肉葡萄球菌IEF1018及其应用

(一)技术领域

本发明涉及肉葡萄球菌ief1018及其在固态发酵制作酱曲中的应用。

(二)

背景技术：

传统发酵是一种古老且用途广泛的技术，我国的传统发酵技术以固态发酵为主，其中，固态制曲发酵技术占据了重要的地位，被广泛地应用于括白酒、食醋、豆酱、酱油、豆豉和豆腐乳等的固态发酵。在发酵的过程中，微生物会自发地形成一个动态变化的微生物群落，且不同种类的微生物之间存在着相互作用。目前，已经有不少学者证明了发酵过程中微生物间的相互作用最终会影响发酵产品的品质，如葡萄酒发酵过程中酿酒酵母与非酿酒酵母之间的相互作用，会影响葡萄酒最终的风味。这些不同微生物菌种的相互作用也被许多学者认为是葡萄酒品质的地域性差异的原因之一。利用嗜热链球菌与德氏乳杆菌混合发酵酸奶可以缩短发酵时间。

在酱曲的制曲过程中，也会自发地形成一个微生物群落。比如安徽某地的传统工艺酿造豆瓣酱的酱曲群落中，主要包括了米曲霉，葡萄球菌和芽孢杆菌，其中葡萄球菌在细菌菌落中占据了主要地位。米曲霉可以产生丰富的淀粉酶和蛋白酶，且在生长过程中不产黄曲霉素。我国传统酿造食品酱和酱油所用的酱曲，大部分接种米曲霉并敞开发酵制作而成。而肉葡萄球菌(staphylococcuscarnosus)也有报道其在一些肉类传统发酵制品中发挥作用，并形成特征风味，在欧洲等地被用作发酵肉产品起始培养物已经超过60多年。与其他葡萄球菌相比，肉葡萄球菌一般不产生任何毒素、溶血素、凝固酶或聚集因子，是葡萄球菌属中被认为食品级安全gras(generallyregardedassafe)菌株。

曲作为传统发酵过程的起始发酵剂，曲中微生物的组成对曲的质量是至关重要的。米曲霉和共栖生长的细菌，能共同产生一系列的酶，从而水解发酵的原料，进而影响发酵产品的品质。酱曲的蛋白酶活力是评价酱曲质量的一个重要指标。通过优化曲制作过程中的微生物组成，从而提升米曲霉的生长速率和产蛋白酶能力，从而提高曲的质量。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一株从酱曲中分离得到的肉葡萄球菌ief1018，其与米曲霉混合制曲后可显著提高酱曲的蛋白酶活力。

本发明采用的技术方案是：

肉葡萄球菌ief1018(staphylococcuscarnosusief1018)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.21620，保藏日期为2021年1月13日。

本发明还涉及所述的肉葡萄球菌ief1018在固态发酵制作酱曲中的应用。

具体的，所述肉葡萄球菌ief1018与米曲霉混合固态发酵制作酱曲。所述米曲霉为本领域常用制曲菌株，如aspergillusoryzaeas3.042等。

具体的，所述应用为：将经过蒸汽处理的豆瓣与面粉混合，搅拌均匀，接种米曲霉孢子悬浮液后，28～30℃培养8～10h，再接种肉葡萄球菌cgmccno.21620的菌液，每隔6～8h翻曲，培养24～48h，制得酱曲。

优选的，豆瓣与面粉质量用量之比为3～8:1。

优选的，米曲霉孢子悬浮液添加量为0.5～5×10⁷cfu/100g蒸豆(即经蒸汽处理的豆瓣与面粉混合物)，肉葡萄球菌ief1018接种量为1～10×10¹⁰cfu/100g蒸豆。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的肉葡萄球菌ief1018与米曲霉混合制曲，可以有效提高酱曲的质量，包括酱曲中米曲霉孢子数量和蛋白酶的活力，混合制曲48小时时，酱曲的蛋白酶活较米曲霉单独制曲时提高了40％以上，表现出良好的工业应用性能。

(四)附图说明

图1为肉葡萄球菌的m13-pcr指纹扩增电泳图；泳道1为m13-pcr指纹，泳道2为dna分子量标准。

图2为l-酪氨酸浓度的标准曲线。

图3为米曲霉与肉葡萄球菌混合制曲曲样的扫描电镜图；a为2500×倍数下扫描电镜图，b为3990×倍数下扫描电镜图，c为4000×倍数下扫描电镜图，d为4000×倍数下扫描电镜图。

(五)具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

生理盐水：nacl9.0g/l

lb液体培养基：酵母粉5.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl10.0g/l。

lb固体培养基：酵母粉5.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl10.0g/l，琼脂粉20g/l。

pdb培养基：将200g去皮马铃薯切成边长约为3cm的小块，水煮15min后，八层纱布过滤，加入20g葡萄糖，补水至1000ml。

pda培养基：将200g去皮马铃薯切成边长约为3cm的小块，水煮15min后，八层纱布过滤，加入20g葡萄糖，20g琼脂，补水至1000ml。

实施例1：传统固体发酵的成熟酱曲中优势细菌菌株的分离

优势菌株的分离与培养。称取1g成熟酱曲(该酱曲为传统豆瓣酱生产企业采用传统工艺发酵制作而得的)，加入100ml无菌生理盐水，在30℃、180rpm条件下震荡1h后，制成悬浮液；采用无菌生理盐水，梯度稀释后，取100μl悬浮液，涂布于含制霉菌素50μg/ml的lb固体培养基平板中，28℃培养24h；选择100个菌落数以内的平板，挑取单菌落接种于5ml的lb液体培养基中，28℃摇床培养过夜培养；部分菌液保存于终浓度为15％的甘油溶液中；剩余菌液用于基因组dna的提取，即提取每个菌落的基因组dna，用于m13-pcr指纹的扩增。

优势生长菌落的m13-pcr指纹的扩增。采用m13(gagggtggcggttct)引物进行pcr扩增。反应体系为：mg²⁺的浓度为3.5mmol/l，引物浓度为2.0μmol/l，dna模板浓度为4.8ng/μl-0.48ng/μl，dntp的浓度为200μmol/l，taqdna聚合酶添加量为2.5u/25μl。pcr反应程序为：94℃3min，42℃2min，72℃3min后进入以下循环：94℃变性40s，42℃20s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。取15μl的pcr产物用于1.8％的琼脂糖凝胶电泳(15cm×15cm)分离，,在6.5v/cm稳压条件下电泳4h。用goldviewdna染料染色，在紫外光下成像，即得m13-pcr指纹。

优势菌株的筛选。根据m13-pcr指纹条带大小的分布，可以将平板上的菌落进行有效区分，从而筛选出含不同指纹特征的菌株，共计筛选出8个菌株，记为1#-8#菌株。

实施例2：米曲霉单独制曲与米曲霉-细菌菌株(1#-8#)混合制曲

固态发酵培养基配制：干豆瓣去离子水浸泡12h后，称取60g，121℃，20min高压蒸汽灭菌后，将无菌豆瓣放置于超净台中，晾30min。称取面粉12g，121℃，20min干热灭菌后，混入搅拌均匀。

米曲霉(aspergillusoryzaeas3.042，工业常用的制曲菌株)孢子悬浮液的制备：将米曲霉接种至pda斜面培养基，在28℃培养48h，向米曲霉斜面加入15ml无菌水，接种环刮取孢子，超声4次，每次5s，将液体经8层纱布过滤，调整孢子浓度为10⁶个/ml。

细菌菌株的菌液制备：具有独特m13-pcr指纹的8株细菌菌株分别在lb固体培养基上划线活化，在28℃培养24h；挑取新鲜活化生长的单菌落于lb液体培养基中，在28℃、180rpm条件下震荡培养至培养至od600＝3.0，浓度为2×10¹⁰cfu/ml。

米曲霉单独制曲：取10ml米曲霉孢子悬浮液接种于上述固态发酵培养基中，搅拌均匀，温度28℃，温度28℃中培养58h，培养期间每隔6h翻曲。

细菌菌株与米曲霉混合制曲：取10ml米曲霉孢子悬浮液接种于上述固态发酵培养基中，搅拌均匀，温度28℃，培养10h后，接种1ml细菌菌株的菌液，搅拌均匀，温度28℃中培养48h，培养期间每隔6h翻曲。

实施例3：曲样中菌落数的比较

称取依实施例2所制的成曲1g，分别加入100ml无菌生理盐水，在30℃、180rpm条件下震荡1h后，制成悬浮液，梯度稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8倍，从10^-6、10^-7、10^-8倍浓度的悬浮液中取100μl悬浮液，单独制曲样品涂布于含涂布于含氯霉素50μg/ml的pda培养基平板中。米曲霉-细菌混合制曲样品涂布于含涂布于含氯霉素50μg/ml的pda培养基平板中和含制霉菌素50μg/ml的lb固体培养基平板中，28℃培养24h后，计数米曲霉数量和细菌数量，结果如表1所示。其中6#菌株对米曲霉生长的抑制作用相对较弱。

表1：曲样中菌落数的比较

实施例4：曲样中蛋白酶活的比较

所用试剂：

福林酚试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司

碳酸钠溶液(42.4g/l)：称取无水碳酸钠(na2co3)42.4g，用水溶解并定容至1000ml。

三氯乙酸(65.4g/l)：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000ml。

乳酸钠缓冲液(ph＝3.0，适用于酸性蛋白酶制剂)：取乳酸(纯度为80-90％)4.71g和乳酸钠(纯度>70％)0.89g，加水至900ml，搅拌至均匀。用乳酸或乳酸钠调整ph到3.0，定容至1000ml。

酪蛋白溶液(10.0g/l)：称取酪蛋白1.0g，用浓乳酸2-3滴湿润后，加入乳酸钠缓冲液约80ml，在沸水浴中加热煮沸30min，并不时搅拌至酪蛋白全部溶解。冷却到室温后转入100ml容量瓶中，用乳酸钠缓冲液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。

l-酪氨酸标准曲线的绘制：用0.1mol/l盐酸溶液为溶剂，配制0、10、20、30、40、50、60、80、100μg/ml浓度的l-酪氨酸，分别取上述浓度的溶液各1.0ml(须做三组平行试验)，各加上述碳酸钠溶液5.0ml、福林酚试剂1.0ml,振荡均匀，置于40℃水浴中显色20min,取出，用分光光度计于波长680nm,10mm比色皿，以不含酪氨酸的溶剂为空白，分别测定其吸光度。以吸光度a为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图2所示。

称取依实施例2所制的1g成熟酱曲，加入100ml无菌生理盐水，在30℃、180rpm条件下震荡1h后，制成悬浮液。每个样品做三个平行试样，每隔样品都需一组空白对照。

空白对照组流程：取一根干净试管，加入1.0ml悬浮液，40℃水浴2min，加上述三氯乙酸2.0ml，摇匀，40℃水浴10min，加上述酪蛋白溶液1.0ml，摇匀，取出静止10min，取1.0ml上清液，加上述碳酸钠溶液5.0ml，加入福林酚试剂1.0ml，40℃水浴，显色20min后，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。

实验组流程：取一根干净试管，加入1.0ml悬浮液，40℃水浴2min，加上述酪蛋白溶液1.0ml，摇匀，40℃水浴10min，加上述三氯乙酸2.0ml，摇匀，取出静止10min，取1.0ml上清液，加上述碳酸钠溶液5.0ml，加入福林酚试剂1.0ml，40℃水浴，显色20min后，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。

蛋白酶活定义：将40℃下每1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量定义为1个单位蛋白酶活力(u)。

从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/ml。样品的酶活力计算公式：

式中：

x：样品的酶活力，u/g；

a：由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力，u/ml；

v：溶解样品所使用的溶液的体积，单位为毫升(ml)；

4：反应试剂的总体积，单位为毫升(ml)；

n：样品的稀释倍数；

m：样品的质量，单位为克(g)；

反应时间10min,以1min计。

样品蛋白酶活如表2所示。米曲霉单独制曲时，成熟曲样品中的蛋白酶活性较36h时下降明显。但6#菌株与米曲霉混合制曲时，48h的成熟曲样品中的蛋白酶活性较36h时有所提高，该菌株能有效诱导米曲霉持续分泌蛋白酶，最后成熟曲中的蛋白酶活性较米曲霉单独制曲时提高了40％。

表2：曲样中蛋白酶活的比较

实施例5：细菌菌株6#的菌种鉴定与菌种保藏

以实施例1中得到6#菌株的基因组dna作为模板，用以下引物进行pcr扩增：

27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；

1541r：5’-aaggaggtgatccagccgca-3’。

采用南京诺维赞生物科技有限公司高保真dna聚合酶phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase试剂盒进行pcr扩增，得到16srdna基因片段。送样测序(由生工生物工程(上海)有限公司完成)，并将所得的序列进行拼接，处理较完整的16srdna序列(seqidno.1所示)，该序列长度为1550bp。将该序列在ncbi网站上用blast比对分析后鉴定为肉葡萄球菌(staphylococcuscarnosus)。

并于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.21620，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

以实施例1中得到6#菌株的基因组dna作为模板，采用m13引物重新进行pcr扩增。其扩增指纹的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。

实施例6：肉葡萄球菌cgmccno.21620与米曲霉混合制曲样品的扫描电镜观察

0.1m的磷酸缓冲液(pbs)(ph7.0)：na2hpo4·12h2o32.3g/l，nah2po4·2h2o4.5g/l，调节ph7.0。

双固定：按实施例2所述，制备好成熟样品后，取少量样品，在2.5％的戊二醛溶液中。4℃固定过夜；倒掉固定液，用0.1m，ph7.0的pbs漂洗样品15min后，简短离心去除缓冲液，重复三次；用1％的锇酸溶液固定1～2h；小心去除锇酸废液，用0.1m，ph7.0的pbs漂洗样品15min后，简短离心去除缓冲液，重复三次。

脱水：用梯度浓度(50％，70％，80％，90％，95％五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水，每种浓度处理15min，再换无水乙醇，样品放置在无水乙醇中。

干燥及观察：临界点干燥后，镀金属膜，扫描电镜观察。

如图3所示，在扫描电镜下观察，样品在经过pbs漂洗，离心之后，仍能明显观察到肉葡萄球菌吸附在米曲霉菌丝及孢子上，证明了肉葡萄球菌与米曲霉之间存在着直接吸附的相互作用。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>肉葡萄球菌ief1018及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1476

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>1

atacatgcaagtcgagcgaacagacgaggagcttgctccctctgacgttagcggcggacg60

ggtgagtaacacgtgggtaacctacctataagactggaataactccgggaaaccggggct120

aatgccggataatatgcggaaccgcatggttccgcaatgaaagacggttttgctgtcact180

tatagatggacccgcgccgtattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcaacga240

tacgtagccgacctgagagggtgatcggccacactggaactgagacacggtccagactcc300

tacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatgggcgaaagcctgacggagcaacgccg360

cgtgagtgatgaaggtcttcggatcgtaaaactctgttattagggaagaacaagtgcgta420

ggtaactatgcgcaccttgacggtacctaatcagaaagccacggctaactacgtgccagc480

agccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgt540

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ggacagtacaaagggcagcgaaaccgcgaggtcaagcaaatcccataaagctgttctcag1260

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<210>2

<211>20

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>2

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<210>3

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<212>dna

<213>未知(unknown)

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