一种乳酸明串珠菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种乳酸明串珠菌及其应用。

背景技术：

9-癸烯酸(9-decenoicacid，c10h18o2)，是乳酸发酵食品中的重要风味化合物之一，通常赋予奶酪、红酒等发酵食品蜡香、脂肪、清香和牛奶及干酪香韵，且有皂样气息。尽管发酵蔬菜所含的9-癸烯酸仅为微量，但由于其阈值低、香气值高因而能够显著改善和丰富发酵蔬菜制品的风味品质，当其浓度达到0.9μg/kg时，可贡献发酵蔬菜在风味感官品质方面的特有香气，使得发酵蔬菜香气更为醇厚、丰富而协调。通常情况下蔬菜发酵过程中9-癸烯酸产量较低，在生产中，为达到增香目的，可通过外源添加或提高内源产生来改善发酵蔬菜制品的风味。

由于目前9-葵烯酸不属于国家允许的食品添加剂，因此通过外源添加的方式实现的9-癸烯酸含量提升，往往造成产品的安全性差且品质不稳定。因而限制了外源添加式9-癸烯酸在发酵食品风味改善方面的大规模生产应用。

技术实现要素：

有鉴于此，本申请提供一种乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)及其应用，该菌为可用于食品的安全菌株，高产9-癸烯酸，可以改善发酵发酵食品的风味，适用于大规模生产应用。

为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)，所述乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编：510075，保藏编号为gdmccno.60342，保藏日期为2020年12月4日，命名为b-ms-pc-12。

上述乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)的16srdna如seqidno.1所示:

ggacgtgggcggggtgctataatgcagtcgaacgcgcagcgaaaggtgcttgcacctttcaagcgagtggcgaacgggtgagtaacacgtggataacctgcctcaaggctggggataacatttggaaacagatgctaataccgaataaaacttagtatcgcatgatacaaagttgaaaggcgctacggcgtcacctagagatgggtccgcggtgcattagttagttggtggggtaaaggcctaccaagacaatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggctgcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggctttagggtcgtaaagcactgttgtatgggaagaaatgctagaatagggaatgattctagttcgacggtaccataccagaaagggacggctaaatacgtgccagcagccgcggtaatacgtatgtcccgagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcagacggttgattaagtctgatgtgaaagcccggagctcaactccggaatggcattggaaactggttaacttgagtgttgtagaggtaagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggcttactggacaacaactgacgttgaggctcgaaagtgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacaccgtaaacgatgaatactaggtgttaggaggtttccgcctcttagtgccgaagctaacgcattaagtattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaagcttttaaagatagaagggt

本发明还提供了含权利要求1所述的乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)的菌剂。

优选的，所述菌剂为发酵剂。

优选的，所述菌剂为直投式发酵剂。

优选的，所述菌剂中所述乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)活菌浓度为10⁷～10⁹cfu/ml。

优选的，所述发酵剂通过以下方法制备得到：将所述乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)活化培养后经离心、缓冲液清洗、添加冻干保护剂，然后冷冻干燥，即得。

优选的，所述冻干保护剂为无菌脱脂乳。

优选的，所述缓冲液为无菌磷酸盐缓冲溶液。

本发明还提供了一种发酵剂的制备方法，包括：将上述乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)活化培养后离心，缓冲液清洗，添加冻干保护剂，调整活菌浓度，冷冻干燥。

优选的，所述发酵剂通过以下方法制备得到：

(1)提供无菌脱脂乳；

(2)活化乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)，得到活化菌种；

(3)活化菌种经离心、缓冲液清洗、添加无菌脱脂乳，然后冷冻干燥，即得。

本发明还提供了上述乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)或上述的菌剂在制备发酵食品中的应用。

优选的，所述发酵食品选择乳制品、豆制品和果蔬制品中的任意一种。

优选的，所述应用包括：赋予果蔬制品香味。

香味优选的，所述发酵食品为发酵蔬菜或发酵蔬菜汁饮料。

本发明还提供了上述乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)或上述发酵剂所述的菌剂在生产9-癸烯酸中的应用。

本发明还提供了一种发酵食品的制备方法，包括：将含上述乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)的菌剂按1％～5％(m/v)的接种量接入待发酵食材进行发酵。

优选的，所述制备方法包括：将含上述乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)的菌剂按1％～3％(m/v)的接种量接入待发酵食材进行发酵。

优选的，发酵蔬菜的制备方法，包括：

蔬菜盐卤水混合物的制备：预处理蔬菜和盐卤水混合，得到蔬菜盐卤水混合物；

发酵培养：将所述菌剂接种蔬菜盐卤水混合物发酵培养，即得所述发酵蔬菜。

优选的，所述发酵蔬菜的制备方法具体包括：

蔬菜预处理：蔬菜整理去除杂质及不可食用部分，然后将蔬菜加工切成块状或条状，清洗，备用，得到预处理蔬菜；

盐卤水制备：所述盐卤水包括：辅料与水混合，加热煮沸后冷却，过滤得到盐卤水；所述辅料包括盐；

蔬菜盐卤水混合物的制备：预处理蔬菜和盐卤水混合，得到蔬菜盐卤水混合物；

发酵培养：将所述菌剂接种蔬菜盐卤水混合物发酵培养，即得所述发酵蔬菜。

优选的，所述蔬菜预处理具体包括：蔬菜整理去除杂质及不可食用部分，然后将蔬菜加工切成块状或条状，蔬菜用消毒液消毒处理3～5min，控制蔬菜的微生物数量≤300cfu/g，再用清水冲洗3～5min，沥干备用，得到预处理蔬菜。

优选的，所述盐卤水制备具体包括：称取1～2％(m/v)八角，2％～4％(m/v)花椒，2％～6％(m/v)食盐，1％～2％(m/v)桂皮，3～6％(m/v)葡萄糖，加入纯净水使其充分溶解，加热煮沸10～60min后，冷却，150-300目纱布过滤，得到盐卤水。

优选的，所述盐卤水制备具体包括：称取1％(m/v)八角，2％(m/v)花椒，3％(m/v)食盐，1％桂皮，3％(m/v)葡萄糖，加入纯净水使其充分溶解，加热煮沸60min后，冷却至室温(15～30℃)，200目滤布过滤得到泡菜卤水，即得到盐卤水。

优选的，所述盐卤水制备具体包括：称取2％(m/v)老姜，3％(m/v)野山椒，1％(m/v)桂皮，4％(m/v)食盐，4％(m/v)葡萄糖，加入纯净水使其充分溶解，加热煮沸45min后，冷却至室温(15～30℃)，300目滤布过滤得到泡菜卤水，即得到盐卤水。

优选的，所述蔬菜盐卤水混合物的制备过程具体包括：预处理蔬菜和盐卤水按1:5～1:10(m/v)比例混合，得到蔬菜盐卤水混合物。

优选的，所述发酵培养具体包括：将所述菌剂按接种量1％～3％(m/v)接种蔬菜盐卤水混合物，25℃～30℃发酵发酵10天～14天培养，至总酸0.8～1.5％，即得所述发酵蔬菜。

优选的，发酵蔬菜饮料的制备方法，包括：

蔬菜浆液的制备：预处理蔬菜打浆，得到蔬菜浆液；

发酵基料的制备：所述菌剂接入蔬菜浆液中进行发酵。

优选的，所述发酵蔬菜饮料的制备方法具体包括：

蔬菜预处理；

蔬菜浆液的制备：取预处理蔬菜、葡萄糖和水混合，打浆，得到蔬菜浆液；

发酵基料的制备：所述菌剂按1％(m/v)的接种量接入蔬菜浆液中进行发酵，得到发酵基料；

发酵蔬菜汁的调配：蔗糖、水、发酵基料混合，调节ph值；

均质、杀菌：均质后杀菌，即得所述发酵蔬菜饮料。

优选的，所述蔬菜浆液的制备过程具体包括：称取10～20％(m/v)蔬菜和6％～10％(m/v)的葡萄糖，加入纯净水，放入打浆机中打浆，得到蔬菜浆液。

优选的，所述蔬菜浆液的制备过程具体包括：称取10％(m/v)蔬菜和6％(m/v)的葡萄糖，加入纯净水，放入打浆机中打浆，得到蔬菜浆液。

优选的，所述发酵基料的制备过程具体包括：所述菌剂按1～5％(m/v)的接种量接入蔬菜浆液中，然后控制温度25～30℃，进行发酵7～14天，至总酸0.8％，得到发酵基料。

优选的，所述发酵基料的制备过程具体包括：所述菌剂按1％～5％(m/v)的接种量接入蔬菜浆液中，25～30℃发酵发酵7～14天培养，至总酸0.8％，得到发酵基料。

优选的，所述发酵基料的制备过程具体包括：所述菌剂按1％(m/v)的接种量接入蔬菜浆液中，25℃发酵发酵7天培养，至总酸0.8％，得到发酵基料。

优选的，所述发酵蔬菜汁的调配过程具体包括：取10～15％(m/v)的蔗糖，与70～80℃的纯净水混合，搅拌溶解20～30min，95℃灭菌5～10min并冷却至20～30℃；加入20～30％(m/v)的发酵基料，搅拌10～15min，并用柠檬酸盐调节ph值至3.6～4.0。

优选的，所述发酵蔬菜汁的调配过程具体包括：取15％(m/v)的蔗糖，与80℃的纯净水混合，搅拌溶解30min，95℃灭菌10min并冷却至30℃；加入30％(m/v)的发酵基料，搅拌15min，并用柠檬酸盐调节ph值至4.0。

优选的，所述均质、杀菌过程具体包括：在20～30℃、20～30mpa下进行均质；然后在95℃条件下杀菌5～10min，在4℃下冷藏，即得到所述发酵蔬菜汁饮料。

优选的，所述均质、杀菌过程具体包括：在30℃、20mpa下进行均质；然后在95℃条件下杀菌10min，在4℃下冷藏，即得到所述发酵蔬菜汁饮料。

本发明还提供了一种发酵食品，由上述的制备方法制备得到。

本申请与现有技术相比，其详细说明如下：

内源产生通过微生物代谢直接合成9-癸烯酸，可以改善发酵发酵食品的风味，可以产物9-癸烯酸可以自然释放至发酵食品环境中，可以快速实现9-葵烯酸的积累且原料低廉，也更符合崇尚自然无添加产品的消费趋势。但在蔬菜发酵过程中，能产生9-癸烯酸的乳酸菌的种类较少，因此尚缺乏对理想产量效果和产香效果的乳酸菌资源的挖掘。

本发明乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)为可用于食品的安全菌株，高产9-癸烯酸；该菌株在盐卤水和蔬菜汁中生长特性良好，在mrs培养基中生长迅速，在4h左右进入对数期，12h左右进入稳定期，发酵14天时，乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)的发酵剂发酵蔬菜可产9-癸烯酸0.10～0.13μg/kg发酵蔬菜。该菌株应用到发酵制品中，可改善发酵蔬菜制品成熟过程的风味形成，赋予产品蜡香、脂肪、青香、皂样气息、牛奶及干酪等香味(交底书同时提高了赋予蜡香、奶油香、柑橘香、黄瓜清香等果香味，请确认为哪些箱体)，能有效提高发酵制品中发酵速率，增加产品风味，且有利于产品品质特性的提高，在发酵蔬菜制品领域具有广阔的应用前景。

本发明的乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)生长温度范围较广，最低生长温度为15℃，最高生长温度为40℃，在35-40℃生长温度最佳；在ph为4.0～8.0范围均生长良好，最适生长ph为6.0。

附图说明

图1为本发明实施例1发酵蔬菜gc-ms总离子流图。

图2为本发明乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)菌落形态图；

图3为本发明乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)的细胞形态图((×1600)；

图4为本发明乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)的生长曲线图；

图5为本发明乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)不同温度下的od值图；

图6为本发明乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)发酵过程ph变化图；

图7为本发明乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)发酵过程滴定酸度变化图；

图8为本发明乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)不同ph下od值图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

常规发酵剂为市售发酵剂(北京川秀科技有限公司，乳酸菌发酵粉-植物乳杆菌)

本发明实施例中总酸百分比为乳酸含量占蔬菜质量的百分比。

乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12菌株分离方法

1、获得合适的稀释梯度并培养

从四川省眉山市采集自然发酵泡菜制品(市售)中取样。将收集的样品放入冰盒内冷藏，保持在较低温度下带回实验室并放置于4℃冻藏备用。样品称取1ml，加入到装有9ml无菌水中，然后依次取1ml菌液稀释在9ml无菌水，使该样品浓度梯度稀释至10^-4，取4个稀释度分别为10^－1,10^-2,10^-3,10^-4)的菌悬液各50μl分别涂布于mrs琼脂平板，在兼性厌氧条件下恒温培养温度37℃下培养36～48h。

(2)分离纯化

用平板划线法，挑选大小不同、凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落背面为黄色的单菌落，重复这种培养挑选操作后得到优良性状的菌株。

(3)菌株的初筛

革兰氏染色及过氧化氢酶实验

挑取单菌落，做革兰氏染色及过氧化氢酶实验，将革兰氏阳性、过氧化氢阴性菌平板纯化，用平板划线法，挑选典型单菌落，重复这种培养挑选操作后得到优良性状的菌株，接种于mrs培养18～24h，10000rpm离心5min，添加30％(v/v)的甘油作为保护剂，-80℃保藏。

4、复筛

产9-癸烯酸能力的测定

(1)无菌脱脂乳的制备

称取12％(m/v)脱脂乳粉、6％(m/v)的葡萄糖和2％的甘油，加入纯净水使其充分溶解，在115℃下灭菌20min，然后冷却到37℃，即得到无菌脱脂乳；

(2)菌种活化

将初筛得到的乳酸菌在mrs琼脂培养基平板上划线，在37℃培养箱中培养24h至长出单菌落，即得到平板活化菌种；

(3)工作发酵剂的制备

用接种环取步骤(2)所得的平板活化菌种一环接入装有50mlmrs肉汤液体培养基的250ml规格的三角瓶中，置于37℃的培养箱中恒温培养18h，得到培养液；

将上述所得的培养液控制转速为10000rpm离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液(50mm，ph6.8)清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入2ml无菌脱脂乳涡旋震荡重悬菌体，得到重悬后菌种培养液；

将重悬后菌种培养液在无菌条件下导入玻璃安瓿瓶中，液面高度0.8～1cm，盖瓶塞后放入-80℃速冻，而后将玻璃安瓿瓶用托盘盛装，放入冻干机进行冷冻干燥，得到工作发酵剂，且活菌数达10⁷～10⁹cfu/ml以上；

(4)蔬菜预处理

蔬菜整理去除杂质及不可食用部分，然后将蔬菜加工切成块状或条状，含次氯酸钠的消毒液消毒处理5min，控制蔬菜的微生物数量≤300cfu/g；再用清水冲洗5min，沥干备用，得到预处理蔬菜。

(5)盐卤水制备

称取2％(m/v)老姜，1％桂皮，3％(m/v)野山椒，4％(m/v)食盐，4％(m/v)葡萄糖，加入纯净水使其充分溶解，加热煮沸45min，将煮好的盐水冷却至室温(15～30℃)，300目滤布过滤得到泡菜卤水，即得到盐卤水。

(6)蔬菜盐卤水混合物的制备

步骤(4)所得的预处理蔬菜与步骤(2)所得的盐卤水按1:5(m/v)比例混合，得到蔬菜盐卤水混合物。

(7)发酵培养

工作发酵剂与常规发酵剂按接种量3％(m/v)分别接种到蔬菜盐卤水混合物，控制温度25℃，进行发酵14天，至总酸0.8～1.5％，即得到发酵蔬菜，常规发酵剂单独发酵制得发酵蔬菜作为对照组。

(8)gc-ms测蔬菜发酵过程中9-癸烯酸含量

色谱条件为：将上述所得的发酵蔬菜称取5g，加1.3gnacl，定量采用庚酸甲酯为内标(1mg/ml，上样量1μl)置于顶空固相微萃取小瓶中。完成发酵蔬菜香气化合物的检测，从而测定得出发酵蔬菜中9-癸烯酸的含量，发酵蔬菜gc-ms总离子流图见图1。

db-wax-ui毛细管柱；柱子规格：30m×0.25μm×0.25μm，进口温度为240℃，柱流速35cm/s，载气为氦气；

程序升温：初始温度40℃，保持10min；10℃/min升温至90℃，保持15min,；20℃/min升温至130℃，保持5min；20℃/min升温至250℃，保持5min。

质谱条件为：离子化方式ei，发射能量为74ev，离子源温度230℃，接口温度280℃，四级杆温度：150℃，质荷比15-500。在nist2001标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，并采用峰面积归一化法计算各成分的峰面积，表示为μg/kg蔬菜制品。

(9)发酵过程中9-癸烯酸含量变化

通过测定发酵蔬菜中9-癸烯酸的含量筛选得到产9-癸烯酸的量最多的菌株乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12。

采用含乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的工作发酵剂,发酵14天时，9-癸烯酸含量为0.12μg/kg发酵蔬菜；常规发酵剂进行发酵9-癸烯酸含量为0.06μg/kg发酵蔬菜。

实施例2

乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的鉴定

1、生理生化鉴定

乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12为革兰氏阳性、过氧化酶阴性、不运动的杆菌，在15℃和40℃能够生长。

2、leuconostoclactis的pcr扩增16srdna序列分析

实施例1步骤3菌株的初筛过程中甘油保存的乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12，划线于mrs平板，37℃培养24h，新长出的菌落用作菌落pcr的模板。

(1)pcr体系25μl，其中mix为12.5μl，27f为0.5μl，1492r为0.5μl，ddh2o为11.5μl。

所用引物为(27f:gagagtttgatcctggctcag,如seqidno2所示；1492r：cggctaccttgttacgactt,如seqidno3所示)。扩增片段的长度为1500bp。

(2)pcr条件：

dna双链在94℃，10min的条件下预变性，94℃，30s变性，50℃，30s复活，72℃，80s延伸，并循环29次，最后72℃下保持7min。

(3)琼脂凝胶电泳

称取0.5g琼脂糖溶于50mltbe缓冲液中，加热溶解后加入eb染料5μl；注胶凝固后，每个点样孔加样3-5μl；于120v电压下运行30min；胶板在uv下观察图像，挑选清晰条带测序。

(4)16srdna序列分析鉴定

根据北京六合华大基因科技股份有限公司给出的测序报告，该乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的16srdna如seqidno.1所示:

ggacgtgggcggggtgctataatgcagtcgaacgcgcagcgaaaggtgcttgcacctttcaagcgagtggcgaacgggtgagtaacacgtggataacctgcctcaaggctggggataacatttggaaacagatgctaataccgaataaaacttagtatcgcatgatacaaagttgaaaggcgctacggcgtcacctagagatgggtccgcggtgcattagttagttggtggggtaaaggcctaccaagacaatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggctgcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggctttagggtcgtaaagcactgttgtatgggaagaaatgctagaatagggaatgattctagttcgacggtaccataccagaaagggacggctaaatacgtgccagcagccgcggtaatacgtatgtcccgagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcagacggttgattaagtctgatgtgaaagcccggagctcaactccggaatggcattggaaactggttaacttgagtgttgtagaggtaagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggcttactggacaacaactgacgttgaggctcgaaagtgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacaccgtaaacgatgaatactaggtgttaggaggtttccgcctcttagtgccgaagctaacgcattaagtattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaagcttttaaagatagaagggt

结合blast分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)将所分离的乳酸菌16srdna序列与genbank/embl/ddbj)数据库中已知菌株的对应序列进行比较鉴定，经分析鉴定为乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)，accessionnumber为mk855188。

该乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12在mrs平板上菌落图如图2所示，细胞形态特征呈球状，菌落为乳白色，中心颜色较浅，菌落大小1.5mm-2.2mm，中心凸起，边缘凹下且湿润，光滑，湿润，不透明。

该菌细胞形态图(×1600)如图3所示，菌体特征：细胞呈球状(图3)，多排列成长短不一的链状，也有单个分散排列，菌体大小一般为0.5μm×1.5μm。

依据形态特征、生理生化特征等微生物学特性及其遗传特性16srdna鉴定为乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)。

该乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编：510075，保藏编号为gdmccno.60342，保藏日期为2020年12月4日，命名为b-ms-pc-12。

实施例3

乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的生长特性和发酵特性

(1)乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12菌株生长曲线的绘制

乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12在mrs琼脂培养基平板上划线，在37℃培养箱中培养24h至长出单菌落，即得到平板活化菌种；

将平板活化菌种按2％(v/v)接种量接入mrs液体培养基中，37℃恒温培养24h，每隔1-2h在600nm测定培养液的od值，以od值对时间作图得到乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12在mrs中的生长曲线，其结果(图4乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)生长曲线图)

表1不同时间下的od值结果表明：表明乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12在mrs培养基中生长迅速，在4h左右进入对数期，8h菌量能达到3.8×10⁸cfu/ml，12h左右进入稳定期，菌量达到1.5×10⁹cfu/ml。

(2)乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12菌株最适生长温度测定

将上述平板活化菌种按2～4％(v/v)接种量分别接于10mlypd液体培养基中，分别置于5℃、15℃、25℃、28℃、30℃和35℃条件下恒温培养48h，以未接种的ypd液体培养基作对照，于600nm测定不同温度下培养液的od值，确定最适生长温度。

将平板活化菌种按2％(v/v)接种量分别接于10mlmrs液体培养基中，分别置于15℃、25℃、32℃、37℃、40℃和45℃条件下恒温培养48h，以未接种的mrs液体培养基作对照，于600nm测定不同温度下培养的培养液的od值，依据od值的大小确定最适生长温度。其结果见图5(乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)不同温度下的od值图)。

表2不同温度下的od值结果表明：乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的生长温度范围较广，从15℃到45℃都生长，在30℃～40℃生长良好，最适生长温度为37℃。

(3)乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12在脱脂乳16h内ph和滴定酸度的变化，最适生长ph测定

将上述平板活化菌种按2％～4％体积比接种于实施例1的无菌脱脂乳中，使无菌脱脂乳中的菌量达到10⁷～10⁹cfu/g，得到接种好的样品。

将所述接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵每隔4h取样，检测发酵过程ph和滴定酸度变化，实验结果如图6和图7所示。

将上述平板活化菌种按2～4％(v/v)接种量分别接种入ph为8.0、7.0、6.0、5.0、4.0的mrs液体培养基中，30℃恒温培养72h，测定培养液的od值，其结果见图8(乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)不同ph的生长od图)。

可知，乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12，8h后ph能达到4.83，总酸为0.8％，发酵18h后ph为4.58。乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12在ph为4.0～8.0范围均生长良好，最适生长ph为6.0。

实施例4

含乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的发酵剂

(1)无菌脱脂乳的制备

称取10％(m/v)脱脂乳粉、6％(m/v)的葡萄糖和2％(v/v)的甘油，加入纯净水使其充分溶解，在95℃下灭菌20min，然后冷却到37℃，即得到无菌脱脂乳；

(2)菌种活化

用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的实施例1的乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12一环在mrs琼脂培养基平板上划线，在37℃培养箱中培养48h至长出单菌落，即得到平板活化菌种；

(3)工作发酵剂的制备

在37℃恒温培养箱中培养12h，得到培养液；

将所得的培养液控制转速为10000rpm离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液(50mm，ph6.8)清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入2ml无菌脱脂乳溶液涡旋震荡重悬菌体，得到重悬后的菌种培养液；

将重悬后的菌种培养液在无菌条件下导入玻璃安瓿瓶中，液面高度0.8～1cm，盖瓶塞后放入-80℃速冻，而后将玻璃安瓿瓶用托盘盛装，放入冻干机进行冷冻干燥，即得到即得到含乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的发酵剂，且所述的发酵剂的活菌数为10⁷～10⁹cfu/ml。

实施例5

含乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的发酵蔬菜

(1)蔬菜预处理

蔬菜整理去除杂质及不可食用部分，然后将蔬菜加工切成块状或条状，含次氯酸钠的消毒液消毒处理5min，控制蔬菜的微生物数量≤300cfu/g；再用清水冲洗5min，沥干备用，得到预处理蔬菜。

(2)盐卤水制备

称取1％(m/v)八角，1％桂皮，2％(m/v)花椒，3％(m/v)食盐，3％(m/v)葡萄糖，加入纯净水使其充分溶解，加热煮沸60min，将煮好的盐水冷却至室温(15～30℃)，200目滤布过滤得到泡菜卤水，即得到盐卤水。

(3)蔬菜盐卤水混合物的制备

步骤(1)所得的预处理蔬菜与步骤(2)所得的盐卤水按1:10(m/v)比例混合，得到蔬菜盐卤水混合物。

(4)发酵培养

实施例4的发酵剂按接种量为2％(m/v)接种到蔬菜盐卤水混合物中，控制温度30℃，进行发酵10天，至总酸0.8％～1.5％，即得到含乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的发酵蔬菜。

测定产品中9-癸烯酸含量，含乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的发酵蔬菜中9-癸烯酸的含量为0.1μg/kg发酵蔬菜。

实施例6

含乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的发酵蔬菜饮料

(1)蔬菜预处理

蔬菜整理去除杂质及不可食用部分，然后将蔬菜切成块状，含次氯酸钠的消毒液消毒处理5min，控制蔬菜的微生物数量≤300cfu/g；再用清水冲洗5min，沥干备用，得到预处理蔬菜。

(2)蔬菜浆液的制备

称取10％(m/v)蔬菜和6％(m/v)的葡萄糖，加入纯净水，放入打浆机中打浆，即得到蔬菜浆液。

(3)发酵基料的制备

实施例4的工作发酵剂按1％(m/v)的接种量接入蔬菜浆液中，然后控制温度25℃，进行发酵7天，至总酸0.6％，过滤所得清液经过冷藏即得到含乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的发酵基料。

(4)发酵蔬菜汁的调配

取15％(m/v)的蔗糖，用80℃的纯净水处理，搅拌溶解30min，95℃灭菌10min并冷却至30℃；取30％(m/v)的发酵基料加入上述溶液中，搅拌15min，并用适量的柠檬酸盐调节ph值至4.0。

(5)均质、杀菌

在30℃、20mpa下进行均质；然后在95℃条件下杀菌10min，在4℃下冷藏即得到含有乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的发酵蔬菜汁饮料。

测定产品中9-癸烯酸含量，含乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12的发酵蔬菜汁饮料中9-癸烯酸的含量为0.13μg/kg发酵蔬菜汁饮料。

对比例1

本对比例和实施例5的区别仅在于：采用常规发酵剂替换实施例5中的发酵剂进行发酵培养。

测定产品中9-癸烯酸含量，发酵蔬菜中9-癸烯酸的含量为0.03μg/kg发酵蔬菜。

对比实施例5和对比例1，证明乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)b-ms-pc-12发酵蔬菜中具有较高的9-癸烯酸产生能力，并且在发酵过程中能大幅提高发酵蔬菜的内源产香，在发酵蔬菜中具有广阔的应用前景。

对比例2

本对比例和实施例6的区别仅在于：采用常规发酵剂替换实施例5中的发酵剂进行发酵培养。

测定产品中9-癸烯酸含量，发酵蔬菜汁饮料中9-癸烯酸的含量为0.05μg/kg发酵蔬菜汁饮料。

对比实施例6和对比例2，证明乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)在发酵蔬菜中具有较高的9-癸烯酸产生能力，并且在发酵过程中能大幅提高发酵蔬菜的内源产香，在发酵蔬菜中具有广阔的应用前景。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>四川老坛子食品有限公司

四川省农业科学院农产品加工研究所

<120>一种乳酸明串珠菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>999

<212>dna

<213>乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)

<400>2

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