一种重组嗜麦芽寡养单胞菌及其在降解多环芳烃废水中的应用

本发明属于微生物及发酵工程
技术领域：
，具体涉及到一种重组嗜麦芽寡养单胞菌及其在降解多环芳烃废水中的应用。技术背景石油作为矿产资源中不可或缺的一部分，在制造业、农业以及医药领域都有着广泛应用。随着石油工业开发速度不断加快，石油化工产品的应用范围不断扩大，石油污染的问题日益严重。石油烃包括烷烃、环烷烃以及芳香烃，其中以芳香烃类中的多环芳烃毒性最强。生物膜广泛存在于自然界，在生物膜形成过程中，细菌自身分泌产生的胞外聚合物(eps)是生物膜形成的物质基础，具有分层分布的特点，对细菌的粘附及聚集起到了关键作用。固定化连续发酵技术现如今已经投入到产业化当中，其中用生物膜的方式进行固定化连续发酵却鲜有报道。嗜麦芽寡养单胞菌作为重要的多环芳烃降解菌株，其成膜能力非常弱，难以连续发酵，因此我们需要对该菌株进行分子改造，使其成膜效果增强，以实现后期固定化连续发酵。在嗜麦芽寡养单胞菌中，已知乙二醛酶glo由基因glx1基因编码。乙二醛酶glo是一种双加氧酶，是多环芳烃在菌体内降解的过程中不可缺少的关键酶。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种重组嗜麦芽寡养单胞菌，以提高嗜麦芽寡养单胞菌的成膜能力，解决现有技术中嗜麦芽寡养单胞菌成膜能力弱，不能用于连续发酵的问题。本发明还要解决的技术问题是，提供上述嗜麦芽寡养单胞菌的构建方法。本发明最后要解决的技术问题是，提供上述嗜麦芽寡养单胞菌通过生物膜连续化降解多环芳烃的应用。本发明的目的可通过以下技术方案实现：一种重组嗜麦芽寡养单胞菌，所述的重组嗜麦芽寡养单胞菌是通过将乙二醛酶基因过表达载体转入嗜麦芽寡养单胞菌中得到的能够过表达乙二醛酶的基因工程菌。作为本发明的一种优选，所述嗜麦芽寡养单胞菌为cgmcc1.14975，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。作为本发明的一种优选，所述的乙二醛酶基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。作为本发明的一种优选，所述的乙二醛酶基因过表达载体的出发载体为pxmj19。本发明所述的重组嗜麦芽寡养单胞菌的构建方法，包含以下步骤：(1)以嗜麦芽寡养单胞菌cgmcc1.14975的基因组dna为模板，以seqidno.3和seqidno.4所示引物进行pcr扩增得到seqidno.2所示的乙二醛酶基因片段；(2)将步骤(1)得到的乙二醛酶基因片段克隆到出发载体上，得到重组质粒；(3)将步骤(2)得到的重组质粒导入嗜麦芽寡养单胞菌中，筛选得到过表达乙二醛酶的重组嗜麦芽寡养单胞菌。作为本发明的一种优选，所述pcr扩增的方法为:94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，进行30个循环。作为本发明的一种优选，所述的过表达质粒为pxmj19。本发明所述的重组嗜麦芽寡养单胞菌在降解多环芳烃中的应用。一种处理含多环芳烃废水的方法，包含向待处理的含多环芳烃废水中加入预处理后的固定化载体、培养基成分、重组嗜麦芽寡养单胞菌种子液，批次发酵，得到处理合格的废水；其中，每一批发酵结束后，用新的待处理废水代替前一批得到的发酵液；所述的培养基成分为蛋白胨、磷酸二氢钾和无水硫酸镁，使废水中蛋白胨终浓度为5g/l、磷酸二氢钾终浓度为1g/l、无水硫酸镁终浓度为0.5g/l。作为本发明的一种优选，所述的固定化载体为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆中的任意一种或几种的组合；所述的预处理为将固定化载体剪成3-9cm*3-9cm的正方形，用纯水洗净干燥后于乙醇中浸泡，再用纯水清洗后沸水浴10-40min后干燥；固定化载体的用量为5-15g/500ml待处理废水。作为本发明的一种优选，将重组嗜麦芽寡养单胞菌接种到种子培养基中，培养，得到种子液。重组嗜麦芽寡养单胞菌种子培养基中各组分的浓度为:蛋白胨5g/l、磷酸二氢钾1g/l、无水硫酸镁0.5g/l，溶剂为水。所述的培养为在28-34℃，150rpm条件下培养10～14h。作为本发明的一种优选，每500ml的摇瓶加入50ml的发酵培养基，接入10％～30％(v/v，以发酵培养基体积为基准)的种子液，在28-34℃,150rpm/min条件下发酵60～90h，优选72h。作为本发明的一种优选，每一批发酵前向废水中加入培养基成分。有益效果:1、本发明构建了一株过表达乙二醛酶的嗜麦芽寡养单胞菌，提高了嗜麦芽寡养单胞菌的成膜能力，使得嗜麦芽寡养单胞菌固定化连续发酵的产量比游离发酵的原始菌提高了36.4％，且发酵周期缩短了23.1％。2、本发明发明了一种嗜麦芽寡养单胞菌固定化降解多环芳烃的方法，利用纤维(棉纤维织物、无纺布、聚酷纤维、聚乙烯醇纤维、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆)作为固定化材料，固定的菌体可以反复利用，能够进行连续发酵。附图说明图1为pxmj19*glo质粒琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道1，2为重组质粒pxmj19，泳道3为原始质粒pxmj19*glo，泳道4为marker。图2为嗜麦芽寡养单胞菌cgmcc1.14975原始菌和重组菌结晶紫染色法半定量测生物膜量的实验数据。图3为嗜麦芽寡养单胞菌cgmcc1.14975原始菌和重组菌发酵周期图。图4为嗜麦芽寡养单胞菌cgmcc1.14975原始菌和重组菌固定化批次发酵与游离发酵的多环芳烃降解量对比图。纵坐标为单位时间内多环芳烃降解量(mg/l)。具体实施方法根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例使用的质粒pxmj19从武汉森灵生物科技有限公司购买。嗜麦芽寡养单胞菌cgmcc1.14975购自cgmcc。如无特别说明，所有酶均从takara购买，质粒提取及胶回收试剂盒从天根购买。实施例1:构建乙二醛酶glo过表达质粒。使用嗜麦芽寡养单胞菌cgmcc1.14975的基因组dna进行pcr，扩增乙二醛酶glo基因。具体而言，使用下述引物1和引物2，在以下反应条件下进行pcr:94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，进行30个循环:扩增了411bp的基因片段(seqidno.2)扩增的序列如seqidno.2所示，含有glo编码序列，以及20bp与载体同源的序列。此外，引物1具有bamhi的限制酶识别位点，引物2具有bamhi的限制酶识别位点。bamhi限制酶识别位点用粗体标出。表1引物1gcctgcaggtcgactctagaggatccatgtcttcactgcaactggt(seqidno.3)引物2aattcgagctcgtacccggggatccttagttttctccactctgggtc(seqidn0.4)将获得的多核苷酸与用限制酶bamhi处理的pxmj19质粒进行一部克隆，得到用于过表达蛋白酶glo基因的重组质粒pxmj19*glo，琼脂糖凝胶电泳见图1，泳道1、2为重组质粒pxmj19，泳道3为原始质粒pxmj19*glo，泳道4为marker。其中，原始的pxmjl9质粒大小为6601bp，而重组质粒pxmj19*glo的大小为7012bp。从图中可以看出glo基因片段已经插入表达质粒pxmji9。实施例2:构建乙二醛酶glo过表达菌株将得到的pxmj19*glo重组质粒导入嗜麦芽寡养单胞菌cgmcc1.14975感受态细胞中，在含有6.5ug/ml氯霉素的lb平板上进行筛选，培养2-3天后挑出转化子，然后进行菌落pcr验证，得到过表达乙二醛酶glo的重组菌株。使用引物3和引物4进行pcr，以证实基因是否插入到重组质粒中。表2引物35'-ggaattgtgagcggataaca-3'(seqidno.5)引物45'-gtatcaggctgaaaatcttc-3'(seqidno.6)改造菌株构造成功后进行96孔板实验。成膜效果提升之后进行固定化连续发酵。实施例3:重组菌多环芳烃降解实验(重组菌固定)所述种子培养基是:蛋白胨5g/l、磷酸二氢钾1g/l、无水硫酸镁0.5g/l，溶剂为水。在含有50ml种子培养基的500ml摇瓶中接入5ml菌液，在28℃,150rpm条件下培养12h，得到种子液。棉纤维载体材料的预处理:将棉纤维载体剪成4cm*4cm的正方形，用纯水洗净烘干后于乙醇中浸泡1h，再用纯水清洗2遍后沸水浴20min后放入烘箱烘干，称重1.5g，121℃条件下灭菌20min。每500ml的摇瓶倒入50ml的含多环芳烃菲150mg/l的废水，加入蛋白胨0.25g、磷酸二氢钾0.05g、无水硫酸镁0.025g，将1g预处理的棉纤维载体也放入其中。向含多环芳烃废水中接入5ml种子液，在30℃,通氧条件下发酵72h。固定化连续发酵:在发酵过程中，第一批时菌体己经吸附到固定化载体上，此时摇瓶培养己经过约72h，第二批时倒掉发酵液，留下吸附着菌的固定化载体，再倒入新的50ml含多环芳烃废水，约60h,测得发酵周期数据，见图3；多环芳烃降解量见图4。随后批次固定化连续发酵均采用此法。对比例1:原始菌固定将实施例3中接入的重组菌更换为原始出发菌(嗜麦芽寡养单胞菌cgmcc1.14975)，其余步骤同实施例3，得发酵周期数据见图3；多环芳烃降解量见图4。对比例2:重组菌的游离发酵(重组菌)发酵培养基中不加入载体，其余步骤同实施例3，测得od570结果见图2，测得发酵周期数据见图3；多环芳烃降解量量见图4。对比例3:原始菌的游离发酵(原始菌)将实施例3中接入的重组菌更换为原始出发菌(嗜麦芽寡养单胞菌cgmcc1.14975)，含多环芳烃废水中不加入载体，其余步骤同实施例3,测得od570结果见图2，测得发酵周期数据见图3；多环芳烃降解量见图4。从图2可以看出，重组菌od570测定结果值较大，说明相比与原始菌成膜能力更强；从图3可以看出，相比于游离发酵，固定化发酵的周期均缩短，其中，重组菌固定化发酵周期比原始菌缩短23.1％；从图4可以看出，相比于游离发酵，固定化发酵多环芳烃降解量均有提升，且重组菌固定化产量比原始菌高36.4％。上述发酵周期的缩短以及多环芳烃降解量的提高均是因为采用固定化发酵和重组菌加强了嗜麦芽寡养单胞菌的成膜能力。序列表<110>南京工业大学<120>一种重组嗜麦芽寡养单胞菌及其在降解多环芳烃废水中的应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>411<212>dna<213>嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)<400>1atgtcttcactgcaactggttgccctgattgtgcatgactatgatccagctatttccttc60tttgttaacaaacttggatttgaactggttgaggataaaccgtcctttactacagacggc120cgcccgaaacgctgggttgttgtccgtccaccaggcagcctaccccaaacagggattctc180ttagctcgagccgatagtcctgaacagagtgctaccgttggtcgacagtttgcaggccgt240gtaggtctattttggcgtgttgatgattttcaagggacctacaacaggctttgcagtcac300ggcattcagtttatatcagagcccagagccgaagaatatggaaacgttgcggtgtttcta360gattttgtgggtaataagtgggatcttcttggacccagtggagaaaactaa411<210>2<211>463<212>dna<213>嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)<400>2gcctgcaggtcgactctagaggatccatgtcttcactgcaactggttgccctgattgtgc60atgactatgatccagctatttccttctttgttaacaaacttggatttgaactggttgagg120ataaaccgtcctttactacagacggccg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