一种降糖植物乳杆菌YZX21功效及应用

本发明属于食品微生物技术领域，尤其涉及一种降糖益生菌制备方法及应用。

背景技术：

2型糖尿病是以血液中葡萄糖浓度增高为表征。高血糖是造成个体过早死亡率和致残率的第三大独立危险因素。肠道l细胞分泌的激素glp-1可刺激胰岛素分泌，抑制胃排空，控制血糖稳定。目前研究正在关注增加内源性glp-1产生和分泌。大多数2型糖尿病患者都存在胰岛素抵抗。胰岛素抵抗导致循环中甘油三酯水平升高，导致其水解产物游离脂肪酸水平增高。长时间游离脂肪酸刺激或长期高脂饮食可导致glp-1的分泌及作用的受损。由于进食后一半以上的胰岛素分泌是由glp-1诱导的，glp-1分泌受损可能是脂毒性引起血糖障碍的一个重要机制。

益生菌是一类可通过定植于人体肠道内，产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性微生物。益生菌可定殖于肠道并产生代谢产物，从而2型糖尿病的发生发展。β-羟基丁酸是一种常见的代谢产物，也是酮体家族中最重要的一员。β-羟基丁酸除了能够为大脑提供能量外，还与生物体内的能量代谢紊乱、糖尿病等重大疾病有密切的关系。由于β-羟基丁酸不带电荷，在细胞间具有很好的穿越及通透性，因此能够快速地扩散到外周组织，能够为细胞提供支持、修复、营养等功能。

在目前已经公开的文献与专利或专利申请中，例如cn202010424363.3公开了一种可以用于预防辅助治疗2型糖尿病的干酪乳杆菌；cn201910900861.8公开了一种可以用于能够预防、缓解糖尿病的副干酪乳杆菌；cn201910818555.x公布了一种有益糖脂代谢功能的动物双歧杆菌。针对上述背景技术中已有的实现方案，这些专利或专利申请的共同点都是应用乳酸杆菌刺激glp-1来预防或缓解2型糖尿病，但是菌株刺激glp-1分泌的作用及其机制仍不够明朗。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：菌株刺激肠道glp-1分泌的机制仍不清楚。原因在于能够适应人体肠道环境，显著调节glp1表达的益生菌未被有效开发，同时益生菌通过何种途径调节glp-1产生未得到有效验证与探究。

上述问题的瓶颈在于：缺乏有效的筛选高产glp-1并适应人体肠道环境的方法，缺乏益生菌调节glp-1的效果验证与机制揭示。解决以上问题及缺陷的意义在于：开发出能够筛选glp-1高产的菌株方法，揭示菌株改善2型糖尿病的机制，为临床应用提供可靠的理论依据和有效的干预方式。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种降血糖益生菌植物乳杆菌yzx21功效及其用途。

本发明是这样实现的，一株具备降血糖功能的植物乳杆菌yzx21，其在中国典型培养物保藏中心保藏，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期2020年12月02日，保藏号为cctccno:m2020829，分类命名为：植物乳杆菌yzx21lactobacillusplantarumyzx21。

本发明提供一株植物乳杆菌yzx21在调节2型糖尿病中的应用，其特征在于，植物乳杆菌yzx21经过耐酸耐胆盐筛选，具有较好的体外黏附特性，10⁸~10⁹cfu/ml植物乳杆菌干预2型糖尿病小鼠8周可以能够延缓小鼠体重降低，空腹血糖从12.26mmol/l降低至7.13mmol/l，餐后血糖水平从24.68mmol/l降低至12.95mmol/l，具有显著的改善2型糖尿病的功能，并可增加肠道glp-1水平，保护胰岛细胞形态，改善胰岛细胞激素分泌，与药物组无明显差异。

本发明的另一目的在于提供一株植物乳杆菌yzx21在调节2型糖尿病中的机制，其特征在于，植物乳杆菌yzx21可以通过增加肠道内酮体代谢产物β-羟基丁酸的含量，作用于肠道g蛋白欧联受体109a，激活的g蛋白欧联受体109a抑制游离脂肪酸的含量，减少游离脂肪酸导致的脂毒性作用，增加改善肠道激素胰升血糖素样肽1（glp-1）的表达，进而起到降低高血糖水平的作用。

本发明的另一目的在于提供一种具有降血糖功能的植物乳杆菌yzx21的发酵酸奶制备方法，包括：

步骤一：植物乳杆菌yzx21在鲜牛乳或还原乳中37℃培养24~36小时备用；

步骤二：将步骤一得到的菌液介入到灭菌的纯牛奶中，充分搅拌混合均匀后，于37-42℃静置发酵8~12小时，制得具有降血糖功效的益生菌发酵酸奶。

本发明涉及的仅需单菌株便具有良好的血糖调节效果，因此可以作为替代传统药物的优良微生物制剂，用于调节糖脂代谢，缓解2型糖尿病。与现有技术相比，本案例结合体外（胃肠道生存能力评价）法，快速、精准地获得了潜在的功能性菌株。通过2型糖尿病小鼠进行验证，获得了有效改善2型糖尿病的功能性菌株。因此，本发明主要有以下优点：

（1）菌株制备方法安全环保。本发明提供的植物乳杆菌yzx21菌粉制作方法仅适用绿色原料，制备的菌粉安全无毒，干燥过程对环境无污染；

（2）菌株胃肠道存活性能突出。本发明提供的植物乳杆菌yzx21具有良好的肠道生存能力，能够很好地耐受模拟胃肠道生存环境；

（3）益生菌降糖秘效果显著。当植物乳杆菌yzx21，针对链脲佐菌素和高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠，具有显著的血糖改善效果，与阳性药物二甲双胍无显著性差异。

综上，本发明提供的益生菌具有优良的降血糖效果，是调节2型糖尿病的新选择，具有非常广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的降血糖益生菌的制备方法流程图。

图2(a)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21胃肠道存活能力评价中的表面疏水能力和自聚集能力示意图。

图2(b)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21胃肠道存活能力评价中的耐酸能力和耐胆盐能力示意图。

图2(c)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21胃肠道存活能力评价中的模拟胃液转运能力和模拟肠液转运能力示意图。

图3(a)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠体重影响示意图。

图3(b)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠摄食量影响示意图。

图3(c)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠空腹血糖影响示意图。

图3(d)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠餐后血糖影响示意图。

图3(e)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量影响示意图。

图3(f)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠血糖下面积影响示意图。

图4(a)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠胰岛素耐量影响示意图。

图4(b)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠血糖下面积示意图。

图4(c)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠空腹胰岛素影响示意图。

图4(d)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠home-ir影响示意图。

图4(e)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠胰岛组织形态影响示意图。

图5(a)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠肠道glp-1表达影响示意图。

图5(b)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠肠道glp-1阳性细胞影响示意图。

图5(c)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠肠道glp-1分泌影响示意图。

图5(d)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠肠道定殖影响示意图。

图6(a)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠opls评分示意图。

图6(b)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠代谢产物分布示意图。

图6(c)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21对2型糖尿病小鼠游离脂肪酸和β-羟基丁酸影响示意图。

图7(a)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21代谢产物对g蛋白欧联受体109a影响示意图。

图7(b)是本发明实施例提供的植物乳杆菌yzx21代谢产物对g蛋白欧联受体41,43,109a基因表达影响示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种降糖益生菌的制备方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

所述的植物乳杆菌菌株在中国典型培养物保藏中心保藏，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期2020年12月02日，保藏号为cctccno:m2020829，分类命名为：植物乳杆菌yzx21lactobacillusplantarumyzx21。植物乳杆菌yzx21的16srna序列为：gattggcaagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagcttgaaagatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgccct。

如图1所示，本发明实施例提供的降糖益生菌植物乳杆菌yzx21的制备方法包括以下步骤：步骤一，植物乳杆菌yzx21培养：将植物乳杆菌yzx21接种到发酵罐的增菌mrs培养基中培养，得发酵液；步骤二，植物乳杆菌yzx21干燥：将植物乳杆菌yzx21依次进行冷冻前预冷处理、预冻处理、主干燥处理及解析干燥处理，完成植物乳杆菌yzx21冻干产品的制备；步骤三，植物乳杆菌yzx21的包装：将粉状植物乳杆菌yzx21进行粉末的制备；步骤四，植物乳杆菌yzx21的功效：将植物乳杆菌yzx21以10⁹cfu/ml灌胃2型糖尿病小鼠，检测其血糖及肠道代谢产物变化；步骤五，植物乳杆菌yzx21的降糖机制：通过代谢组学分析肠道代谢产物变化与2型糖尿病的关系，挖掘关键代谢物，并验证其作用靶点；步骤六，植物乳杆菌yzx21的应用：将植物乳杆菌yzx21经过培养、接种、发酵和后熟步骤，制作具有降糖功能的益生菌酸奶。

具体实施例

实施例1.植物乳杆菌yzx21的降糖功效

（1）植物乳杆菌yzx21具有优良的胃肠道生存能力

具有优良的表面疏水性和自聚集能力

与模式菌株鼠李唐乳杆菌gg（lgg）相比，植物乳杆菌yzx21的表面疏水能力达到53.35±1.49%；自聚集能力达到94.13±0.02%。因此具有优良的黏附性（见图2a）。

具有优良的耐酸耐胆盐能力

植物乳杆菌yzx21在ph为3.00的酸性环境中消化3小时后，不仅能够良好地存活，还能实现一定程度的增长，高达108.74±0.021%；植物乳杆菌yzx21在0.3%的胆盐性环境中消化4小时后，存活率高达76.62±6.11%，具有优良的耐酸耐胆盐能力（见图2b）。

具有优良的耐受模拟胃肠液能力

植物乳杆菌yzx21在ph为3.00的模拟胃液环境中消化3小时后，存活率高达98.17±0.14%；之后转为ph为8.00的模拟肠液环境中消化8小时后，不仅能够良好存活，还能实现一定程度地增长，高达103.76±0.08%（见图2c）。

（2）植物乳杆菌yzx21具有良好的血糖改善效果

采用链脲佐菌素和高脂饮食诱导成功构建2型糖尿病小鼠模型后，植物乳杆菌yzx21干预小鼠后，体重结果如图3a所示。与正常组相比所有糖尿病小鼠均出现明显的体重降低。但补充植物乳杆菌yzx21后，糖尿病小鼠的体重得到了明显的恢复，体重从20.34g增加至24.24g，与药物组无明显差别。小鼠饮食情况如图3b所示，糖尿病小鼠摄食量出现显著的增加，而植物乳杆菌yzx21干预后，小鼠饮食状况得到缓解，从13.28g降低至7.03g(p<0.05)，与药物组无明显区别。空腹血糖水平如图3c所示，与正常小鼠相比糖尿病小鼠fbg水平高于7.0mmol/l。植物乳杆菌yzx21干预组小鼠血糖从12.26mmol/l降低至7.13mmol/l(p<0.05)，接近空腹正常血糖水平。餐后水平如图3d所示，糖尿病小鼠与模型组相比，pbg水平高于11.1mmol/l。补充yzx21后，小鼠pbg显著降低，从24.68mmol/l降低至12.95mmol/l(p<0.05)。ogtt结果如图3e所示，与正常组小鼠相比，糖尿病小鼠灌胃葡萄糖30min内血糖迅速爬升，后面90min内仍保持较高水平，下降缓慢，其曲线面积几乎为正常组的3倍大(图3f)。而益生菌植物乳杆菌yzx21干预组的小鼠血糖前30min内血糖上升速度减缓，后90min血糖下降速度加快，下降速度平稳，血其ogtt曲线下面积明显减少，与药物组无差异。

腹腔注射胰岛素可衡量小鼠对胰岛素的敏感性，结果如图4a所示。与正常组组小鼠相比，糖尿病小鼠注射胰岛素后，血糖下降速度快，不平稳，对胰岛素敏感性下降，aucglucose面积是正常组的3倍。而植物乳杆菌yzx21干预组小鼠胰岛素的敏感性明显提高，血糖控制平稳。aucglucose面积显著下降(图4b)，下降了2.4倍。图4c和d显示空腹胰岛素水平和homa-ir，与正常组相比，糖尿病小鼠的空腹胰岛素水平显著增高，其homa-ir水平同样处于高水平，这表明糖尿病小鼠体内的胰岛素抵抗严重，胰岛素利用减少。植物乳杆菌yzx21干预后可显著降低了血清胰岛素水平和homa-ir，与药物组无差别。进一步通过组织病理学验证益生菌对胰岛细胞的影响。胰腺组织病理学染色结果如图4e所示，正常小鼠胰岛细胞呈圆形或椭圆形，细胞清晰，细胞质丰富而均匀。而糖尿病小鼠的胰岛与胰腺面积比显著下降，细胞呈不规则结构，胰岛细胞体积减少。在植物乳杆菌yzx21组，部分胰岛细胞萎缩，染色很淡，然而细胞形态完整，形态和结构接近正常胰腺。

glp-1主要在结肠上皮细胞中表达，经免疫组化处理后在呈卵圆形或金字塔形，如图5a所示。糖尿病的小鼠结肠粘膜glp-1阳性细胞数量减少，而补充植物乳杆菌yzx21后，肠道glp-1阳性细胞明显增加（图5b）。与这一发现一致的是，糖尿病的小鼠中，肠道中glp-1的含量显著减少（图5c），而补充植物乳杆菌yzx21后，其肠道中，特别是结肠中的glp-1含量明显增加，并高于药物组。通过荧光染色实验发现（图5d），灌胃植物乳杆菌yzx21在6小时，在结肠部位显示出高荧光亮度，在12小时时，结肠部位仍保持高荧光强度。这暗示植物乳杆菌yzx21很可能主要定殖于结肠部位并发挥作用。

实施例2.植物乳杆菌yzx21降血糖机制

我们在opls-da评分图观察到糖尿病组和植物乳杆菌yzx21组代谢产物存在明显的区别(图6a)，这提示二者肠道代谢谱之间存在显著差异。图6b揭示了糖尿病组与植物乳杆菌yzx21干预组共有88种代谢物有显著不同。依据vip值评分和差异倍数值，我们发现游离脂肪酸与糖尿病相关度很高，是植物乳杆菌yzx21补充组的2.2倍。排名前十的差异产物中，第五名β-羟基丁酸与游离脂肪酸的关系十分密切。并且植物乳杆菌yzx21干预组的β-羟基丁酸显著增加，高于糖尿病组3倍以上(图6c)。这提示我们β-羟基丁酸很可能是影响疾病的关键代谢物。

为了进一步解释bhb调节ffa的途径，通过荧光免疫实验检测结肠中g蛋白欧联受体109a的表达情况。图7a的结果表明，糖尿病组小鼠的结肠gpr109a表达显著降低，而bhb干预后，其水平得到明显的恢复，荧光强度增强，基本恢复至正常水平。进一步检测结肠部分其他gpr的表达情况（图7b），可以发现，糖尿病组对gpr41，gpr43和gpr109a都有明显的影响，而补充bhb后，其对gpr109a的表达起到显著的上调作用，而对gpr41和gpr43的影响则不明显。

实施例3.一种降糖益生菌发酵酸奶的制备方法，所述制备方法包括：

（1）植物乳杆菌yzx21在鲜牛乳或还原乳中37℃培养24~36小时备用；

（2）将步骤一得到的菌液介入到灭菌的纯牛奶中，充分搅拌混合均匀后，于37-42℃静置发酵8~12小时，制得具有降血糖功效的益生菌发酵酸奶。

（3）益生菌发酵酸奶倍比稀释后经平板计数，植物乳杆菌yzx21的活菌量大于1×10⁹cfu/g。

本发明涉及的仅需单菌株便具有良好的血糖调解效果，因此可以作为替代传统药物的优良微生物制剂，用于调节血糖水平，调节2型糖尿病。与现有技术相比，本案例结合体外（胃肠道生存能力评价）方法，快速、精准地获得了潜在的功能性菌株。通过2型糖尿病小鼠进行验证，获得了有效改善2型糖尿病的功能性菌株。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。