一株具有抑菌作用的山南链霉菌A148及其应用

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有抑菌作用的山南链霉菌a148及其应用。

背景技术：

我国是一个拥有14亿多人口的农业大国，农业具有十分重要的经济基础地位，关系着国计民生与社会稳定。然而，随着植物病害的频发，农作物生长受阻、产量和品质降低，再加上人口资源不断增加，可耕地面积急剧减少，导致全世界粮食的供给问题日益突出。长期以来，化学农药在植物病害防治方面发挥了重要作用。然而化学防治也给环境带来一定的危害，同时也会破坏土壤微生态平衡。随着环境问题的日益严峻，人们对绿色食品的需求日益迫切，采用无公害的生物防治代替化学药品防治已成众望所归。

生物防治是指在农业生态系统中，通过引入一种或几种有益微生物或其代谢产物来抑制病原菌的繁殖与入侵，促进植株生长，减少病害的发生。生物防治因具有安全无毒、无污染、无残留、高效及同时对作物有促生作用等特点而引起越来越多的关注和重视，成为目前研究和开发的热点，应用前景广阔。有益微生物包含了细菌、放线菌、真菌和病毒等，其通过诱导植物防御酶系统产生抗体，增强植物抗病性，活化土壤养分，诱导植物激活降解毒素的机制，部分有益菌还可以促进植物生长、提高植物对营养的吸收利用率。

放线菌是最早应用到生产中的生防微生物，放线菌种类繁多，代谢功能各异，是一类有着广泛实用价值的微生物资源。放线菌能够增强作物抗病性，促进作物生长，提高作物品质，是生物防控中最常用也是最有效的菌种之一。链霉菌属于放线菌的一种，是主要的产抗生素菌群。产生的抗生素可以抑制多种病原菌的生长，链霉菌因其产孢量大，易于制成活细胞制剂如孢子粉剂、种衣剂等优点被广泛应用于农业病害防治。因此，筛选出对植物病原菌有较强拮抗效果的微生物，为新型抗生素的开发提供新的菌种和理论依据，为植物病害的生物防治提供理论参考和实践基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一株具有抑菌作用的山南链霉菌a148及其应用。本发明从小麦田的土壤中分离筛选获得了一株孢子呈蓝色的山南链霉菌a148，且通过实验验证山南链霉菌a148对多种植物病原菌具有较强的抑制作用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株具有抑菌作用的山南链霉菌a148，所述山南链霉菌a148的分类命名为山南链霉菌streptomycessannanensis，保藏编号为cgmccno.21790。

进一步的，所述山南链霉菌a148具有气生菌丝和基生菌丝；气生菌丝呈近直角分枝状态，白色至灰色；基生菌丝呈黄色至橙色。

进一步的，所述山南链霉菌a148的气生菌丝在isp2培养基上生长最好，在isp5与营养琼脂培养基上无生长。

进一步的，所述山南链霉菌a148在isp2培养基上产生少量黄棕色的水溶性色素。

进一步的，所述山南链霉菌a148孢子链呈紧密螺旋形；孢子丝呈红褐色，孢子成熟后从孢子链上断裂开；孢子呈近柱形，浅蓝色。

进一步的，所述山南链霉菌a148的适宜生长ph值范围为ph7-9。

进一步的，所述山南链霉菌a148的适宜生长盐度范围为1-2％。

本发明还提供了所述的山南链霉菌a148在用于制备防治植物病原菌的生防制剂中的应用。

进一步的，所述植物病原菌包括禾谷镰孢菌、燕麦镰刀菌、禾谷丝核菌、尖孢镰刀菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌、灰霉病菌和禾顶囊壳菌。

进一步的，所述山南链霉菌a148能够明显抑制禾谷镰孢菌、燕麦镰刀菌、禾谷丝核菌、尖孢镰刀菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌、灰霉病菌和禾顶囊壳菌。

进一步的，所述植物包括小麦、大麦、玉米、水稻、苹果、番茄、青稞、蚕豆、柑橘、葡萄和黄瓜。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1、本发明所述的山南链霉菌a148是从小麦田的小麦根部地表10cm以下的土壤中筛选并经过分离和纯化得到的，其具有性状稳定、培养简单、效果明显、适用条件较广以及不会造成环境污染等优点。

2、本发明的山南链霉菌a148可以水解淀粉，可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇为唯一碳源，对阿拉伯糖、木糖的利用能力弱；并且其具有较强的拮抗活性，可以有效的抑制多种植物病原菌，尤其是抑制禾谷丝核菌、尖孢镰刀菌的效果最好，进而能够减少多种植物的病害，不仅能够提高植物品质和产量，同时还不会给动植物带来致病性，有利于保障农作物的种植和农业生产，因此具有很好的应用价值。

附图说明

图1为山南链霉菌a148孢子链与孢子形态的光学显微镜观察图。

图2为山南链霉菌a148在不同培养基上的菌落特征图。

图3为山南链霉菌a148的16srrna基因扩增产物电泳结果图。

图4为采用邻接法构建山南链霉菌a148的16srrna基因系统进化树。

图5为山南链霉菌a148对植物病原真菌抑制作用结果，其中1为禾谷镰孢菌；2为燕麦镰刀菌；3为尖孢镰刀菌；4为禾谷丝核菌；5为禾顶囊壳菌：6为苹果轮纹病菌：7为苹果腐烂病菌；8为灰霉病菌。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司处购买。

本发明所用的培养基的配方如下：

1、马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂粉15g。

2、高氏合成一号琼脂培养基：可溶性淀粉20g；硝酸钾1g；磷酸氢二钾0.5g；七水硫酸镁0.5g；氯化钠0.5g；七水硫酸亚铁0.01g；琼脂粉15g；水1000ml；ph自然。

3、酵母麦芽精琼脂(yeastextract-maltextractagar，isp2)培养基：麦芽糖提取物10g；酵母提取物4g；葡萄糖4g；琼脂粉15g；水1000ml；ph：7.2-7.4。

4、燕麦琼脂(oatmealagar，isp3)培养基：微量盐溶液1ml；燕麦片20g，煮沸20min后过滤定容至1000ml；琼脂粉15g；水1000ml。

其中，微量盐溶液的配制为：四水氯化锰0.1g；七水硫酸亚铁0.1g；七水硫酸锌0.1g；水100ml，于4℃贮存备用。

5、无机盐淀粉琼脂(inorganicsalts-starchagar，isp4)培养基：微量盐溶液1ml；可溶性淀粉10g；硫酸铵2g；氯化钠1g；七水硫酸镁1g；磷酸氢二钾1g；碳酸钙2g；琼脂粉15g；水1000ml；ph自然。

6、甘油天门冬素琼脂(glycerol-asparagineagar，isp5)培养基：微量盐溶液1ml；l-天冬酰胺1g；甘油10g；磷酸氢二钾1g；葡萄糖1g；琼脂粉15g；水1000ml；ph自然。

上述培养基配制完成后，均采用121℃高压灭菌20min。

实施例1：山南链霉菌streptomycessannanensisa148的筛选

1、菌株分离

采集山东省潍坊市潍坊农科院试验基地小麦田的小麦根部地表10cm以下的土壤，将其装入无菌样袋中并于-4℃保存备用。

菌株分离采用土壤稀释涂布平板法。将采集的土壤风干，称取30g土样，剔除植物残体等杂质，用研钵研成粉末状。加入270ml无菌水，于磁力搅拌器上搅拌30min，静置一会儿，取上清液3ml加入27ml无菌水，即成为10^-2的土壤悬液，混匀后，再用无菌移液管吸取10^-2土壤悬液3ml加入27ml无菌水，如此重复制成10^-3、10^-4、10^-5及10^-6的稀释液。从每个浓度梯度的土壤稀释液吸取0.1ml到高氏合成一号琼脂培养基中，用涂布器均匀涂于培养基表面，每个浓度各3个重复，28℃恒温培养。

2、菌株纯化

待涂布平板培养3-4天后，开始挑取单菌落，一直培养10天。采用平板划线分离的方法进行菌种纯化与培养，将菌种接种到高氏合成一号琼脂培养基上，将其培养5-15天，纯化2次后再进行保存。

3、菌株保存

采用斜面保藏法。待纯培养放线菌生长成熟后，划线于高氏合成一号琼脂斜面上，编好编号，存于冰箱4℃。长期保存则采用甘油悬液保存法。挑取放线菌孢子于高氏合成一号琼脂培养液中，28℃，200r/min的条件下培养4至7天。制备灭菌的40％的甘油，按1∶1的比例将菌悬液与甘油混合，保存在2ml冻存管中，于-80℃保藏。

4、菌株筛选

以禾谷镰孢菌、燕麦镰孢菌、尖孢镰刀菌、禾谷丝核菌以及禾顶囊壳菌小麦变种为小麦土传病害指示病原真菌，采用五点平板对峙的方法进行拮抗菌株的筛选。用pda培养基活化上述病原真菌，用直径5mm的打孔器在新鲜的菌落边缘打孔，用灭菌牙签挑取菌饼放在琼脂板中间位置。在生长成熟的待测菌株平板上，同样用打孔器打孔，挑取新鲜待测菌株接种在距指示菌菌饼3cm的位置，有菌面朝上。每板接4个待测菌株，呈十字交叉形，封口膜封好后于28℃恒温倒置培养。接种禾谷镰孢菌与燕麦镰孢菌的平板，4天后观察试验结果；接种尖孢镰孢菌、禾谷丝核菌以及禾顶囊壳菌的平板，7天后观察试验结果。对初筛得到有效菌株再进行复筛，每个菌株3个重复。通过平板对峙筛选试验，筛选出具有较广谱拮抗能力以及较强拮抗活性的菌株，其中一株定名为a148。

实施例2：山南链霉菌a148的鉴定

一、菌株a148的形态学特征及生物学特性

1、菌株a148的菌落特征观察

(1)显微镜观察

采用插片法观察菌株a148的菌体形态，先在高氏合成一号琼脂培养基上划线接种，平板宜稍厚，划线时尽量紧密，盖玻片与接种线垂直以45°角斜插入培养基，注意不要穿透培养基。28℃培养1-2周，待菌株生长成熟后观察。镜检时，用镊子小心取出盖玻片，用乙醇擦去一侧的菌体，将有菌的一面向上放在一片干净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜和油镜在不同层面进行观察，并参照e.b.shirling和d.gottlieb的方法记录基内菌丝生长状态、产孢菌丝的形态、孢子链与孢子形态等。结果如图1所示，菌株a148孢子链呈紧密螺旋形，属于“s”(spiral)型；气生菌丝近直角分枝状态，孢子丝红褐色，孢子成熟后从孢子链上断裂开，孢子近柱形，浅蓝色。

(2)培养特征观察

将菌株a148分别划线接种于isp2培养基、isp3培养基、isp4培养基、isp5培养基、高氏一号和营养琼脂等固体培养基上，28℃培养2周，待菌株生长成熟时，观察并记录基生菌丝的颜色、有无气生菌丝、气生菌丝的颜色、有无可溶性色素产生及其颜色。结果如表1所示，菌株a148菌落形态在各种培养基上生长时差异较大，气生菌丝白至灰色，在isp2培养基上生长最好，在isp5与营养琼脂上无生长，基生菌丝黄色至橙色，另外该菌只在isp2培养基上产生少量黄棕色的水溶性色素。

另外，菌落特征如图2所示，菌株a148菌落形态在各种培养基上生长时差异较大，菌株a148在isp2培养基上菌落呈类圆形，灰白色，表面粗糙凹凸不平，不透明，近边缘处有一白圆环，边缘不规则。菌株a148在isp3培养基上菌落呈圆形，灰黄色至灰白色，内侧有一棕黑色圆环，外侧有一形状不规则的白环，边缘不规则，且其外围有呈灰黄色的不透明圈。菌株a148在isp4培养基上菌落呈圆形，黄白色，靠近菌落中心有一黄色圆环，表面粗糙，其外侧有一较粗的白色圆环，边缘不清晰。菌株a148在isp5培养基上菌落呈不规则的类圆形，黄色，表面湿润、凹凸不平，边缘曲折。菌株a148在高氏一号培养基上菌落呈圆形，橙色，由中心向外菌落表面上具有浅褐色、深褐色和白色菌丝，最外侧具有一白色菌丝圆环，边缘不清晰，其外围有黄色的不透明圈。

表1：菌株a148的培养特征

2、菌株a148的ph适应范围

取新鲜菌株a148分别接种于ph值为4、6、7、8、9、10、11的bennett培养液中，28℃、200r/min培养1-2周，每个菌株3个重复。

结果如表2所示，菌株a148的适宜生长ph值范围为ph7-9。

表2：菌株a148在不同ph值下的生长

注释：“+”生长，“-”不生长

3、a148菌株的耐盐特性

取新鲜菌株a148分别接种于含1％、2％、5％、7％、10％、11％nacl的bennett培养液中，28℃、200r/min摇培1-2周，每个菌株3个重复。

结果如表3所示，菌株a148的适宜生长盐浓度为1-2％。

表3：菌株a148在不同nacl浓度下的生长

注释：“+”生长，“-”不生长

4、菌株a148的生理生化指标

参考《放线菌系统学——原理、方法及实践》、《放线菌系统分类技术》的方法测定菌株各项生理生化指标。结果如表4所示，表明菌株a148的硫化氢产生、类黑色素产生、脂酶产生测试为阳性，明胶液化、mr与v-p测试为阴性，不能利用柠檬酸盐，不能降解羧甲基纤维素，可以产生h2o2，并使牛奶凝固与胨化，可以水解淀粉，可利用葡糖糖、蔗糖、果糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇为唯一碳源，对阿拉伯糖、木糖的利用能力弱，不能利用甘露醇。

表4：菌株bw9生理生化鉴定结果

注释：“+”阳性，“-”阴性

二、菌株a148的16srrna鉴定

取1.5ml离心管，加入20-50μl无菌水，用枪头挑取菌株a148的单菌落加入水中，吸打混匀，置沸水浴中加热，2min后取出，12000rpm离心2min，以上清液作为pcr模板，对其16srrna基因序列进行扩增，其中所用的pcr扩增引物序列为：27f：agagtttgatcctggctcag；1492r：ggctacctigtiacgactt。

pcr扩增体系为20μl体系：takarataq10.0μl，引物各1.0μl，dna模板1μl，ddh2o7.0μl。

pcr扩增程序为预变性94℃5min；变性94℃1min，退火53℃1min，延伸72℃90s，重复35个循环；再延伸72℃，10min；4℃保存。

菌株a148的16srrna基因pcr扩增产物电泳结果如图3所示。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小后送去测序，测序结果显示其大小为1396bp，通过ncbi数据库进行blast比对，结果显示其与链霉菌属同源性较高，与菌株streptomycessannanensis、锦葵色链霉菌(s.mauvecolor)、赖野链霉菌(s.setonensis)相似度达到99％以上。再与ezbiocloud数据库的模式种菌株进行比对分析，结果显示与a148的相似度在98.65％以上的只有5个菌种，它们是s.sannanensis、s.mauvecolor、s.scopuliridis、s.pulveraceus和s.drozdowiczii，相似度分别为99.14％、99.07％、99.00％、98.78％、98.71％，因此确定该菌株为山南链霉菌。利用mega5软件构建菌株a148的16srrna基因系统发育树，但结果如图4显示其自成一个独立分支，说明其在系统进化的过程中与其它菌种相距较远。

将筛选到的菌株a148进行菌种保藏，所述山南链霉菌a148的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2021年02月01日；山南链霉菌streptomycessannanensis的保藏编号为cgmccno.21790。

实施例3：山南链霉菌a148对植物病原菌的抑菌作用

用pda培养基活化禾谷镰孢菌、燕麦镰孢菌、尖孢镰刀菌、禾谷丝核菌、禾顶囊壳菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌及灰霉病菌，用直径5mm的打孔器在新鲜的菌落边缘打孔，用灭菌牙签挑取菌饼放在琼脂板中间位置。在生长成熟的待测菌株平板上，同样用打孔器打孔，挑取新鲜的山南链霉菌a148接种在距指示菌菌饼3cm的位置，有菌面朝上，封口膜封好后于28℃恒温倒置培养。接种禾谷镰孢菌、燕麦镰孢菌与灰霉病菌的平板，4天后观察试验结果；接种尖孢镰孢菌、禾谷丝核菌、禾顶囊壳菌、苹果轮纹病菌、苹果腐烂病菌的平板，7天后观察试验结果。对初筛得到有效菌株再进行复筛，每个菌株3个重复。

结果如图5所示，说明山南链霉菌a148对上述8种植物病原菌均显示出较强的拮抗活性，且具有明显的抑制效果。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。