一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和植物学技术领域，特别涉及到一种快速提高丹参中迷迭香 酸含量的方法。
【背景技术】
[0002] 丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge)又名赤参、紫丹参，为唇形科鼠尾草属多年生 草本植物丹参的根。丹参中的药用活性成分主要分为丹参酮和丹参酚酸两大类。丹参具有 活血化淤、清热解毒、通经、凉血消肿、镇静安神之功效，广泛应用于心脑血管疾病的治疗。
[0003] 丹参酮（tanshinone)是中药丹参的根的提取物，其中含有丹参酮II A、丹参酮I、 隐丹参酮、丹参酮II B等40余种化合物。丹参酮对心血管系统具有广泛的作用，主要表现 为内皮细胞保护作用、抗心肌缺血作用、改善血液代谢作用以及对心肌的保护作用。其作用 机制研究证明，丹参酮对内细胞缺血再灌注性损伤有保护作用，可以抑制低密度脂蛋白的 氧化，抑制脂制代谢酶的活性，改善脂质代谢过程，对于防治心血管疾病有良好作用（中国 专利【申请号】200610005271. 1，公告号：CN100362993C，发明名称：一种丹参酮乳剂及其制 备方法）。
[0004] 丹参酚酸类化合物是存在于丹参或其同属植物中的酚酸类化合物，其中含有丹参 酚酸A、丹参酚酸B (LAB)、迷迭香酸（RA)等多种化合物。丹参酚酸类化合物对于心脑血管 具有保护作用。能够抗纤维化，抗肝损伤。可治疗消化性溃疡。还能杀伤癌细胞，增强抗癌 药物的疗效，且不会相应增加抗癌药物的毒性。丹参酚类化合物没有明显的毒副作用（中 国专利【申请号】200510094596. 7,公告号：CN1762341B，发明名称：治疗心脑血管疾病、肝脏 疾病的丹参酚酸复合物及其应该用）。
[0005] 迷迭香酸（Rosmarinicacid，简称RosA)是一种天然多功能酸酸类化合物。迷迭香 酸具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏、抗氧化、抗血栓抗血小板聚集、防辐射和免疫抑 制作用，迷迭香酸对神经系统有抗焦虑作用，对细胞损伤有保护作用，广泛应用于医药、食 品、化妆品等方面。最新研究表明，丹参中迷迭香酸有抗艾滋病病毒（HIV)活性（参见文献： William H? William BL. Inhibitors of human immunodeficiency virus type lreverse transcriptase target distinct phases of early reverse transcription. Journal of virology，2001，75 :3095-3104)。
[0006] 随着丹参有效成分及其药理活性的深入研究，近年来以丹参为主要原料的药品、 制剂、化妆品和系列保健产品层出不穷，丹参资源供不应求。伴随着丹参药材需求的日益扩 大和野生资源的逐渐减少，质量参差不齐，加剧了丹参的供需矛盾。目前提高丹参有效成份 的方法有人工栽培配合茉莉酸诱导，毛状根培养，转基因毛状根培养，茉莉酸诱导毛状根， 水杨酸诱导丹参培养细胞等等；提高的成份主要是丹参酮类（包括隐丹参酮、丹参酮IIA、 丹参酮I和二氢丹参酮I)和丹酸酸类（包括丹酸酸、丹酸酸B、迷迭香酸和丹酸酸K)。
[0007] 因此提高丹参中有效成分的含量，尤其是迷迭香酸的含量，对培育优异的丹参资 源具有重要意义。
[0008] 目前尚无文献报道丹参细胞系悬浮细胞培养提高迷迭香酸含量的方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法，是用丹参细胞系 悬浮细胞培养方法，提高丹参中有效成分一迷迭香酸的含量。
[0010] 本发明的主要技术方案是：通过将愈伤组织转接至液体培养基、反复继代，并通过 茉莉酸甲酯进行诱导培育出迷迭香酸含量高的丹参细胞系，实现人工培养，达到规模化生 产的目的。
[0011] 本发明提供了一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法，该方法主要由以下步骤 组成：
[0012] A、外植体处理：取丹参种子作为外植体，进行清洗和消毒，将干燥的种子接种到 MS空白培养基上，培养成为无菌苗，在无菌状态下将丹参无菌苗幼叶、茎、根分别剪下，将叶 片制成块，茎及根制成段；
[0013] B、愈伤组织的诱导：选用MS作为丹参愈伤组织诱导的基本培养基，将步骤A制备 好的外植体接种于MS培养基附加0. 5mg/L的2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D)、0. 5mg/L的6-苄 氨基腺嘌呤（6-BA)、0. 5mg/L的萘乙酸（NAA)，培养基的蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为1%， pH值为5. 0-6. 5,在光照12小时/天，光照强度为3000Lux条件下培养30天，温度为25°C， 得到颜色有光泽呈鲜黄绿色，生长旺盛，疏松的愈伤组织；
[0014] C、细胞的悬浮培养：将步骤B得到的愈伤组织接种到于与步骤B中所使用的MS培 养基相同组分和含量的液体培养基中，培养温度28°C，黑暗条件下，120r/min振荡培养，每 18-20天进行一次继代培养，继代培养3-15次后得到分散性良好的悬浮细胞系；
[0015] D、茉莉酸甲酯诱导丹参悬浮细胞：在无菌条件下，取新鲜继代5次以上得到丹参 悬浮细胞，按悬浮细胞体积计算，将茉莉酸甲酯用无菌注射器通过无菌过滤膜注入悬浮细 胞系中，终浓度为0.1 mM/L，培养至12天以上较优为14天，即得到迷迭香酸含量高的丹参细 胞系。
[0016] 其中步骤A中，较优的，叶片制成0. 5X0. 5cm的块，茎及根制成1cm的段。
[0017] 其中在步骤B中，较优的，培养基中还添加了 0. lmg/L的Vc。
[0018] 步骤8中，2,4-〇母液的配置方法：取1〇11^2,4-〇，先溶于95%乙醇中，然后加入 去离子水加热溶解，定容至l〇〇mL，冷藏保存；
[0019] NAA母液的配置方法：取50mg NAA，先溶于少量1 mol/L的氢氧化钠中，然后用去 离子水定容至l〇〇mL，冷藏保存；
[0020] 6-BA母液的配置方法：取50mg 6-BA，先溶于少量1 mol/L的氢氧化钠中，然后用 去离子水定容至100mL，冷藏避光保存。
[0021] 步骤B中，pH值较优为6. 0-6. 5。
[0022] 步骤C中，所述的愈伤组织为颗粒细小、疏松易碎、外观湿润鲜艳的白色或淡黄色 愈伤组织。
[0023] 术语解释，本文中"外植体"指由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或 器官。
[0024] MS空白培养基、MS、MS基本培养基、MS固体培养基，表示同一意思，是指MS培养基， 固体的是添加有琼脂的MS培养基，液体是未添加琼脂的培养基，MS粉末（不含蔗糖）可直 接购自上海前尘生物科技有限公司。
[0025] Lux条件是指光照强度。
[0026] 液体培养基是指未添加琼脂的培养基。
[0027] 继代培养是对来自于外植体所增殖的培养物（包括细胞、组织或其切段）通过更 换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养
[0028] 悬浮细胞系是由单一细胞增殖产生的遗传背景一致的悬浮细胞。
[0029] 本发明的方法克服了丹参作为常异交植物，种内变异较大，性状复杂；栽培丹参只 种不选的状况使得各产地丹参质量参差不齐，品种退化严重，有效成分含量不稳定的问题。 本发明经高效液相（HPLC)实验证明，有效成份4-香豆酸、肉桂酸、L-苯丙氨酸、4-羟基苯 丙酮酸、尿黑酸、L-酪氨酸、迷迭香酸和丹酚酸B提高。特别是能够快速提高丹参中迷迭香 酸的含量。
[0030] 本发明的方法操作简单，能够生产出迷迭香酸含量高的丹参细胞系，满足了市场 需求。
【附图说明】
[0031] 图1悬浮细胞显微图，其中A是三五个成群聚集在一起的丹参悬浮细胞、B是成熟 的细胞，细胞核比较小、C是小圆形的成熟细胞，细胞核比较大。
[0032] 图2悬浮细胞TTC染色图。
[0033] 图3经MeJA诱导后丹参悬浮细胞的含量测定结果。
【具体实施方式】
[0034] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0035] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商 所建议的条件。
[0036] 实施例1 :
[0037] 1、外植体处理：用自来水冲洗丹参（S. miltiorrhiza Bunge)种子4小时以上，之 后将其浸泡在75%的乙醇溶液中30秒，然后用无菌去离子水冲洗5次，再用浓度为0. 1% 的升汞溶液（lg/L HgCl2)浸泡10分钟，最后用无菌水冲洗5次，用无菌的纱布将其擦干净， 将擦净的种子接种到MS培养基（购自上海生工生物工程公司）上，培养数周后将长成为无 菌苗。取无菌丹参幼苗，用去离子水冲洗干净，并用软毛刷轻轻刷洗，在无菌条件下将丹参 无菌苗幼叶、茎、根分别剪下，用剪刀将叶片切成0. 5X0. 5cm，上表皮向下接种诱导在MS培 养基上，茎及根切成lcm小段。
[0038] 2、激素的配置：
[0039] 2, 4-D母液（100mg/L，购自上海源叶生物科技有限公司）：取10mg2, 4-D，先溶于 95%乙醇中，然后加入去离子水加热溶解，定容至100mL，冷藏保存。
[0040] NAA母液（500mg/L，购自上海源叶生物科技有限公司）：取50mgNAA，先溶于少量1 mol/L的氢氧化钠中，然后用去离子水定容至100mL，冷藏保存。
[0041] 6-BA母液（500mg/L，购自上海源叶生物科技有限公司）：取50mg6-BA，先溶于少量 1 mol/L的氢氧化钠中，然后用去离子水定容至lOOmL，冷藏避光保存。
[0042] 3、愈伤组织的诱导：选用MS(购自上海生工生物工程公司）作为丹参愈伤组织诱 导的基本培养基，将步骤1备好的外植体接种于基本培养基附加表1中2, 4-D、6-BA、NAA不 同浓度，培养基的蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为1 %，pH值为6. 3,在光照12h/d，光照强度 为3000Lux条件下培养30d，温度为25°C，得到颜色有光泽呈鲜黄绿色，生长旺盛，疏松的愈 伤组织。
[0043] 表1诱导愈伤组织培养基
[0044]
[0045] 表2不同激素配比对愈伤组织诱导的影响
[0046]
[0048] 4、细胞的悬浮培养：挑选步骤3中颗粒细小、疏松易碎、外观湿润鲜艳的白色或淡 黄色愈伤组织接种到与步骤3中所使用的MS固体培养基相同组分和含量的液体培养基中， 培养温度28°C，黑暗条件下，120r/min振荡培养，每19天进行一次继代培养，继代培养5次 后得到分散性良好的悬浮细胞系。
[0049] 5、茉莉酸甲酯诱导丹参悬浮细胞：在无菌条件下，取新鲜继代5次以上得到丹参 悬浮细胞，按悬浮细胞体积计算，将茉莉酸甲酯（购自SIGMA)用无菌注射器通过无菌过滤 膜注入悬浮细胞系中，终浓度为0.1 mM/L，培养12天得到迷迭香酸含量高的丹参细胞系。
[0050] 实施例2 :
[0051] 步骤3中基本培养基中还加入了 0. lmg/LVc，防褐变，其余步骤同实施例1。
[0052] 实施例 3-7 :
[0053] 步骤4中悬浮细胞培养液体培养基的激素配比按表1编号3-8,共6组，其余步骤 同实施例1。进入悬浮培养阶段的各激素配比下的丹参悬浮细胞形态见表3,实施例1中的 3号激素配方获得了生长状