一株枯草芽孢杆菌及其发酵方法和应用

本发明涉及生物环境微生物技术领域，涉及一种枯草芽孢杆菌及其发酵方法以及在水产养殖中养殖水体脱氮的应用。

背景技术：

在水产养殖过程中，养殖水体中氮含量上升会造成养殖体受到不同程度损伤，例如，引发炎症、出血病、摄食下降甚至死亡。因此，养殖水体中的氮含量，是水产养殖水体一个十分重要的检测指标。生物脱氮过程为硝化-反硝化作用，其中硝化作用是在硝化细菌的作用下氨氮转变为亚硝态氮进而转变为硝态氮；而反硝化过程则是指在反硝化细菌作用下硝态氮转变为氮气等并脱离水体，达到彻底净化的过程。硝化作用需在好氧条件下进行，但在实际养殖水产过程中可能会存在低溶氧的情况，因此会对脱氮造成一定困难，所以，一些新型高效脱氮微生物菌种的开发应用将会对传统生物脱氮工艺效率有所提升。

枯草芽孢杆菌在生长周期中可形成芽孢的一类革兰氏阳性菌，可产生细菌素，有一定的抑菌作用。枯草芽孢杆菌还能通过利用自身酶系分解养殖水中的饲料饵料，另外，枯草芽孢杆菌可利用硝酸盐和亚硝酸盐，将其还原为n2，消除水体中的氨氮等污染物，促进有机物的分解和氮循环过程。

技术实现要素：

本发明提供一种应用在水产养殖水体中的脱氮菌株，具有硝化能力。本发明菌株使用生物脱氮技术来达到养殖水产水体净化效果，在高浓度含氮养殖水体中具有高效脱氮能力，并且在低溶氧、低温环境下也具有优秀脱氮效果

具体地，本发明公开了一种枯草芽孢杆菌，发明人于2020年5月在江苏省南京市南京工业大学所采集。其分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)，菌株名为bacillussubtillisnx-2c，已保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏时间为2021年1月15日，保藏编号为cgmccno.21625。

本发明进一步提出了上述枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)nx-2c的发酵生产方法，即将所述枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)nx-2c接种至种子培养基，过夜培养得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中，摇床培养，得到枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)nx-2c发酵液。

其中，种子培养基为蛋白胨5-10g/l，酵母粉2-5g/l，氯化钠1-10g/l；培养条件为在30-37℃，100-200rpm过夜培养得种子液。

具体地，将种子液以1-10％(v/v)接种至发酵培养基中，摇床上30-37℃，100-200rpm培养2-3天，即得脱氮菌株nx-2c发酵液；其中，所述发酵培养基的碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、乙酸钠任意一种或者几种组合，优选地，碳源为葡萄糖、蔗糖其中一种或者两种组合。

所述发酵培养基的氮源为氯化铵、硫酸铵、亚硝酸钠、硝酸钾、蛋白胨、牛肉膏任意一种或者几种组合。优选地，氮源为氯化铵、蛋白胨其中一种或者两种组合。

优选地，所述种子培养基为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。

其中，所述发酵培养基为：蛋白胨5g/l，硫酸铵5g/l，亚硝酸钠5g/l，硝酸钾5g/l，牛肉膏5g/l，氯化铵5g/l，葡萄糖20g/l，蔗糖20g/l。

本发明进一步提出了上述枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)nx-2c在水产养殖中养殖水体脱氮的应用。优选地，所述脱氮菌株所应用的水产养殖对象为常见鱼、虾、蟹。

本发明的枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)nx-2c在以氯化铵、亚硝酸钠、硝酸钾为唯一氮源时脱氮率均在90％以上。其中，脱氮菌株nx-2c可在氯化铵为0.1-3000mg/l进行脱氮；脱氮菌株nx-2c可在亚硝酸钠为0.2-2000mg/l进行脱氮；脱氮菌株nx-2c可在硝酸钾为0.2-1500mg/l进行脱氮。

本发明的枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)nx-2c在应用时的环境要求为：温度5-40℃、溶解氧1-8mg/l、ph5-9。其中，脱氮菌株nx-2c在低温低溶氧仍可保证高效脱氮率。当温度为5-10℃脱氮率达90％，在温度为10-20℃脱氮率达97％，在温度为20-30℃脱氮率达94％，在温度为30-40℃脱氮率可达90％。当溶解氧为1-3mg/l脱氮率达90％，3-5mg/l脱氮率达95％，5-8mg/l脱氮率达97％。

本发明中脱氮菌株nx-2c在10²-10⁷cfu/ml接种量范围内有良好的脱氮能力。将用生理盐水重悬3-5次的菌液加入人工配制污水或者模拟生态实验中，脱氮菌株nx-2c在实验中都有良好的脱氮率。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明脱氮菌株nx-2c兼具异养硝化能力，工艺简单；

(2)能够耐受养殖水产水体高浓度的废氮，投入使用后起效快，操作简单并且无二次污染；

(3)耐受低温低溶氧，适合短期脱氮过程，使用低浓度脱氮菌株也能达到高效脱氮；

(4)具有脱氮快速、稳定的优势，特别适合短期脱氮过程，并且使用较低浓度脱氮菌株也能达到高效脱氮，在脱氮效果不理想情况下可以作为生物修复进行补加，且对养殖体安全性高。

附图说明

图1为脱氮菌株nx-2c镜检图片；

图2为脱氮菌株nx-2c在模拟生态实验中的脱氮效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)nx-2c(下简称脱氮菌株nx-2c)的筛选与鉴定。

脱氮菌株nx-2c由发明人于2020年5月在江苏省南京市南京工业大学镜湖淤泥所采集得到。其分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)，菌株名为bacillussubtillisnx-2c，已保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏时间为2021年1月15日，保藏编号为cgmccno.21625。

筛选过程如下：

筛选固体培养基为：氯化铵5g/l，七水硫酸镁2g/l，磷酸氢二钾3g/l，氯化钠1.5g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l。

优选地，若有菌株在筛选培养基上生长，则判断此菌株可以氯化铵为唯一氮源生长。

判断所述脱氮菌株nx-2c是否能以亚硝酸钠或硝酸钾为唯一氮源生长，将上述培养基中氯化铵用亚硝酸钠或硝酸钾替代即可。

优选地，上述所获得的单菌落接种于种子培养基。

种子培养基为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。过夜培养，od600约为1.2-1.5，以1-10％(v/v)转接于发酵培养基。

发酵培养基为：蛋白胨5g/l，硫酸铵5g/l，亚硝酸钠5g/l，硝酸钾5g/l，牛肉膏5g/l，氯化铵5g/l，葡萄糖20g/l，蔗糖20g/l。摇床上30℃，200rpm/min发酵培养2-3天后，即得脱氮菌株nx-2c的发酵液。

对脱氮菌株nx-2c发酵液进行稀释涂布，取10^-4、10^-5、10^-6三个浓度梯度的稀释液在固体培养基(培养基为：蛋白胨5g/l、氯化铵5g/l、葡萄糖20g/l、琼脂粉20g/l)上均匀涂布。置于30℃恒温培养箱中培养24-48h，通过计数并计算出所述脱氮菌株的活菌数(活菌数范围在1×10⁶-2×10⁸cfu/ml)。

脱氮菌株nx-2c有以下性质：

1、菌落形态学特征

在蛋白胨琼脂培养基30℃培养24h后显微镜观察到细胞为单细胞，杆状，菌体长1.4-2.0μm，宽0.7-1.0μm。属于革兰氏阳性菌、兼性厌氧。在上述培养基中30℃培养24h菌体可以大量生长，菌落呈白色，圆形，表面光滑干燥，中间隆起。其生长的温度范围是5-48℃，最适温度为25-35℃，生长的ph范围是5.0-9.5，最适ph为6.5-8.5。

2、16srdna序列分析

16srdna序列长度1442bp，核苷酸序列见序列表。将16srdna序列和genebank数据库中的相关种进行比较。结果表明：脱氮菌株nx-2c与枯草芽孢杆菌达到100％同源。所以认定本发明的菌株为枯草芽孢杆菌(bacillussubtillis)，具体为bacillussubtillisnx-2c。

实施例2脱氮菌株nx-2c在人工配制污水中的脱氮效果。

人工配制污水为：氯化铵0.2g/l，亚硝酸钠0.1g/l，硝酸钾0.1g/l，葡萄糖20g/l，氯化钠1g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，七水硫酸镁0.1g/l，硫酸锰0.2g/l；其中含氨氮68mg/l，亚硝态氮67mg/l，硝态氮61mg/l。

所述的脱氮菌株nx-2c和枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436均以10⁴cfu/ml的终浓度加入人工配制污水中作为实验组，对照组加入等体积的生理盐水，每组3个重复。

其中，上述的枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

氨氮检测方法采用靛酚蓝比色法，测定样品中残留的氨氮含量，计算降解率，如表1所示。

亚硝态氮检测方法采用重氮化偶合分光光度法，测定样品中残留的亚硝态氮含量，计算降解率，如表1所示。

硝态氮检测方法采用紫外分光光度法，测定样品中残留的硝态氮含量，计算降解率，如表1所示。

脱氮菌株nx-2c和枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436在不同氮源耐受浓度区间([0.1,0.5]，[10,50]，[100,500]，[800,1500]，[1500,2000]，[2000,3000]mg/l)进行实验。

在ph为7、温度为30℃、溶解氧为5mg/l的培养条件下，实验将脱氮菌株nx-2c和枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436接种于上述人工配制污水100ml中，200rpm/min震荡培养。每隔12h检测其氨氮、亚硝态氮、硝态氮含量，需至少检测48h。

检测菌株脱氮率，计算方法如下：。

具体数据如下表所示：

表1不同氮源浓度区间下脱氮菌株nx-2c和no.1.4436的脱氮能力

如表1所述，脱氮菌株nx-2c在各氮源浓度区间都有良好的脱氮效果，脱氮效率均在92％以上，可耐受氨氮3000mg/l，亚硝态氮2000mg/l，硝态氮1500mg/l。其中在浓度区间为[10,50]脱氮菌株nx-2c的脱氮率最高，降解人工配制污水中氨氮、亚硝态氮、硝态氮含量分别可达98％、96％、95％。而枯草芽孢杆菌cgmccno.1.443不仅不耐受高浓度氮而且其脱氮效果在任一区间浓度中表现都不如脱氮菌株nx-2c。

实施例3脱氮菌株nx-2c在不同温度的脱氮效果。

人工配制污水同实施例2。

所述的脱氮菌株nx-2c和枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436均以10⁴cfu/ml的终浓度加入人工配制污水中，对照组加入等体积的生理盐水，每组3个重复。

在不同温度(5、10、15、20、25、30、35、40℃)培养条件下，脱氮菌株nx-2c和枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436接种于上述人工配制污水100ml中200rpm/min震荡培养。期间每隔12h检测其氨氮、亚硝态氮、硝态氮含量，需检测至少48h。

表2不同温度下脱氮菌株nx-2c和no.1.4436脱氮率

如表2所述，脱氮菌株nx-2c在宽范围的温度的条件下，仍然保持较高的脱氮能力。在温度较低时(5-10℃)，三氮脱氮率均在90％以上，脱氮菌株nx-2c在10-20℃脱氮率最高，均在95％以上。枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436虽然在脱氮效果上并不及脱氮菌株，但与nx-2c表现相同的是，其脱氮效果最优的温度区间为10-20℃。这可能表明枯草芽孢杆菌在此温度下生长速度快，因此脱氮率高。

实施例4脱氮菌株nx-2c在不同溶解氧下的脱氮效果。

人工配制污水同实施例2。

所述的脱氮菌株nx-2c和枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436均以10⁴cfu/ml的终浓度加入人工配制污水中，对照组加入等体积的生理盐水，每组3个重复。

在不同溶解氧(1-3、3-5、5-8mg/l)培养条件下，脱氮菌株nx-2c和枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436接种于上述人工配制污水100ml中震荡培养。期间每隔12h检测其氨氮、亚硝态氮、硝态氮含量，需检测至少48h。

所述实验过程中，实验将通过调整摇瓶装液量以及摇床转速控制溶解氧，用水产水质溶解氧检测仪检测其溶解氧即可。

表3不同溶解氧下脱氮菌株nx-2c以及no.1.4436菌株的脱氮能力

如表3所述，在溶解氧较低时(1-3mg/l)，三氮脱氮率均在90％以上；当溶解氧在3-5mg/l，脱氮率较低溶氧时有提高，当溶解氧为5-8mg/l时，此时溶解氧达到养殖水体溶解氧的适应范围，因此脱氮率为最优。因此本发明脱氮菌株nx-2c在水产养殖水体净化中受温度、溶解氧因素限制较小。枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436在溶解氧低的条件下，脱氮率低至40％以下，但在溶解氧充足的情况下，脱氮率有所改善，但其脱氮率均远低于脱氮菌株nx-2c。

实施例5脱氮菌株nx-2c在不同接菌量下的脱氮效果

人工配制污水同实施例2。

所述的脱氮菌株nx-2c和枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436均以不同接种量(10²-10⁷cfu/ml)加入人工配制污水中，对照组加入等体积的生理盐水，每组3个重复。

在ph为7，温度为30℃，溶解氧为5mg/l的培养条件下，实验将脱氮菌株nx-2c和枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436按不同接种量接种于上述人工配制污水100ml中，200rpm/min震荡培养。每隔12h检测其氨氮、亚硝态氮、硝态氮含量，需检测至少48h。

表3不同氮源浓度区间下脱氮菌株nx-2c以及no.1.4436菌株的脱氮能力

如表3所述，脱氮菌株nx-2c在接菌量较低时仍能保持优异的脱氮效果，在不同接种量下均保持90％以上的脱氮率。其中接菌量10⁷cfu/ml的实验组，在48h检测后，三氮残留量均小于1.5mg/l，脱氮率均为98％。其中，枯草芽孢杆菌cgmccno.1.4436与脱氮菌株nx-2c在不同接菌量下脱氮表现相同趋势，均为接菌量越高则脱氮率越高。

在实际应用过程中，这将脱氮菌株nx-2c在低接菌量下也具有高效脱氮，这对水产养殖环境减少不必要的生物污染，体现了脱氮菌株nx-2c对环境友好、无二次污染的特点。

实施例6脱氮菌株nx-2c在模拟生态实验中的脱氮效果。

模拟生态实验中罗非鱼育苗购买于江苏省南京市菱湖育苗基地。实验选择体质健壮，规格基本一致的罗非鱼，初始体重(6.5±0.05g)，随机分为2组，设对照组和实验组，每组3个重复，放入6个可控温圆形蓄养槽(高700mm)内进行养殖，每个储蓄槽放养25尾。

实验前，需将罗非鱼鱼苗在蓄养槽中预养两周左右。实验前3天需每天检测三氮含量，当数值维持在一个相对稳定的范围内即可开始实验，其数值为初始氮源含量。实验前检测初始氨氮在26mg/l左右，亚硝态氮在20mg/l左右，硝态氮在15mg/l左右。

脱氮菌株nx-2c发酵后经生理盐水反复重悬3-5次，以10⁴cfu/ml的接菌量投入上述蓄养槽内，实验期间不换水，每天进行投食2次，实验进行一周，每天需检测其氨氮、亚硝态氮、硝态氮含量。

由图2可见，脱氮菌株nx-2c在模拟生态实验中对三氮的降解效果均在90％以上，并且在降解后均未出现反弹的现象，具有脱氮快速、稳定的优势。特别适合短期脱氮过程，并且使用较低浓度脱氮菌株也能达到高效脱氮，在脱氮效果不理想情况下可以作为生物修复进行补加。实验期间，鱼苗并未出现死亡现象，推断脱氮菌株nx-2c对养殖体安全性高。

序列表

<110>南京工业大学

<120>一株枯草芽孢杆菌及其发酵方法和应用

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