态最佳的悬浮细胞。
[0054] 表3各种悬浮细胞系的形态
[0055]
[0056] 实施例8 :丹参悬浮细胞形态观察
[0057] 丹参悬浮细胞一般呈圆形或长圆形，体积小。三五个成群聚集在一起，个别单个存 在。小圆形的细胞，细胞核比较大；成熟的细胞，细胞核比较小，细胞质中有颗粒状物质存 在。培养15天，可见许多圆形细胞，此时，细胞体积大；培养20天，细胞进入停滞期，处于休 眠状态，此时多见长形死细胞。定期更新新鲜培养液，细胞又逐渐增大。
[0058] 分别将表3中六组丹参悬浮细胞置于显微镜下观察（10X40)，观察结果如图1所 示（图1是3号的结果）。
[0059] 实施例9 :丹参悬浮细胞TTC法活性测定
[0060] TTC活性测定操作过程：无菌条件下向lmL丹参悬浮细胞液中添加 lmL 0. 4% TTC 溶液，充分混匀后于室温下暗反应3~6h。反应完成后具有生命力的细胞染成红色，死细胞 不染色，4500rpm离心后真空吸取上清液，去离子水洗涤3遍。放置血球计数板上记录活细 胞数目。
[0061] 图2为六组不同激素浓度配比下的TTC染色结果图，从左到右编号依次为1~6号 分别为表1中5,4, 3,6, 7,8号激素配比下的细胞，活细胞由于呼吸作用产生红色物质TTF， 表明丹参悬浮细胞为正常生长并具有活性的细胞。
[0062] 实施例10 :LC_MS/MS测定丹参中酚酸类化合物含量
[0063] 1、对照品、供试品溶液的制备及色谱分离条件
[0064] 用甲醇将精密称取尿黑酸、LAB、L_酪氨酸和肉桂酸溶解，用水将L-苯丙氨酸和RA 溶解，用50%甲醇将精密称取4-羟基苯丙酮酸和4-香豆酸溶解，分别制成每1 mL含丹酚 酸B、迷迭香酸、肉桂酸、尿黑酸、酪氨酸、苯丙氨酸、4-羟基苯丙酮和4-香豆酸lmg作为对 照品溶液。
[0065] 将3号配方制备得到的丹参悬浮细胞置于37°C恒温烘箱中干燥，干燥后研磨成 粉，称取50mg，过100目筛，30%乙醇25mL，超声提取两次，每次lOmin，4500rpm离心5min， 滤液用50mL容量瓶定容至50mL，滤液用0. 2 μ Μ微孔有机滤膜过滤，进样。
[0066] 色谱柱：美国 Agilent公司，Agilent Zorbax SB C183. 5 μπι 150X2. 1mm ID，采用 等梯度洗脱方式，流速〇. 3mL/min，进样量10 μ L，流动相：乙腈-水（55:45)，柱温30°C，分 析时间3. 5min。
[0067] 2、质谱检测条件及LC-MS/MS测定丹参中酚酸类化合物的方法学考察
[0068] 采用ESI离子源、负离子检测，选择MRM工作方式进行一 /二级质谱分析。质谱 检测工作参数如下：Gas Flow 10L/min、Gas Temp 35CTC、Nebulizer40psi、MS2Heater 100 °C、Capillary 4000V、Rough Vac 2. 05E+0Torr、Tu;rbolspeed 100 %、MSIHeater 100°C、High Vac 3.03E-5Torr、Turbolpowerl30w。优化的多反应监测（MRM)参数见表 4〇
[0069] 表4.优化的多反应监测（MRM)参数
[0071] 注：表中LAB表示丹酸酸B，RA表示迷迭香酸。
[0072] 3. 1线性考察
[0073] 精密吸取lmg/mL的标准对照品溶液适量，分别置于5个5mL的容量瓶中，定容至 容量瓶刻度，分别配置成不同浓度的标准溶液，摇匀后进样，以样品浓度C为横坐标，峰面 积A为纵坐标绘制标准曲线，计算线性相关系数r。结果见表5。
[0074] 表5标准曲线测定结果（η = 5)
[0076] 3· 2精密度试验
[0077] 取上述标准曲线制备项下LAB对照品溶液（30000ng/mL)、RA对照品（12000ng/ mL)、L-苯丙氨酸对照品（16ng/mL)、尿黑酸对照品（200ng/mL)、肉桂酸对照品（10ng/mL)、 4-香豆酸对照品（2ng/mL)、4-羟基苯丙酮酸对照品（120ng/mL)和L-酪氨酸对照品（14ng/ mL)，连续重复进样六次，记录峰面积，计算相对标准偏差RSD。结果表明精密度良好，如表6 所示。
[0078] 表6精密度测定结果（η = 6)
[0079]
[0080] 3. 3重现性试验
[0081] 供试品溶液均由同一样品制备，连续测定6次，记录色谱峰面积，计算RSD，进行重 复性考察。重现性试验结果表明重现性良好，结果如表7所示。
[0082] 表7重现性测定结果（η = 6)
[0083]
[0084] 3. 4最小检测限
[0085] 取4-香豆酸、肉桂酸、L-苯丙氨酸、4-羟基苯丙酮酸、尿黑酸、L-酪氨酸、迷迭香 酸和丹酚酸B储备液，用流动相稀释至不同浓度的样品溶液，取10 μ L注入液相色谱仪测定 最小检测量。以信噪比大于3估算最小检测量，结果：肉桂酸、尿黑酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨 酸、4-香豆酸、RA、LAB和4-羟基苯丙酮酸主峰的最小检测量分别约为0. 60ng/mL、1. Ong/ mL、0. 8ng/mL、3. 5ng/mL、0. 42ng/mL、0. 17ng/mL、12. Ong/mL和 3. Ong/mL〇
[0086] 3. 5样品溶液稳定性试验
[0087] 取供试样品，制备定量供试品溶液，在仪器运行的情况下，0间隔（0,2,4,6，12， 24h)每隔两小时进样，记录峰面积，计算RSD。结果，24h内尿黑酸、L-苯丙氨酸、4-羟基苯丙 酮酸、肉桂酸、4-香豆酸、L-酪氨酸、RA和LAB样品溶液中的响应峰面积稳定，RSD < 5. 0%， 如表8所示。
[0088] 表8.样品溶液稳定性测定结果
[0089]
[0090] 3. 6样品含量测定
[0091] 取各个供试品溶液样品，按外标法计算供试品中肉桂酸、4-香豆酸、4-羟基苯丙 酮酸、尿黑酸、迷迭香酸、丹酚酸B、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸含量。
[0092] 对数生长期后期和稳定期开始阶段为诱导子的最佳添加时间，本实验选择继代5 次后的悬浮细胞添加 MeJA(0.1 mM)。考察诱导3d、6d、9d、12d后，利用LC-MS/MS对丹参中 酚酸类化合物（丹酚酸B、迷迭香酸、肉桂酸、尿黑酸、酪氨酸、苯丙氨酸、4-羟基苯丙酮和 4_香豆酸）的影响。结果表明：在MeJA(0.1 mM)作用下，丹参悬浮细胞中的丹参酚酸类成 分以及参与迷迭香酸合成的途径中的代谢产物含量均有不同程度的抑制或促进，不同程 度的促进了酪氨酸、尿黑酸、对羟基苯丙酮酸和香豆酸的积累。与未处理的空白悬浮细胞 (CK)相比，分别提高了酚酸类成分LAB 4. 95倍（25046. 03±7· 82mg/g，DW)，和RA 3. 49倍 (8946. 7±mg/g，DW)，MeJA对RA的诱导作用在处理后的第12天达到最高峰后呈下降趋势， 随着培养时间的增长，含量逐渐降低。然而，MeJA对L-苯丙氨酸的积累抑制作用，第3天 开始含量逐渐下降，在第12天含量有增加的趋势；4-羟基苯丙酮酸经诱导后与对照相比， 在第12天达到最大值。图3显示MeJA (0.1 mM)对丹参悬浮细胞中各化合物积累的影响。
[0093] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
【主权项】
1. 一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法，包括如下步骤： A、 外植体处理：取丹参种子作为外植体，接种到MS空白培养基上，培养成为无菌苗，在 无菌状态下将丹参无菌苗幼叶、茎、根分别剪下，叶片成块，茎及根成段； B、 愈伤组织的诱导：选用MS作为丹参愈伤组织诱导的基本培养基，将步骤A制备好的 外植体接种于MS培养基中添加0. 5mg/L的2, 4-二氯苯氧乙酸、0. 5mg/L的6-节氨基腺噪 呤、0. 5mg/L的萘乙酸，培养基的蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为1%，pH值为5. 0-6. 5,在光 照12小时/天，光照强度为3000LUX条件下培养30天，温度为25°C，得到颜色有光泽呈鲜 黄绿色，生长旺盛，疏松的愈伤组织； C、 细胞的悬浮培养：将步骤B得到的愈伤组织接种到于与步骤B中所使用的MS培养 基相同组分和含量的液体培养基中，培养温度28°C，黑暗条件下，120r/min振荡培养，每 18-20天进行一次继代培养，继代培养3-15次后得到分散性良好的悬浮细胞系； D、 茉莉酸甲酯诱导丹参悬浮细胞：在无菌条件下，取新鲜继代5次以上得到丹参悬浮 细胞，按悬浮细胞体积计算，将茉莉酸甲酯用无菌注射器通过无菌过滤膜注入悬浮细胞系 中，终浓度为0.1 mM/L，培养12天以上。2. 根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的 步骤A中，叶片制成0. 5X0. 5cm的块，莖及根制成lcm的段。3. 根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的 步骤B中，MS培养基中还添加了 0. lmg/L的Vc。4. 根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的 步骤B中，2, 4-二氯苯氧乙酸的配置方法如下： 取10mg的2, 4-二氯苯氧乙酸，先溶于95%乙醇中，然后加入去离子水加热溶解，定容 至100mL，冷藏保存。5. 根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的 步骤B中，6-苄氨基腺嘌呤的配置方法如下： 取50mg的6-苄氨基腺嘌呤，先溶于少量1 mol/L的氢氧化钠中，然后用去离子水定容 至100mL，冷藏避光保存。6. 根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的 步骤B中，萘乙酸的配置方法如下： 取50mg的萘乙酸，先溶于少量1 mol/L的氢氧化钠中，然后用去离子水定容至100mL， 冷藏保存。7. 根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的 步骤B中，pH值为6. 0-6. 5。8. 根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的 步骤C中，所述的愈伤组织为颗粒细小、疏松易碎、外观湿润鲜艳的白色或淡黄色愈伤组 织。
【专利摘要】本发明涉及生物技术和植物学技术领域，本发明提供了一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法，是将外植体接种于MS基本培养基附加2,4-D、6-BA、NAA在一定条件下培养得到颜色有光泽呈鲜黄绿色，生长旺盛，疏松的丹参愈伤组织；将上述愈伤组织接种到于与上述所使用的MS固体培养基相同组分和含量的液体培养基中，一定条件下振荡培养，反复继代，得到分散性良好的悬浮细胞系并通过茉莉酸甲酯进行诱导培育出迷迭香酸含量高的丹参细胞系，实现人工培养，达到规模化生产的目的。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105613285
【申请号】CN201410606226
【发明人】季倩, 张磊
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年10月31日