一株抑菌能力强的丁酸梭菌及其应用

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株抑菌能力强的丁酸梭菌及其应用。

背景技术：

丁酸梭菌属于梭菌属，是一种严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，周生鞭毛，细胞直或稍弯，内生孢子卵圆，培养过程中发酵产酸产气。该菌是人和动物肠道的正常菌群，也常在环境中发现。丁酸梭菌可产生大量的短链脂肪酸，如丁酸盐和乙酸盐等。研究表明，丁酸可通过抑制nf-κb活化或上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达等方式发挥抗炎活性，进而控制病原菌生长，改善肠道菌群紊乱。丁酸梭菌还可增强动物的免疫功能，修复脏器损伤，并提高动物生产性能。此外，丁酸梭菌还能够分解胺类等有害物质，改善养殖环境。

目前，丁酸梭菌已经做为饲料添加剂被广泛使用，其作为抗腹泻类抗生素的替代产品已经在无抗养殖中起到了替抗效果，作用显著。但有些丁酸梭菌菌株可产梭菌毒素或肉毒毒素，如携带e型肉毒毒素的丁酸梭菌被认为是婴儿肉毒中毒或早产儿坏死性小肠结肠炎的原因之一。当前国内丁酸梭菌产品中的菌株特性不一，效果不同，且未对丁酸梭菌进行毒素基因与耐药谱方面的安全性评估。因此，筛选产酸能力高、抑菌能力强、抗逆性好、芽孢转化率高且安全性好的丁酸梭菌是其广泛推广应用的一种重要途径，也对未来规范丁酸梭菌微生态制剂使用具有重要参考价值。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株抑菌能力强的丁酸梭菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一株丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1，该菌株已于2021年04月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：cgmccno.22258。

所述丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1分离自spf鸡粪便，具有如下特征：

(1)所述丁酸梭菌菌株fw1在rcm固体培养基上菌落呈白色不透明，边缘不规则。rcm液体中见白色絮状沉淀，生长代谢时产酸产气。

(2)所述丁酸梭菌菌株fw1基因组上不具有梭菌毒素和肉毒素基因，对氧氟沙星、头孢类、青霉素类、新霉素、万古霉素及四环素均敏感，具有良好的应用安全性。

(3)所述丁酸梭菌菌株fw1耐酸能力和耐胆盐能力强，在ph1.5～3.0孵育1hr后，其存活率均高于75％以上；在3％胆盐中室温处理12hr后，其存活率仍可达83％±2.1％。

(4)所述丁酸梭菌菌株fw1对高温耐受力强，在95℃处理5min时其存活率约19％±2.0％，表明该菌株可以耐受饲料熟化等制备中的高温，可用于饲料添加剂生产。

(5)所述丁酸梭菌菌株fw1对大肠杆菌、沙门氏菌、摩氏摩根菌、肺炎克雷伯菌等均具有良好的杀菌、抑菌能力。其培养24hr的上清液在37℃作用4～24hr，可直接杀灭上述病原菌，活菌数可从10⁷cfu/ml降至0～100cfu/ml。

本发明的第二方面，提供丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1的发酵液、菌悬液和/或上清液。

所述发酵液具体可为如下方法制备的发酵液：将丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1接种到rcm培养基中，厌氧培养24～72h；

所述菌悬液具体可为如下方法制备的菌悬液：将发酵液离心后，菌体沉淀用无菌水重悬，获得菌悬液。

所述上清液具体可为如下方法制备的上清液：将发酵液离心后，取上清，过滤，获得上清液。

本发明的第三方面，提供上述丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1的发酵液、菌悬液和/或上清液在制备抑菌用组合物中的用途。

上述用途中，所述抑菌用组合物对选自大肠杆菌、沙门氏菌、摩氏摩根菌和肺炎克雷伯菌中的一种及以上的细菌具有抑菌活性。

上述用途中，所述抑菌用组合物为食品、食品添加剂、饲料或饲料添加剂形态。

本发明的第四方面，提供上述丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1在发酵生产丁酸中的用途。

本发明的第五方面，提供一种具有抑菌活性的微生态制剂，所述微生态制剂以上述丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1的发酵液、菌悬液和/或上清液为活性成分。

上述微生态制剂可以以本发明的丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1的发酵液、菌悬液和/或上清液作为唯一活性成分；还可以与其他的抑菌物质复配使用，得到与之相当或者更好的抑菌效果。

上述微生态制剂可以被制备成各种使用形式，如液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂等，经喷雾、注射或口服等方式使用。

本发明的第六方面，提供包含上述丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)fw1的发酵液、菌悬液和/或上清液为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂。

本发明的有益效果：

(1)本发明所筛选的丁酸梭菌不具有梭菌毒素和肉毒毒素基因，且耐药谱窄，其作为微生态制剂的安全性可得到充分保证。

(2)本发明所筛选的丁酸梭菌具有较强的抑菌能力，并且菌株及菌株发酵后的上清液均可对大肠杆菌、沙门氏菌、摩氏摩根菌、肺炎克雷伯菌等病原菌具有良好的杀菌、抑菌能力。

(3)本发明所筛选的丁酸梭菌耐酸、耐胆盐和耐高温能力强，在饲料及饲料添加剂生产中具有良好的应用推广潜力。

附图说明

图1：本发明提供的丁酸梭菌菌株fw1在rcm平板上的形态；

图2：本发明提供的丁酸梭菌菌株fw1质谱检测结果；

图3：本发明提供的丁酸梭菌菌株fw116srdna序列blast结果；

图4：本发明提供的丁酸梭菌菌株fw1毒素基因pcr结果；

图5：本发明提供的丁酸梭菌菌株fw1生长曲线测定结果；

图6：本发明提供的丁酸梭菌菌株fw1产酸能力测定；

图7：本发明提供的丁酸梭菌菌株fw1对沙门氏菌的抑菌圈测定；

图8：本发明提供的丁酸梭菌菌株fw1培养上清液对大肠杆菌、沙门氏菌、摩氏摩根菌和肺炎克雷伯菌的抑菌能力。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：

强化梭菌培养基(rcm)：蛋白胨10.0g/l，牛肉粉10.0g/l，酵母粉3.0g/l，葡萄糖5.0g/l，可溶性淀粉1.0g/l，氯化钠5.0g/l，醋酸钠3.0g/l，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g/l，琼脂0.5g/l，ph值6.8±0.1。

摩氏摩根菌mm4分离自江苏某养殖场330日龄蛋种鸡的粪便，对青霉素类、红霉素和链霉素等抗生素耐药；肺炎克雷伯菌a2312nm分离自杭州某肺炎病人粪便，对碳青霉烯类抗生素耐药；公众可通过山东农业大学获得上述菌株以重复本实验。

实施例1：菌株的分离筛选

取巴布考特spf蛋鸡鸡只粪便进行分菌试验：准确称取粪便样品5g，加入到50ml生理盐水中，制备混悬液；将混悬液于85℃水浴10min，取震荡混匀的稀释液1ml加入到5mlrcm培养基中，37℃厌氧增菌48h；取上述增菌液再次85℃水浴10min，按上述步骤重复1次rcm增菌，以三线法接种于rcm平板(rcm平板是在rcm培养基中添加15g/l的琼脂)，厌氧培养24～48h；待菌落长出后，挑选菌落形态不规则、白色或黄白色的单菌落于rcm平板上再次进行划线纯化，如此重复两次。菌株在rcm平板上的形态如图1所示。

实施例2：菌株的鉴定

挑取经2次划线纯化后培养48h、边缘不规则的疑似丁酸梭菌菌落，将其命名为fw1，按照微生物质谱鉴定沙门菌说明书进行菌种鉴定。用牙签挑取单菌落涂布于msp96targetpolishedsteelbc上，先加入1μl标准溶剂，待晾干后，再加入1μl基质溶液，晾干，使用布鲁克全自动快速生物质谱检测仪鉴定，结果显示为丁酸梭菌(图2)。

进一步提取菌株fw1的基因组，采用16srdna通用引物(27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；1492r：5’-ggctaccttgttacgactt-3’)进行pcr扩增，反应体系25μl：mix12.5μl，ddh2o9.5μl，上下游引物各1μl，dna模板1μl。pcr反应条件为：95℃预变性5min，(95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min40s)30×，72℃，5min。对pcr产物进行测序并进行blast比对与分析，图3结果显示，其序列与丁酸梭菌1005-15098序列一致性最高，达95％以上。这些结果表明，该分离株fw1为丁酸梭菌。

将分离得到的丁酸梭菌clostridiumbutyricumfw1进行生物保藏，保藏信息如下：

保藏时间：2021年04月29日；

保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)；

生物保藏号为：cgmccno.22258。

实施例3：丁酸梭菌菌株fw1药敏实验评估耐药谱

选用8种对革兰阳性菌有效的抗生素药敏片：氧氟沙星、头孢吡肟、新霉素、呋喃妥因、氟苯尼考、红霉素、万古霉素、四环素，以无菌棉签将增菌24h的菌液均匀涂布于rcm平板上，每个平板等距离贴三种药敏纸片，培养基37℃厌氧培养18h后量取抑菌圈直径，按照世界卫生组织所推荐的kirby-bauer法(k-b法)和美国临床实验室标准化协会(clsi)手册对实验结果进行判定。结果如表1所示，丁酸梭菌菌株fw1对上述8种抗生素均表现为敏感。

表1丁酸梭菌菌株fw1对8种抗生素的敏感性结果

实施例4：丁酸梭菌菌株fw1毒素基因评估验证实验

根据fao/who2006年颁布的益生菌评价指南，选用4种梭菌毒素和4种肉毒毒素基因引物对菌株fw1进行pcr检测，以评估其安全性。4种梭菌毒素基因分别为：alpha毒素cpa、beta毒素cpb、epsilon毒素cpe和iota毒素cpi，4种肉毒毒素基因分别是typea、b、e和f。引物序列及退火温度见表2、序列表中seqidno.3-seqidno.18。

表2毒素基因pcr用引物

pcr结果如图4所示，使用上述8对毒素基因引物进行扩增均未得到任何pcr产物，表明本发明提供的丁酸梭菌菌株fw1不携带上述任何毒素基因。

实施例5：丁酸梭菌菌株fw1耐酸和耐胆盐能力测定

取发酵48hr的菌液离心重悬于pbs缓冲液中，制备成初始菌悬液，浓度约为10⁷cfu/ml。取20μl菌悬液分别加入到ph为1.5、2或3的缓冲液中，室温处理1hr后立即调ph至7.0，稀释涂板计数，结果fw1菌株的存活率分别为75％±1.1％、102.7％±1.4％和112.2％±1.2％。取20μl菌悬液分别加入到0.3％和3％的胆盐缓冲液中，室温条件下处理12hr，稀释涂板计数，结果fw1菌株的存活率分别为102％±2.1％和91.2％±2.4％(表3)。这些结果表明，丁酸梭菌菌株fw1具有良好的耐酸和耐胆盐能力，可以抵御胃酸和适应肠道内环境，保持较高活力。在95℃处理5min时其存活率约19％±2.0％，对高温耐受力强，表明该菌株可以耐受饲料熟化等制备中的高温，可用于饲料添加剂生产。

表3丁酸梭菌菌株fw1耐酸和耐胆盐能力测定结果

实施例6：丁酸梭菌菌株fw1的生长曲线测定

挑取厌氧培养24hr的丁酸梭菌fw1单菌落3～5个于1ml生理盐水中，振荡混匀后取100μl菌悬液加入到含5mlrcm的螺口瓶中，于37℃培养箱中严格厌氧培养，每隔24hr取样测定od600nm并稀释涂板计数，结果显示，在4-12hr菌株处于对数生长期，ph值从7.0迅速降低到4.2，之后处于稳定期，芽孢数从0hr的10²cfu/ml增加到10⁷cfu/ml，具有良好的生长繁殖性能(图5)。

实施例7：丁酸梭菌产酸能力测定

取于液体rcm厌氧培养30hr的丁酸梭菌培养液3ml，设定3个重复，采用气质联用方法测定培养液中的短链脂肪酸含量，结果如图6显示，fw1菌株产丁酸含量约为732.5μg/g，极显著(p<0.01)高于江苏三仪生物工程有限公司丁酸梭菌菌粉中分离的丁酸梭菌(命名为sam株)的丁酸量(646μg/g)；但两者产乙酸含量无显著性差异。以上结果表明，丁酸梭菌fw1具有良好的产丁酸能力。

实施例8：丁酸梭菌菌株fw1对致病菌的抑菌能力检测

取于rcm培养基厌氧培养24hr的丁酸梭菌液体，选取沙门氏菌cvcc3377、大肠杆菌j56为指示菌，采用牛津杯法测定其抑菌能力。结果如图7所示，在培养9hr，丁酸梭菌可分别对大肠杆菌j56和肠炎沙门氏菌cvcc3377产生直径约12mm和14mm的抑菌圈，表明丁酸梭菌菌株fw1可显著抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长。

同时，取上述丁酸梭菌菌液12,000rpm离心2min，0.22μm水系滤器过滤上清备用。取该上清按33％比例(体积比)加入lb培养基中，再分别加入大肠杆菌j56、沙门氏菌cvcc3377、摩氏摩根菌mm4和肺炎克雷伯菌a2312nm至终浓度10⁷cfu/ml，在3、8hr和24hr取样测定od600并稀释点板计数；以添加等体积生理盐水代替丁酸梭菌菌液作为对照。结果如图8所示(图8中的横坐标单位为hr)，在培养8hr，丁酸梭菌可将大肠杆菌和沙门氏菌降低至100cfu/ml；对摩氏摩根菌而言，fw1则可在3hr显著杀灭至检测限10cfu/ml以下；对肺炎克雷伯菌而言，fw1菌株可在24hr内抑制其生长繁殖，使菌数维持在10⁶cfu/ml左右，显著低于对照组。这些结果表明，丁酸梭菌fw1菌株可显著抑制大肠杆菌、沙门氏菌、摩氏摩根菌和肺炎克雷伯菌等病原菌的生长繁殖。

摩氏摩根菌(morganellamorganii)属于摩根菌属，摩根菌属只有摩氏摩根菌一个种。摩氏摩根菌常寄生于人和动物的肠道内，系临床不常见的但是重要的条件致病菌。摩氏摩根菌可引起呼吸道、伤口、泌尿道、胆囊、血液及眼部等部位的感染。同时摩氏摩根菌对青霉素类、苯唑西林、头孢菌素、头孢泊肟、林可酰胺类抗生素，糖肽类、磷霉素等都存在天然耐药性，导致摩氏摩根菌感染治疗时药物选择受到限制。肺炎克雷伯菌属于肠杆菌科克雷伯氏菌属，兼性厌氧菌，多数菌株有菌毛和较厚的荚膜，是广泛分布于自然界的一种条件致病菌，其中肠道是该菌属细菌定植的常见部位。它不仅是我国目前临床上耐药最为严重的病原菌，而且近年来对畜禽危害也越来越严重，如仔猪、家兔及毛皮动物的肺炎，雏鸡、仔猪腹泻，产后奶牛急性败血症，大熊猫血尿症等。

本发明首次发现，本发明分离的丁酸梭菌fw1对摩氏摩根菌、肺炎克雷伯菌具有极为显著的抑菌活性，这对于摩氏摩根菌与肺炎克雷伯菌感染的治疗具有重要的价值。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

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