一种柠檬酸转运蛋白及其在脂质合成中的应用

1.本发明涉及一种柠檬酸转运蛋白及其在脂质合成中的应用，属于基因工程和微生物工程技术领域。


背景技术：

2.随着健康饮食观念的不断普及，人们对多不饱和脂肪酸的需求不断增加。然而，随着耕地面积的减少及海洋环境的污染，植物、动物及藻类油脂已经无法满足人们的需要。微生物油脂是继植物油脂、动物油脂之后人类开发出的又一种食用油脂。一些产油微生物可积累丰富的多不饱和脂肪酸(pufas)，如epa、aa等。食用适量富含pufas的微生物油脂，可明显降低高脂、高胆固醇血症患者血浆内的脂质和胆固醇水平，同时提高血浆内载脂蛋白和高密度脂蛋白水平，因而微生物油脂价值更高。另外产油微生物的适应性强，繁殖速度快，生产周期短，同时也不受场地、气候、季节的影响，一年四季可连续生产；因而微生物油脂作为食用油脂新能源，尤其是保健类功能性油脂，受到研究者越来越多的关注。微生物油脂发酵可能是生物经济的重要研究方向。
3.随着分子操作技术的发展，微生物油脂的研究已经从发酵工艺优化转向油脂合成积累关键基因的调控。比如苹果酸酶(me)、葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶(g6pd)、6
‑
磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6pgd)、二酰甘油转移酶(gdat)、一磷酸腺苷脱氨酶(ampd)、atp
‑
柠檬酸裂解酶(acl)等。而胞质柠檬酸是脂质积累前体物质乙酰辅酶a的主要来源，它还可以增加胞质中乙酰辅酶a羧化酶的活性从而促进脂质合成。外源添加柠檬酸容易改变胞质中的稳态环境，造成产油微生物的生长受到影响。因而从基因层面改变胞质中的柠檬酸含量可以使微生物自身达到一个稳态平衡，进而使更多的柠檬酸用于脂质合成积累，微生物的生长也不会受到影响。
4.柠檬酸转运蛋白在线粒体柠檬酸往胞质运输的过程中发挥重要的作用，目前只有一株产油含量相对更高的卷枝毛霉wj11的柠檬酸转运蛋白(ctp)基因在油脂含量相对较低的卷枝毛霉cbs 277.49中过表达，增加了低产油菌株cbs 277.49中的油脂含量。根据目前的报道，微生物中存在两种类型的柠檬酸酸转运蛋白，第一种是ctp，其负责线粒体柠檬酸运输至胞质中的同时将胞质苹果酸运输至线粒体。第二种是柠檬酸
‑
酮戊二酸转运蛋白(yhm)，其负责线粒体柠檬酸运输至胞质中的同时将胞质酮戊二酸运输至线粒体。目前，第二种蛋白yhm还没有在产油丝状真菌中报道出其对脂质合成的影响。


技术实现要素：

5.鉴于目前对于微生物油脂的需求量日渐增长，而现有的产油微生物的油脂产能并不能满足这一需求，因而如何进一步提高微生物的油脂产能，成为一个迫切需要解决的问题。
6.为解决上述问题，本发明提供了一种柠檬酸转运蛋白，其特征在于，所述柠檬酸转运蛋白为如下所示任一：
7.(a)由seq id no.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
8.(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有柠檬酸转运蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。
9.本发明提供了编码所述的柠檬酸转运蛋白的基因。
10.在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.本发明提供了携带所述基因的重组质粒。
12.在一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pbig2
‑
ura5s
‑
its载体；所述pbig2
‑
ura5s
‑
its载体记载于公开号为cn103571762a的专利申请文本中。
13.本发明提供了表达所述蛋白或携带所述的基因的微生物细胞。
14.在一种实施方式中，所述宿主细胞为高山被孢霉、大肠杆菌或根癌农杆菌。
15.本发明提供了一种生产脂质的方法，所述方法为以葡萄糖为主要碳源、以酒石酸铵为主要氮源，利用所述微生物细胞发酵生产脂质。
16.在一种实施方式中，将所述微生物细胞在含有葡萄糖和酒石酸铵的kendrick培养基中培养生产脂质。
17.在一种实施方式中，在12～28℃、转速为150～250rpm的条件下培养7～12d，得到含有脂质的微生物细胞，从含有脂质的微生物细胞中提取得到脂质。
18.在一种实施方式中，所述脂质为磷脂、甘油三酯或游离脂肪酸。
19.本发明提供了所述柠檬酸转运蛋白，或所述基因，或所述重组质粒，或所述宿主细胞在生产脂质方面的应用。
20.有益效果：
21.本发明的氨基酸序列如seq id no.1所示的柠檬酸转运蛋白具有促进微生物产脂肪酸的功能，将过表达本发明柠檬酸转运蛋白的重组高山被孢霉摇床培养7d，可使过表达本发明柠檬酸
‑
酮戊二酸转运蛋白的高山被孢霉中的脂肪酸含量达细胞干重的36.1％，较不含本发明柠檬酸
‑
酮戊二酸转运蛋白的高山被孢霉提升30.3％，该结果为通过基因工程手段进一步提升高山被孢霉等产油微生物产脂肪酸的能力，进而为提高脂肪酸的生物合成能力提供了充实的理论支持。
附图说明
22.图1为mayhm与ncbi中已鉴定功能的柠檬酸
‑
酮戊二酸转运蛋白的氨基酸序列比对结果。
23.图2为重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，m表示marker，b1和b2表示阴性对照(b1为转入空质粒的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株、b2为转入空质粒的根癌农杆菌)，编号1～4表示4个阳性转化子(转入重组质粒的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株)。
具体实施方式
24.下述实施例中涉及的高山被孢霉(mortierellaalpina)atcc 32222购自美国标准生物品收藏中心(atcc)；下述实施例中涉及的根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)agl
‑
1购自北京华越洋生物；下述实施例中涉及的大肠杆菌(escherichia coli)top10购自
invitrogen公司；下述实施例中涉及的pbig2
‑
ura5s
‑
its载体记载于公开号为cn103571762a的专利申请文本中；下述实施例中涉及的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株记载于公开号为cn103468581a的专利申请文本中。
25.下述实施例中涉及的kod plus高保真dna聚合酶购自日本toyobo公司；下述实施例中涉及的taq dna聚合酶购自cwbio公司；下述实施例中涉及的质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；下述实施例中涉及的真菌基因组dna提取试剂盒购自bioflux公司；下述实施例中涉及的反转录试剂盒(revertaid first strand cdnasynthesis kit)、限制性内切酶(xhoi、kpni)、t4连接酶、trizol、pcr产物纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒、generuler dnaladder mix购自thermo scientific公司；下述实施例中涉及的正十五烷酸(c15:0)、20％(w/w)盐酸甲醇购自sigma公司；下述实施例中涉及的诱导转化剂乙酰丁香酮(acetosuringone，as，cas#[2478
‑
38
‑
8])、尿嘧啶(urail)、depc水、卡那霉素(kanamycin,kana)、利福平(rifampicin，rif)、壮观霉素(spectinomycin,spe)、头孢噻肟钠(cefotaxime,cef)、无氨基酵母氮源(ynb)和各类氨基酸购自上海生物工程有限公司；下述实施例中涉及的酵母提取物、胰蛋白胨购自oxoid公司；下述实施例中涉及的低吸附型无酶枪头、无酶离心管、无酶pcr管、2ml棕色气相瓶及瓶盖购自苏州科晴生物公司；其他试剂购自国药集团。
[0026]
下述实施例中涉及的载体构建和细菌感受态细胞制作均参考《分子克隆手册》。
[0027]
下述实施例中涉及的引物由上海华大基因公司合成，测序工作由上海华大基因公司完成。
[0028]
(高山被孢霉(mortierellaalpina)atcc 32222、根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)agl
‑
1以及大肠杆菌(escherichia coli)top10均可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)
[0029]
下述实施例中涉及的培养基如下：
[0030]
broth培养基：20g/l(活化)葡萄糖、5g/l酵母提取物、1g/l磷酸二氢钾、0.25g/l七水硫酸镁、10g/l硝酸钾。
[0031]
kendrick培养基：30g/l(产脂)葡萄糖、2.0g/l(产脂)酒石酸铵、1.5g/l酵母提取物、7g/l磷酸氢二钾、2.0g/l磷酸二氢钾、1.5g/l七水硫酸镁、0.008g/l二水氯化钙以及微量元素；其中，微量元素浓度为：0.001g/l七水氯化铁、0.0001g/l七水硫酸锌、0.0001g/l五水硫酸铜、0.0001g/l硝酸钴、0.0001g/l五水硫酸锰。
[0032]
gy培养基：20g/l葡萄糖、10g/l酵母提取物、2g/l硝酸钾、1g/l磷酸二氢钠、3g/l七水硫酸镁，用于固体培养基时添加20g/l的琼脂粉。
[0033]
mm基础培养基：1.74g/l磷酸氢二钾、1.37g/l磷酸二氢钾、0.146g/l氯化钠、0.49g/l七水硫酸镁、0.078g/l氯化钙、0.53g/l硫酸铵、1.8g/l葡萄糖、10ml/l七水硫酸铁(100x)、5ml/l甘油，灭菌后加入已滤菌的mes缓冲液至终浓度为7.8g/l。
[0034]
im诱导培养基：在mm培养基的基础上稍作调整，额外添加0.1g/l的尿嘧啶，葡萄糖改为0.9g/l，其余不变，使用前添加100μg/ml的乙酰丁香酮(as)和7.8g/l的mes，用于固体培养基时添加20g/l的琼脂粉，添加as的im培养基需避光保存。
[0035]
sc
‑
cs培养基：20g/l葡萄糖、5g/l无氨基酵母氮源、1.7g/l硫酸铵、10ml/l氨基酸母液(100x)、20g/l琼脂，倒平板前添加100μg/ml的头孢噻圬和100μg/ml的壮观霉素；
[0036]
其中，氨基酸母液：60mg/l异亮氨酸、60mg/l亮氨酸、60mg/l苯丙氨酸、50mg/l苏氨酸、40mg/l赖氨酸、30mg/l酪氨酸、20mg/l腺嘌呤、20mg/l精氨酸、20mg/l组氨酸、10mg/l甲硫氨酸。
[0037]
soc复苏培养基：20g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、0.5g/l氯化钠、0.186g/l氯化钾、0.95g/l氯化镁、3.6g/l葡萄糖。
[0038]
lb液体培养基：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/l氯化钠，使用前添加100μg/ml的卡那霉素，用于固体培养基时添加20g/l的琼脂粉。
[0039]
yep液体培养基：10g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白陈、5g/l氯化钠，使用前添加100μg/ml的卡那霉素和100μg/ml的利福平，避光保存，用于固体培养基时添加20g/l的琼脂粉。
[0040]
实施例1：编码柠檬酸
‑
酮戊二酸转运蛋白的基因的筛选
[0041]
具体步骤如下：
[0042]
以ncbi中已鉴定功能的耶式解脂柠檬酸
‑
酮戊二酸转运蛋白基因序列(ncbi id:yali0b10736p)为模板，在已完成测序的m.alpina atcc 32222菌株的基因库中进行blast比对，根据同源性>30％的条件，获得备选的目的基因序列(ma
‑
00120
‑
22)；将最终得到的目的基因命名为mayhm(核苷酸序列如seq id no.2所示)，对应蛋白命名为mayhm(氨基酸序列如seq id no.1所示)。
[0043]
mayhm对应cdna的全长为930bp，编码309个氨基酸。为了进一步判断筛选出的mayhm是否属于柠檬酸
‑
酮戊二酸转运蛋白，将其与ncbi中已鉴定功能的柠檬酸
‑
酮戊二酸转运蛋白进行氨基酸同源性和保守结构分析。
[0044]
如图1所示，比对结果表明，mayhm与ncbi中已鉴定功能的来自其它菌株的柠檬酸
‑
酮戊二酸转运蛋白具有较高同源性，且具备柠檬酸
‑
酮戊二酸转运蛋白的保守序列，因此，可判断mayhm为柠檬酸转运蛋白。
[0045]
实施例2：mayhm的克隆
[0046]
具体步骤如下：
[0047]
使用trizol法提取高山被孢霉(mortierellaalpina)atcc 32222的总rna，按照thermo反转录试剂盒说明书进行反转录获得cdna，在高山被孢霉(mortierellaalpina)atcc 32222的cdna文库中通过pcr反应扩增mayhm，扩增mayhm所用引物见表1。
[0048]
所用pcr仪为bio
‑
rad t100 thermal cycler，使用kod plus高保真dna聚合酶，反应体系为50μl，体系内容按照该dna聚合酶说明书内容进行；反应过程如下：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1.5min，重复上述三步骤30次，然后68℃充分延伸5min，最后降到12℃保持10min后停止。
[0049]
反应结束，得到扩增产物，对扩增产物进行纯化后通过1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物条带大小，获得mayhmdna片段。
[0050]
表1引物序列及其用途
[0051][0052]
实施例3：过表达mayhm重组菌的构建
[0053]
具体步骤如下：
[0054]
(1)高山被孢霉表达载体的构建
[0055]
使用限制性内切酶xhoi和kpni对实施例2获得的mayhmdna片段以及表达载体pbig2
‑
ura5s
‑
its进行酶切，然后利用t4连接酶将经酶切、纯化后的mayhmdna片段和pbig2
‑
ura5s
‑
its进行连接，获得连接产物，具体酶切体系(20μl)如表2。
[0056]
表2酶切体系
[0057]
试剂用量10
×
cutmart buffer2μl限制性内切酶1μlpcr产物或载体200ng～1μgddh2o补至20μl
[0058]
将获得的连接产物于4～16℃下过夜连接后，转化至大肠杆菌top10感受态细胞，转化方法如下：无菌状态下取100μl感受态细胞，加入5～8μl连接产物，吹吸混匀；将混匀的感受态细胞在冰上保存20～30min；将混匀的感受态细胞在42℃水浴锅上热击90s后，迅速置于冰上2min；加入1ml soc复苏培养基于化转后的感受态细胞中，混匀转移至1.5ml离心管中，37℃、150rpm孵育1h；取200μl涂布含有100μg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板，37℃倒置培养过夜；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pbig2
‑
ura5s
‑
mayhm。
[0059]
(2)高山被孢霉的转化筛选
[0060]
将获得的重组质粒pbig2
‑
ura5s
‑
mayhm通过电击转化法转入根癌农杆菌agl
‑
1，获得携带重组质粒pbig2
‑
ura5s
‑
mayhm的根癌农杆菌；使用含尿嘧啶的生理盐水刮取野生型高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的孢子，于4℃～28℃培养箱放置6～24h，获得萌发的孢子液；将携带重组质粒pbig2
‑
ura5s
‑
mayhm的根癌农杆菌分别在yep培养基中活化、mm培养基中培养和im培养基中诱导，取经im培养基诱导培养的根癌农杆菌测定od
660
，用im培养基梯度稀释为od
660
＝0.2～1.2，得到携带重组质粒pbig2
‑
ura5s
‑
mayhm的根癌农杆菌菌液；取携带重组质粒pbig2
‑
ura5s
‑
mayhm的根癌农杆菌菌液与孢子液100～200μl于无菌ep管中上下颠倒混匀，涂布于贴有玻璃纸的im固体培养基中于16～28℃的条件下避光共培养12～48h；共培养结束后，将带有共培养体系的玻璃纸转移至含有壮观霉素(spe)和头孢噻肟(cef)的sc
‑
cs培养基，于16～28℃的条件下进行培养，直至有菌落长出；菌落长出后，挑取菌落边缘新长出的菌丝，连续在新的sc
‑
cs培养基上于28℃的条件下培养12～48h进行传代培养；传代培养后，选取可以稳定生长的菌落，挑取至broth液体活化培养基中于28℃的条
件下培养2d，获得菌液；取菌液提取真菌基因组dna进行pcr验证，认为扩增得到目的条带的转化子为正确的阳性转化子(pcr结果如图2所示)；pcr验证共获得4个阳性转化子，将这些阳性转化子进行测序，各转化子中过表达的mayhm的碱基序列与高山被孢霉基因组中的序列数据一致，证实所选4个阳性转化子在基因组水平验证正确，获得携带mayhm基因的重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm；其中，pcr使用taq酶体系进行，所用引物为质粒载体pbig2
‑
ura5s
‑
its的通用引物，具体序列如下：
[0061]
上游引物hispro f1：cacacacaaacctctctcccact(seq id no.5)；
[0062]
下游引物trpcr 1：caaatgaacgtatcttatcgagatcc(seq id no.6)。
[0063]
由图2可知，泳道m为marker，1
‑
4为4株mayhm过表达重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm，b1为原养型高山被孢霉，b2为空载质粒提取物。使用通用引物进行pcr验证，携带重组质粒pbig2
‑
ura5s
‑
mayhm的根癌农杆菌的t
‑
dna区域的尿嘧啶回补标记ura5s和目的基因mayhm可被成功扩增出来，第i条带为mayhm特征条带，大小约为1010bp；第ⅱ条带为ura5s特征区域，大小约为810bp；第ⅲ条带为二元载体pbig2
‑
ura5s
‑
its上的it片段，为空载特有。条带大小符合理论值，说明目的基因被成功转入高山被孢霉中。
[0064]
实施例4：重组高山被孢霉的生长和产脂
[0065]
具体步骤如下：
[0066]
以高山被孢霉原养型菌株为阴性对照，取重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm以及高山被孢霉原养型菌株的单孢子接种于broth培养基中，于28℃的条件下培养2d进行活化；连续活化三代，离心，收集活化后的菌体；将菌体打碎至均匀菌絮状；将打碎的菌体以1％(v/v)的接种量接种到限氮kendrick培养基中，于28℃、200rpm摇床培养7d后，离心，收集菌体，真空冷冻干燥至恒重，称量菌体重量，计算生物量，计算结果见表2；将菌体研磨成粉末，称取50mg，精确加入100μl 2mg/ml的c15:0作为内标，加入2ml 4mol/l的盐酸充分混匀；80℃水浴1h，
‑
80℃放置15min；重复3次后冷却至室温，加入1ml甲醇和1ml氯仿，混匀，震荡2min；3000g离心10min；收集氯仿层于新的提脂瓶中；重复此步骤两次；合并氯仿层，氮吹干燥后加入1ml 10％的盐酸
‑
甲醇，60℃水浴3h进行甲酯化处理；之后在上述甲酯化处理体系中加入1ml饱和氯化钠和1ml正己烷，混匀，3000g离心10min，重复此步骤两次；收集正己烷层于新瓶，剩余液体继续加入1ml正己烷，震荡混匀1min后于3000g离心10min；合并正己烷层，氮吹干燥，加入1ml正己烷回溶，即获得脂肪酸甲酯；使用gc
‑
ms检测菌体中脂肪酸的组成及含量，检测结果见表3
‑
4；
[0067]
其中，脂肪酸甲酯分析采用gc2010(shimadzu co.，japan)，色谱柱为db
‑
waxetr(30m
×
0.32m，0.22μm)；氢火焰离子检测器检测，汽化室和检测器温度分别为240℃和260℃，分流方式进样1ul，分流比10:1，载气为氮气；程序升温：初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min升到220℃，保持20min；通过与商业化的脂肪酸甲酯标准品(37种脂肪酸甲酯混标，supelco，usa)和加入内标c15:0的质量比较，定性、定量分析样品中脂肪酸组分，总脂肪酸含量用单位菌体中总脂肪酸的质量表示。
[0068]
由表3可知，与原养型高山被孢霉相比，4株重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm的生物量略有上升，但无显著差异。与原养型高山被孢霉相比，4株重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm的去脂生物量无显著差异。说明过量表达目的基因mayhm对重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm的生长不造成负面影响，重组菌株生长良好。
[0069]
表3重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm以及高山被孢霉原养型菌株的生物量以及菌体中脂肪酸的含量
[0070][0071]
由表3可知，4株重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm中的脂肪酸含量(细胞干重％)和脂肪酸产量(g/l)均明显提高。脂肪酸含量较阴性对照组分别提高23.2％，18.5％，30.4％和21.8％；脂肪酸产量分别较阴性对照组提高23.9％，25.6％，42.9％和25.6％，提升最明显的转化子3的生物量达到3.3g/l，脂肪酸含量达到细胞干重的36.1％，说明，过量表达目的基因mayhm对脂肪酸的合成具有明显的促进作用。
[0072]
上述结果为通过基因工程手段进一步提升高山被孢霉等产油微生物产脂肪酸的能力，进而为提高脂肪酸的生物合成能力提供了充实的理论支持。
[0073]
实施例5：重组高山被孢霉的基因转录水平分析
[0074]
具体步骤如下：
[0075]
以高山被孢霉原养型菌株为阴性对照，取重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm中的4株转化子以及高山被孢霉原养型菌株的单孢子接种于kendrick培养基中，28℃、200rpm摇床培养7d，抽滤、收集菌体；取收集的菌体，于预冷的无菌无酶研钵中加入液氮充分研磨；加入1ml trizol(invitrogen，carl shad，ca，usa)继续研磨至粉末，室温放置至溶解；用无酶枪头吸取1ml溶解后的液体于无酶离心管中，加入200μl预冷的氯仿混匀；12000g、4℃下离心15min，吸上清于新的无酶离心管中；加入200μl三氯甲烷混匀，12000rpm、4℃下离心15min吸上清于新的无酶离心管中；加入等体积预冷的异丙醇，静置15min，12000g、4℃下离心15min，弃上清，室温晾干；加入1mldepc水配制的的75vol％乙醇，12000g、4℃下离心15min，用无酶枪头吸去乙醇，加入1ml乙醇水，重复上述步骤，用于洗净残存的杂质；离心弃上清后，将沉淀于室温下晾至半透明状；加入50μl无酶水溶解rna，测定浓度并稀释至1μg/μl，冰上储存；取1μl rna用nanodrop 2000测定浓度；同时取1μg rna在1.2％的变性胶中电泳，观察rna完整性；取1μg总rna为模板，根据revertaid first strand cdna synthesis kit试剂盒说明书进行反转录，获得高山被孢霉的cdna；按照bio
‑
rad itaqtm universal sybr green supermix的说明配制样品进行rt
‑
qpcr反应；
[0076]
其中，rt
‑
qpcr反应体系为：10μlitaqtm universal sybr green supermix(2
×
)、上下游引物各1μl、150～200ng cdna，ddh20补足至20μl；pcr循环设置为：50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃30s，40个循环；18s rdna作为内参基因，每个实验设置三个生物学平行，每个平行设置3个复孔；
[0077]
相对转录水平计算公式为2
‑
δδt
，δt为目的基因ct值与内参基因之差，δδt为实
验组δt与对照组δt的差值，rt
‑
qpcr反应所用引物见表4。
[0078]
由表5可知，4株转化子所含目的基因mayhm的转录水平分别比原养型高山被孢霉提高4.1倍、5.4倍、6.0倍和3.7倍；可见，目的基因mayhm确实在重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm中实现了过量表达，且其表达水平与其脂肪酸积累量呈正相关，说明，过量表达目的基因mayhm对于提高产油丝状真菌高山被孢霉脂质积累量具有很好效果。
[0079]
表4引物序列及其用途
[0080][0081]
表5重组高山被孢霉m.alpina
‑
mayhm以及高山被孢霉原养型菌株的基因转录水平
[0082]
组别相对转录水平高山被孢霉原养型菌株1转化子14.1转化子25.4转化子36.0转化子43.7
[0083]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。