polya信号和(f)3’末端反向重复(3’itr)。

13、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)与编码人abcd1基因的在abcd1编码序列内包含3、6或9个核苷酸变化的多核苷酸上游的科扎克共有序列('ccacc'或'gccacc'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘gccrccatgg’的任何序列)可操作地连接的启动子；(c)至少一个终止子；(d)至少一个polya信号和(e)3’末端反向重复(3’itr)。

14、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)增强子，其与(c)可操作地连接；(c)启动子，其在其3’端包含内含子；(d)在编码人abcd1基因的在abcd1编码序列内包含3、6或9个核苷酸变化的多核苷酸上游的科扎克共有序列('ccacc'或'gccacc'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘gccrccatgg’的任何序列)；(e)至少一个终止子；(f)至少一个polya信号和(g)3’末端反向重复(3’itr)。

15、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav基因组载体：(a)5’末端反向重复(5’itr)；(b)与编码人abcd1基因的在abcd1编码序列内包含3、6或9个核苷酸变化的多核苷酸上游的科扎克共有序列('ccacc'或'gccacc'，或代表最佳蛋白质翻译起始的共有序列的近似物：‘gccrccatgg’的任何序列)可操作地连接的启动子；(c)任选地，在科扎克序列5’端的增强子或在启动子3’端的内含子；(d)至少一个终止子；(e)至少一个polya信号和(f)3’末端反向重复(3’itr)。

16、在任何实施方案中，至少一个终止子可以包含在abcd1基因编码多核苷酸中。

17、在一些实施方案中，raav基因组包含增强子、启动子、β-肌动蛋白外显子、内含子和/或β-球蛋白外显子，任选地在从5’端到3’端的方向上。

18、在一些实施方案中，增强子是cmv增强子。

19、在一些实施方案中，启动子是鸡β肌动蛋白启动子。

20、在一些实施方案中，β-肌动蛋白外显子来源于鸡β肌动蛋白的替代转录物之一，并且嵌合内含子由以下组成：来自鸡β肌动蛋白第一内含子的供体和来自兔β-球蛋白第二1内含子的接受体。

21、在一些实施方案中，内含子是嵌合内含子。

22、在一些实施方案中，β-球蛋白外显子是兔β-球蛋白外显子，例如兔β-球蛋白第三外显子。

23、在任何实施方案中，polya信号可以包含sv40 polya信号、bgh polya信号或其组合。polya信号在本文中也可以称为“pa”。

24、在另一些实施方案中，本发明部分地考虑了aav rep/cap质粒，其包含：(a)启动子(b)复制基因；(c)衣壳基因。

25、在一些实施方案中，rep/cap质粒包含p5、p19或p40启动子中的一种或更多种。

26、在一些实施方案中，复制基因选自编码rep 78、rep 68、rep 52或rep 40蛋白的aav血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、或aavrh.10的复制基因或其变体。

27、在一些实施方案中，复制基因是或来源于aav2、aav9或aavrh.10的复制基因。

28、在一些实施方案中，当复制基因(rep基因)来源于aav2的复制基因时，两种复制基因产物rep78和rep68可以由p5启动子转录，两种复制基因产物以及rep52和rep40可以由p19启动子转录。在一些实施方案中，衣壳基因选自编码vp1、vp2和/或vp3蛋白的aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aavrh.10的衣壳基因或其变体。

29、在一些实施方案中，衣壳基因是或来源于aav2、aav9或aavrh.10(本文也称为aavrh10)的衣壳基因。

30、在一些实施方案中，当衣壳基因(cap基因)来源于aav9的衣壳基因时，aav9的三种复制基因产物vp1、vp2和vp3可由p40启动子转录(即在其控制下转录)。

31、在一些实施方案中，当衣壳基因(cap基因)来源于aav2的衣壳基因时，可以产生aav2的三种复制基因产物vp1、vp2和vp3。

32、在一些实施方案中，当衣壳基因(cap基因)来源于aavrh.10的衣壳基因时，可以产生aavrh.10的三种复制基因产物vp1、vp2和vp3。

33、在一些实施方案中，rep/cap质粒可以完全来源于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、或aavrh.10，而在一些实施方案中，rep/cap质粒可具有混合血清型，例如aav2/9，其包含一种或更多种来自aav2的元件/基因和一种或更多种来自aav9的元件/基因。在某些实施方案中，当rep/cap质粒具有aav2/9血清型时，rep基因可以具有aav2并且cap基因可以具有aav9。

34、在一些实施方案中，5’和3’末端反向重复(itrs)天然存在于血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、或aavrh.10。

35、在一些实施方案中，5’和3’末端反向重复(itrs)是aav2。

36、在一些实施方案中，相对于天然aav2 itr，5’和3’末端反向重复(itrs)在5’端缩短15个核苷酸('ttggccactccctct')，并在3’端缩短最后15个核苷酸('agagggagtggccaa')。这(两个被去除的15个核苷酸序列的集合)包括几乎所有的a区域。

37、在另一些实施方案中，本发明部分地考虑了辅助病毒或病毒辅助质粒以帮助raav生产。在一些实施方案中，辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或乳头瘤病毒。在一些实施方案中，病毒辅助质粒包含腺病毒、单纯疱疹病毒或乳头瘤病毒的一种或更多种基因。在一些实施方案中，辅助病毒或病毒辅助质粒来源于或包含以下的一种或更多种基因：野生型(wt)或变体腺病毒，例如腺病毒5(ad5)(例如，登录号ac_000008.1或seq id no:2000)或腺病毒2(ad2)(例如登录号j01917.1或seq id no:3000))；单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus，hsv)，例如人hsv i型(例如登录号nc_001806)；乳头瘤病毒；或牛痘病毒(例如，登录号nc_006998)。

38、在一些实施方案中，辅助病毒或病毒辅助质粒包含来自腺病毒的e1、e2a、e4和/或va rna区序列。

39、在一些实施方案中，这样的辅助病毒或病毒辅助质粒提供有助于raav载体包装、产生和/或功能的一种或更多种基因或基因产物(或元件或因子)。

40、在一些实施方案中，当辅助病毒或病毒辅助质粒来源于ad5(例如，本文称为“pald-x80”的质粒)时，辅助病毒或质粒可包含ad5区域va-rna、ad5区域e2和/或ad5区域e4。在某些实施方案中，ad5区域va-rna可以包含va-rna区域(va rna i)和/或va-rna区域(va rna ii)。在某些实施方案中，ad5区域e2可以编码六邻体(c-端片段)、23k内切蛋白酶、e2a/dbp、六邻体装配体(100k)、六邻体装配体(33k)、六邻体装配体(22k)和/或六邻体相关前体。在某些实施方案中，ad5区域e4可以编码纤维(fiber)、e4 orf1、e4 orf2、e4 orf3、e4o rf4、e4 orf6和/或e4 orf6/7。

41、在一些实施方案中，当辅助病毒或质粒来源于ad2(例如，本文称为“phelp_kanv4”的质粒)，辅助病毒或质粒可包含ad2区域va-rna、ad2区域e2和/或ad2区域e4。在某些实施方案中，ad2区域va-rna可包含va-rna区域(va rna i)和/或va-rna区域(va rna ii)。在某些实施方案中，ad2区域e2可不编码六邻体并且可编码23k内切蛋白酶(c-端片段)、e2a/dbp、六邻体装配体(100k)、六邻体装配体(33k)、六邻体装配体(22k)和/或六邻体相关前体。在某些实施方案中，ad2区域e4可不编码纤维并且可编码e4 orf1、e4 orf2、e4 orf3、e4orf4、e4 orf6和/或e4 orf6/7。

42、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，raav)载体基因组，其可以包装在病毒衣壳中以形成raav病毒体，其中所述raav载体基因组包含以下或由以下组成：(a)5’aav末端反向重复(inverted terminal repeat，itr)；(b)表达盒，其中所述表达盒包含至少(i)在靶细胞中有活性的启动子，其与(ii)可操作地连接，(ii)编码atp结合盒亚家族d成员1(abcd1)多肽的多核苷酸，(iii)一个或更多个终止子和(iv)所述abcd1编码多核苷酸下游的一个或更多个poly a信号；以及(c)3’itr。raav载体基因组可不包含土拨鼠转录后调节元件(woodchuck post-transcriptional regulatory element，wpre)或可包含经修饰的wpre，其包含导致x蛋白不表达或以失活形式表达的至少一个突变(wprex-失活)。

43、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了可以使用任何上述aav基因组载体连同任何上述rep/cap质粒和任何上述病毒辅助质粒产生的raav载体。

44、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了包含以下的raav载体：(i)任何上述aav衣壳和(ii)任何上述aav基因组。

45、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了组合物，其包含(a)任何raav基因组载体和任选地以下中的一种或更多种：(b)包含任何上述aav cap基因的多核苷酸；(c)包含任何上述aav rep基因的多核苷酸；(d)包含任何上述腺病毒辅助基因的多核苷酸；和/或(e)可药用载体或赋形剂。在一些情况下，这样的组合物可用于产生任何上述raav载体。

46、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了组合物，其包含：(i)任何上述raav载体和(ii)可药用载体。在一些情况下，这样的组合物可用于任何治疗和预防本文公开的疾病病症(例如肾上腺脑白质营养不良(ald)或肾上腺脊髓神经病(amn))的方法。

47、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了制备任何上述aav构建体的方法。

48、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了使用或施用任何上述aav构建体用于在有此需要的对象中治疗肾上腺脑白质营养不良(ald)或肾上腺脊髓神经病(amn)的方法。

49、在一些实施方案中，本发明部分地考虑了使用或施用与可药用载体组合的任何上述aav构建体的方法。