一种能够产生IAA并且能促进丹参生长的变栖克雷伯氏菌及其应用

本发明涉及一种能够产生iaa并且能促进丹参生长的变栖克雷伯氏菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

丹参salviamiltiorrhizabge为唇形科多年生草本，以干燥根和根茎入药，是治疗心脑血管疾病的首选药物之一。近年来，种植丹参已经成为河南省豫西贫困山区脱贫攻坚和乡村振兴的重要举措。为了保证丹参的产量，多数药材种植户在丹参的种植过程中广泛使用化学肥料和化学药剂，一定程度上降低了丹参的品质，严重情况下还会出现肥害和药害，甚至导致化学制剂残留超标，同时对种植区的生态环境也造成了污染。

发掘可促进丹参生长的环境友好微生物方面已经受到学者的重视，开发微生物菌肥并加以应用，既可以保证丹参的品质和产量，又维护了生态环境，使得丹参产业健康可持续发展。我国目前有关植物促生菌的报道主要包括产生长激素、解磷、解钾和固氮特性的微生物，其中吲哚乙酸(iaa)是植物生长过程中必需的生长调节剂，各个组织尤其是根部对iaa都比较敏感，因此，iaa在植物生长过程中起着关键的作用。植物内生细菌对于自身寄主具有较好的适应和定殖能力，可安全稳定的在寄主上进一步的应用。本研究发现丹参产iaa的内生菌能够显著促进植株的生长，而关于丹参内生产iaa细菌的研究未见报道，因此筛选能够产生iaa并促进丹参生长的菌株具有重要的理论和实践意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题，是克服现有技术的不足，提供一种能够产生iaa并促进丹参生长的促生菌，能有效促进丹参的生长，取代化学肥料和化学药剂，实现绿色种植。

本发明未解决上述技术问题所采用的技术方案是：

一种能够产生iaa并且能促进丹参生长的变栖克雷伯氏菌，该菌株编号为变栖克雷伯氏菌(klebsiellavariicola)13-2，已保藏于已保藏于“中国典型培养物保藏中心”(简称cctcc)，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏号为cctccm2020923，保藏日期为2020年12月21日。

所述的一种能够产生iaa并且能促进丹参生长的变栖克雷伯氏菌，其筛选方法为：取新鲜无病害的丹参植株根部，先用流水冲洗30min，然后用无菌水冲洗5次后，对材料表面进行消毒，先用75％乙醇浸泡45s，然后用0.1％升汞中浸泡3min,无菌水冲洗3～4次。无菌条件下，用灭菌剪刀将根段剪成3mm×3mm小块，接种到lb培养基上，28℃避光培养1～2d，至菌落长出后分离纯化，然后筛选出可以产生吲哚乙酸的菌株，并鉴定，得到变栖克雷伯氏菌13-2。

所述的一种能够产生iaa并且能促进丹参生长的变栖克雷伯氏菌，其在促进丹参生长方面的应用。

所述的一种能够产生iaa并且能促进丹参生长的变栖克雷伯氏菌，其在制备促进丹参生长的菌剂中的应用。

所述的菌剂的制备方法为：将变栖克雷伯氏菌(klebsiellavariicola)13-2接种于lb培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养12h制备种子菌，种子菌以2％的接种量接种于lb培养基中，在28℃、180rpm条件下发酵48h，形成发酵液，即为菌剂。

所述的菌剂中变栖克雷伯氏菌13-2活菌的浓度为10⁷～10⁸cfu/ml。

所述的lb培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，添加蒸馏水定容至1000ml，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌30min。

所述的菌剂的使用方法为：菌剂用无菌水稀释10倍，使稀释液活菌浓度为10⁶～10⁷cfu/ml，灌根于丹参根部周围；每7d灌根处理1次，共灌根2次。

本发明有益效果在于：本发明通过分离鉴定、促生特性检验和盆栽促生实验，首次从丹参根内分离出能够促进丹参生长的促生菌13-2，经鉴定为变栖克雷伯氏菌(klebsiellavariicola)。试验表明，本发明的变栖克雷伯氏菌具有促进丹参生长的作用，使丹参根部增长7.5％，鲜重增加55.6％，其效果与现有的常用化肥相似。丹参是以根部为药用的中药材，使用促生菌提高丹参根部生物量的积累，不仅提高了丹参的产量，而且有利于丹参有效成分的增加。本发明筛选的变栖克雷伯氏使用后不会有环境污染、农药残留等化学农药常见问题，对人畜健康、生态环境友好，符合人们对生态农业的需求。

附图说明

图1为菌株13-2分泌iaa定性测定图。

图2为菌株13-2的菌落形态显微图。

图3为菌株13-2对烟叶过敏性试验结果对比图。其中图左为阳性对照，图右为菌株13-2。

图4为菌株13-2对丹参盆栽促生试验结果对比图。图左为接种lb培养基，图右为接种菌株13-2。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。

(一)促生菌的分离

取新鲜无病害的丹参植株根部，先用流水冲洗30min，然后用无菌水冲洗5次后，对材料表面进行消毒，先用75％乙醇浸泡45s，然后用0.1％升汞中浸泡3min,无菌水冲洗3～4次。无菌条件下，用灭菌剪刀将根段剪成3mm×3mm小块，接种到lb培养基上，28℃避光培养1～2d，至菌落长出，挑取颜色、大小或形态不同的菌落在lb固体培养基表面划线分离纯化，获得3株菌株，并分别命名为13-1、13-2和13-3。

(二)iaa测定

将菌种13-2接种于14mllb液体培养基中，每菌株重复3次，以不接菌lb培养基为对照，28℃、180r/min条件下振荡培养3d。吸取菌液200μl于白瓷板上，加等体积spot比色液，其中标准液加200μl3-吲哚乙酸(20ug/ml)，将白瓷板放置于室温黑暗条下，20min内观察并记录颜色变化，如图1所示，发现13-2颜色变为粉红色，即能分泌iaa。

iaa标准曲线制定，精确称取iaa10mg，先用少量乙醇溶解，后用蒸馏水定容至100ml(其浓度为100μg/ml)作为贮备液，然后用贮备液配成0、100ug/ml、75ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、20ug/ml、15ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、1ug/ml的系列标准液，作为工作液(现用现配)。10ml离心管中依次加入iaa系列浓度工作液2ml，比色液4ml，黑暗培养20min，于535nm下比色，以od值为横坐标，以iaa浓度为纵坐标，绘出一条标准曲线。

iaa定量测定，将菌种13-2在lb培养液中开始液体培养，并在摇床中过夜培养。将菌液od600调整到1.0，在灭过菌的15ml离心管中加2.625mlkb培养液和20ul的od1.0发酵剂培养，用于色氨酸独立生产。另外一支加入625ull-色氨酸(2mg/ml)(色氨酸过滤除菌)和2ml的lb培养液，并加入20ul的od值1.0的菌液。每处理重复3次。将培养管在摇床中28℃，180r，培养48小时。吸取菌液至1.5ml管，5500xg，离心10分钟。吸取1ml上清液，放入玻璃管中，加入4mlsalkowski'sreagent比色液摇匀，在室温下黑暗中培养20分钟。通过测量535nm处的吸光度来测量iaa的产生。根据标准曲线绘制值，测的13-2产iaa质量浓度可达到53.1μg/ml。

(三)促生菌鉴定

菌株形态及生理生化：13-2革兰氏染色阴性，在lb培养基上，28℃培养48h的菌落形态圆形凸起，表面光滑湿润，乳黄色，半透明，培养基无色(图2)。能利用葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇、丙二酸钠，明胶液化，可解无机磷，有固氮性，不能解有机磷、水解淀粉、产嗜铁素，过氧化物酶、v-p测试呈阳性，甲基红试验为阴性。

(四)促生菌测序

16srdna基因测序结果为：

(五)菌剂生产

将变栖克雷伯氏菌(klebsiellavariicola)13-2接种于lb培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养12h制备种子菌，种子菌以2％的接种量接种于lb培养基中，在28℃、180rpm条件下发酵48h，形成发酵液，即为菌剂。所述的菌剂中变栖克雷伯氏菌活菌浓度为10⁷～10⁸cfu/ml。

(六)菌剂对烟叶过敏性试验

用制备好的菌剂，对烟草下表皮进行皮下接种，以10mmmgso4为阴性对照，以烟草野火菌为阳性对照(yh)。在24℃，60％-80％的高湿度条件下，经24-48h后出现过敏性坏死枯斑的为阳性反应，3d后出现黄斑的为阴性反应。结果发现，如图3所示，变栖克雷伯氏菌13-2过敏性试验为阴性反应，因此变栖克雷伯氏菌13-2无致病性，可作为促进丹参生长的促生菌。

(七)盆栽促生试验

将丹参种子在灭过菌的滤纸上萌发，然后移入灭菌后营养钵培养30天，再移入直径15cm的圆形盆中继续生长15d。采用灌根法接种促生菌，灌根前用少量清水湿润土壤，于根际接种变栖克雷伯氏菌13-2发酵液(活菌浓度为10⁷～10⁸cfu/ml)，发酵液用无菌水稀释10倍，每株10ml，间隔7d再接种10ml，对照组同样方法接入等量lb培养基(ck)。培养条件(24h)16h光照、28℃，8h黑暗、28℃，75％湿度。待接种60d后，小心将苗整株挖出，洗去根部泥土，测量并记载各处理丹参苗株高、根长、主根数、地上部分鲜重、地上部分干重、根鲜重、根干重，对比参数结果如表1，生长状态对比如图4所示。

表1：变栖克雷伯氏菌13-2对丹参的促生分析

结果表明，变栖克雷伯氏菌13-2能够促进丹参株高、根长的增加，提高地上部分鲜重及干重、地下部分鲜重及干重，说明变栖克雷伯氏菌13-2具有良好的促生作用。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>河南省农业科学院植物保护研究所

<120>一种能够产生iaa并且能促进丹参生长的变栖克雷伯氏菌及其应用

<141>2021-01-07

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1017

<212>dna

<213>klebsiellavariicola

<400>1

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