1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种马铃薯全株微生物样品一次性制备和分离纯化方法。
背景技术：
2.在自然中，植物与各种微生物共存，大量微生物附着植物表面和内部，并在植物生长和抗病中起重要作用，这些微生物群体统称为植物微生物组。模式植物拟南芥已在其细菌群体形成、解析互作等方面表现出了极大的研究和应用价值。植物的地上部分称为叶际，是一种固定、开放、可变的、处于昼夜节律的生态环境，其微生物栖息环境暴露于紫外线、温度、水分和营养等快速变化之中。植物的地下部分被土壤包裹，主要受土壤理化性质影响。根系附生、内生微生物和土传病原菌是根系常驻微生物，它们组成了与根系相关的微生态体系。
3.随着高通量测序手段的普及及测序成本的下降，高通量测序成为了微生物组学研究最新手段。越来越多的研究使用高通量测序对不同植物的微生物组提出了新的认识。通过对根际、叶际等微生物测序产生高覆盖度的扩增子、基因组、转录组数据，用以估计细菌群落物种构成及其丰度，能够更加真实的揭示原位环境中微生物群落的多样性和复杂性。这些研究为探索植物微生物组的组成和结构及其影响因素开辟了新的途径。然而，想得到准确的测序结果，首先要获得高质量的微生物样品，所以如何在不同环境中尽可能完整、真实的取样是大家普遍关心的问题。另外，植物微生物组成员中的大部分都是细菌，其生存环境基本上是有氧环境，因此，植物微生物组成员是可以被分离和纯化的。由于不同的植物微生物生存环境有很大差别，所以迄今为止尚无统一的标准方法用于分离植物微生物组成员。
4.马铃薯是全球第四大重要粮食作物，是典型的根茎类作物。随着我国马铃薯栽培面积的不断扩大和高效栽培技术的发展滞后，马铃薯逐渐遭遇了幼苗生长发育不良、产量降低、畸形薯比例增高、病虫害严重等问题。马铃薯地上和地下部分相关微生物种群变化直接或间接影响着植株光合作用及土壤养分的吸收转化，微生物种群失衡是导致土壤质量下降、马铃薯减产和病虫害频发的主要原因。虽然目前国内外对马铃薯根系微生物的研究报道较少，叶际和茎围微生物组的研究几乎还没有开展，但已有研究表明，根系微生物组对马铃薯高效增产、病虫害及连作障碍防控等问题具有重要意义。目前，马铃薯微生物组学研究主要探讨微生物与马铃薯植株间的相互作用，涉及在不同条件下对马铃薯全株不同部位进行取样，以期研究不同生境、不同基因型、不同土壤类型等因素对马铃薯地上和地下部分生长发育的影响。然而，在马铃薯微生物组研究中，尚无明确的方法阐述马铃薯根际、叶际、茎围、薯块表面等部位的取样方法，更没有一次性取得马铃薯植株全株微生物样本的方法，特别是不同部位取样的先后顺序以及对根区、根际、根表、根内微生物区域的界定和各自的取样方法也鲜有报道。由于未有针对马铃薯全株微生物样本的快速获取和分离培养的相关方法，马铃薯微生物组学及培养组学相关研究进展相对滞后。因此，解决这一类的问题显得尤
为重要。
技术实现要素：
5.针对上述问题，本发明提供了一种马铃薯全株微生物样品一次性制备和分离纯化方法，来将目前马铃薯微生物组研究中所涉及的绝大多数类型的样本一次性分离、收集、提取，包括叶际、茎围、根区、根际、根表、根内、块茎附着7种类型，能够完整的分析不同环境等外界条件对马铃薯全株生长的影响及互作关系。
6.为了实现上述技术方案，本发明提供了一种马铃薯全株微生物样品一次性制备和分离纯化方法,包括以下步骤：
7.步骤一：取样部位划分,先剪取马铃薯植株不同部位的叶片和茎段，将其放入已编号的无菌容器中，用于制备叶际和茎围微生物样品；随后将马铃薯植株地上部分切去，切口用胶纸封死，完整挖取地下部分，将须根和马铃薯块茎分别放入已编号的无菌塑料袋中，用于制备根和薯块微生物样品；
8.步骤二：样品运输,将取定的样品按照叶片、茎段、根、块茎分类放入储藏盒，在冰盒条件下随即运回实验室待用；
9.步骤三：叶际和茎围微生物样品制备,取叶片和茎段各10
‑
20g，置入40ml无菌pbs缓冲液中，摇床200r/min震荡30min，再用超声波处理两次，每次30s，静置5
‑
10min，去除叶片和茎段后1500r/min离心1min，将上清液转移到另一个离心管，12000r/min离心10分钟得到菌体,留取10ml上清液后涡旋30s，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于叶际和茎围微生物dna和rna制备；
10.步骤四：根区微生物样品制备,在实验桌上铺上已编号的无菌纸，将对应编号的根部泥土用力抖落在纸上，直到肉眼看不见根上有明显的泥土。将抖落的泥土称取10
‑
25g，过2mm孔径无菌筛，多点样本均匀混合，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于根区微生物dna和rna制备；
11.步骤五：根际微生物样品制备,准备含40ml无菌pbs缓冲液的无菌离心管2
‑
3个。将步骤三中抖落泥土后的根放入离心管中，用力震荡2
‑
3min，静置5
‑
10min，待土粒自然沉降后，取出根系放入另一离心管并重复此步骤1
‑
2次。收集含沉降土粒的洗涤液，12000r/min离心10min，留取10ml上清液后涡旋30s，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于根际微生物dna和rna制备；
12.步骤六：根表微生物样品制备。将洗涤后的根系放入10ml无菌pbs缓冲液的无菌离心管中，用超声波处理2
‑
3次，超声频率为50
‑
60hz,每次30s，分装至2ml ep管或冻存管中，用于根表微生物dna和rna制备；
13.步骤七：根内微生物样品制备,将上述根样品取出，用无菌水洗涤，75％乙醇进行表面消毒30s，2.5％次氯酸钠消毒10min,再用无菌水充分洗涤；取5
‑
10g已消毒的根，放40ml无菌pbs缓冲液中，用破碎机处理5min，静置10min，收集洗涤液12000g离心10min，留取10ml上清液后涡旋30s，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于根内微生物dna和rna制备；
14.步骤八：块茎附生微生物样品制备,将马铃薯薯块表面泥土用力抖落后，用浸有无菌生理盐水的棉拭子在薯块表面来回滚动涂擦整个面积，涂擦完后剪断棉拭子的手持端，
并将棉拭子放入2ml装有无菌pbs缓冲液的ep管中，涡旋震荡30s两次，充分洗脱下棉拭子上的微生物后去掉棉拭子，剩余物用于块茎附生微生物dna和rna制备；
15.步骤九：将步骤三至步骤八中不同部位收集制备的样品备份用无菌水进行10
–2–
10
–7稀释，取不同样品的各个稀释度100μl，并涂布在不同培养基平板上。分离土壤源微生物可采用甲醇提取物培养基、tsb培养基、tyg培养基、yem培养基、m715培养基、twye培养基，分离叶际和茎围微生物可采用myx培养基、mm+meoh培养基、r2a培养基。
16.步骤十：选择3个温度梯度(25℃、30℃、35℃)培养2
–
10d,每天记录平板上出现的菌落数和菌落特征；
17.步骤十一：将平板上直径不小于200μm的单菌落直接挑取放入1ml保存液中，
‑
80℃保存待用；
18.步骤十二：对于平板上分离效果不好的菌落和小于200μm的单菌落，将它们分别划线在原用的培养基上，使用同样的培养条件，直至获得单菌落。
19.进一步改进在于：在本实施例中，选取马铃薯植株间的空隙处取样，作为对照样品。
20.进一步改进在于：如果马铃薯已有块茎形成，那么在步骤二开始时，首先将块茎摘下，然后按步骤八的操作方法制备块茎附着微生物样品，制作时保证块茎皮不被碰破。
21.进一步改进在于：在步骤四和步骤五中取完微生物样品后，余下的部分，也就是土壤颗粒和沉淀物还用于制作土壤提取物培养基。
22.进一步改进在于：在步骤三和步骤七中，取完微生物样品后，余下的部分，也就是超声液体和根沉淀物还用于制作马铃薯叶和根提取物培养基。
23.进一步改进在于：步骤三至步骤八中收集的7种微生物样品可直接提取dna和rna，用于细菌16s rrna基因、真菌its扩增子鉴定或宏基因组、宏转录组序列测定。
24.进一步改进在于：步骤九至十二中根据不同样品培养物结果可进一步进行基因组序列测定和分析。根据基因组序列分析结果，如果纯培养物是一个新种，即可按照常规方法对其进行形态和各种生化反应鉴定。
25.本发明的有益效果是：
26.1、本发明提供了一种快速、高效、方便的方法将目前马铃薯微生物组研究中所涉及的绝大多数类型的样本一次性分离、收集、提取，包括叶际、茎围、根区、根际、根表、根内、块茎附着7种类型，能够完整的分析不同环境等外界条件对马铃薯全株生长的影响及互作关系。本发明将微生物取样和扩大培养相结合，建立了一套马铃薯全株微生物分离纯化的方法，能够准确、高效的探索马铃薯全株微生物的菌群结构和主要功能，由于不同的微生物生长需要不同的培养基，不能期望使用一种或几种培养基就可以把所有的植物微生物全部分离出来，因此本发明提供了针对马铃薯叶和根系不同的培养基，均能取得较好的培养效果。
27.2、本发明中分别采用抖落、震荡和超声的方法分离和收集根区、根际和根表微生物样品，能够更加准确细致的将不同区域的微生物样品进行分类，在后期数据分析的过程中能够更加直接的关联到相关微生物的功能。如根表微生物受根系分泌物的影响更大，与作物的互作关系更为密切，根区微生物受土壤本身微生物的影响更大，更能反应土壤及环境的变化。如未能准确区分根系不同区域的微生物样本，会给后续高通量测序数据的分析
工作带来困扰。前人有研究表明用无菌刷刷取附着于根系上的微生物作为根际微生物样品，但是该方法在操作上有一定弊端，首先是马铃薯取样后的根系水分较重，附着在根系上的土壤粘度较高，无菌刷不仅无法将其全部刷下，粘性土壤还会堵塞刷头，造成根际土壤与根系很难分离。本发明中采用将根系浸泡在pbs缓冲液震荡的方式，解决了土壤粘性的问题且通过缓冲液维持了微生物细胞正常的ph和渗透压，震荡过程容易将附着在根系上的根际土粒震落，以达到分离根际微生物样本的目的。
28.3、前人研究中，经常采用生理盐水分离和检测微生物样本，本发明中选择采用pbs缓冲液，二者最本质的区别是生理盐水主要作用是维持正常的渗透压,而不具备缓冲能力,而一定浓度的pbs同时具备上述两种能力，可以在温度、气体组成变化时缓冲，接近细胞的生理状态，以保证正常的ph和渗透压。
29.4、本发明在收集根际、根表及根内样品时，采用将pbs缓冲液离心后将沉淀重新悬浮于少量缓冲液的方式，增加收集菌体的浓度，以保证有足够的微生物进行dna和rna的提取。
具体实施方式
30.为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
31.实施例一
32.本实施例提供了本发明提供了一种马铃薯全株微生物样品一次性制备和分离纯化方法,包括以下步骤：
33.步骤一：取样部位划分,先剪取马铃薯植株不同部位的叶片和茎段，将其放入已编号的无菌容器中，用于制备叶际和茎围微生物样品；随后将马铃薯植株地上部分切去，切口用胶纸封死，完整挖取地下部分，将须根和马铃薯块茎分别放入已编号的无菌塑料袋中，用于制备根和薯块微生物样品；
34.步骤二：样品运输,将取定的样品按照叶片、茎段、根、块茎分类放入储藏盒，在冰盒条件下随即运回实验室待用；
35.步骤三：叶际和茎围微生物样品制备,取叶片和茎段各10
‑
20g，置入40ml无菌pbs缓冲液中，摇床200r/min震荡30min，再用超声波处理两次，每次30s，静置5
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10min，去除叶片和茎段后1500r/min离心1min，将上清液转移到另一个离心管，12000r/min离心10分钟得到菌体,留取10ml上清液后涡旋30s，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于叶际和茎围微生物dna和rna制备；
36.步骤四：根区微生物样品制备,在实验桌上铺上已编号的无菌纸，将对应编号的根部泥土用力抖落在纸上，直到肉眼看不见根上有明显的泥土。将抖落的泥土称取10
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25g，过2mm孔径无菌筛，多点样本均匀混合，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于根区微生物dna和rna制备；
37.步骤五：根际微生物样品制备,准备含40ml无菌pbs缓冲液的无菌离心管2
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3个。将步骤三中抖落泥土后的根放入离心管中，用力震荡2
‑
3min，静置5
‑
10min，待土粒自然沉降后，取出根系放入另一离心管并重复此步骤1
‑
2次。收集含沉降土粒的洗涤液，12000r/min离心10min，留取10ml上清液后涡旋30s，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于根
际微生物dna和rna制备；
38.步骤六：根表微生物样品制备。将洗涤后的根系放入10ml无菌pbs缓冲液的无菌离心管中，用超声波处理2
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3次，超声频率为50
‑
60hz,每次30s，分装至2ml ep管或冻存管中，用于根表微生物dna和rna制备；
39.步骤七：根内微生物样品制备,将上述根样品取出，用无菌水洗涤，75％乙醇进行表面消毒30s，2.5％次氯酸钠消毒10min,再用无菌水充分洗涤；取5
‑
10g已消毒的根，放40ml无菌pbs缓冲液中，用破碎机处理5min，静置10min，收集洗涤液12000g离心10min，留取10ml上清液后涡旋30s，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于根内微生物dna和rna制备；
40.步骤八：块茎附生微生物样品制备,将马铃薯薯块表面泥土用力抖落后，用浸有无菌生理盐水的棉拭子在薯块表面来回滚动涂擦整个面积，涂擦完后剪断棉拭子的手持端，并将棉拭子放入2ml装有无菌pbs缓冲液的ep管中，涡旋震荡30s两次，充分洗脱下棉拭子上的微生物后去掉棉拭子，剩余物用于块茎附生微生物dna和rna制备；
41.步骤九：将步骤三至步骤八中不同部位收集制备的样品备份用无菌水进行10
–2–
10
–7稀释，取不同样品的各个稀释度100μl，并涂布在不同培养基平板上。分离土壤源微生物可采用甲醇提取物培养基、tsb培养基、tyg培养基、yem培养基、m715培养基、twye培养基，分离叶际和茎围微生物可采用myx培养基、mm+meoh培养基、r2a培养基。
42.步骤十：选择3个温度梯度(25℃、30℃、35℃)培养2
–
10d,每天记录平板上出现的菌落数和菌落特征；
43.步骤十一：将平板上直径不小于200μm的单菌落直接挑取放入1ml保存液中，
‑
80℃保存待用；
44.步骤十二：对于平板上分离效果不好的菌落和小于200μm的单菌落，将它们分别划线在原用的培养基上，使用同样的培养条件，直至获得单菌落。
45.实施例二
46.本发明提供了一种马铃薯全株微生物样品一次性制备和分离纯化方法,包括以下步骤：
47.步骤一：取样部位划分,先剪取马铃薯植株不同部位的叶片和茎段，将其放入已编号的无菌容器中，用于制备叶际和茎围微生物样品；随后将马铃薯植株地上部分切去，切口用胶纸封死，完整挖取地下部分，将须根和马铃薯块茎分别放入已编号的无菌塑料袋中，用于制备根和薯块微生物样品；
48.步骤二：样品运输,将取定的样品按照叶片、茎段、根、块茎分类放入储藏盒，在冰盒条件下随即运回实验室待用；
49.步骤三：叶际和茎围微生物样品制备,取叶片和茎段各10
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20g，置入40ml无菌pbs缓冲液中，摇床200r/min震荡30min，再用超声波处理两次，每次30s，静置5
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10min，去除叶片和茎段后1500r/min离心1min，将上清液转移到另一个离心管，12000r/min离心10分钟得到菌体,留取10ml上清液后涡旋30s，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于叶际和茎围微生物dna和rna制备；
50.步骤四：根区微生物样品制备,在实验桌上铺上已编号的无菌纸，将对应编号的根部泥土用力抖落在纸上，直到肉眼看不见根上有明显的泥土。将抖落的泥土称取10
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25g，过
2mm孔径无菌筛，多点样本均匀混合，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于根区微生物dna和rna制备；
51.步骤五：根际微生物样品制备,准备含40ml无菌pbs缓冲液的无菌离心管2
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3个。将步骤三中抖落泥土后的根放入离心管中，用力震荡2
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3min，静置5
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10min，待土粒自然沉降后，取出根系放入另一离心管并重复此步骤1
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2次。收集含沉降土粒的洗涤液，12000r/min离心10min，留取10ml上清液后涡旋30s，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于根际微生物dna和rna制备；
52.步骤六：根表微生物样品制备。将洗涤后的根系放入10ml无菌pbs缓冲液的无菌离心管中，用超声波处理2
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3次，超声频率为50
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60hz,每次30s，分装至2ml ep管或冻存管中，用于根表微生物dna和rna制备；
53.步骤七：根内微生物样品制备,将上述根样品取出，用无菌水洗涤，75％乙醇进行表面消毒30s，2.5％次氯酸钠消毒10min,再用无菌水充分洗涤；取5
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10g已消毒的根，放40ml无菌pbs缓冲液中，用破碎机处理5min，静置10min，收集洗涤液12000g离心10min，留取10ml上清液后涡旋30s，分装至2ml或更大体积的ep管或冻存管中，用于根内微生物dna和rna制备；
54.步骤八：块茎附生微生物样品制备,将马铃薯薯块表面泥土用力抖落后，用浸有无菌生理盐水的棉拭子在薯块表面来回滚动涂擦整个面积，涂擦完后剪断棉拭子的手持端，并将棉拭子放入2ml装有无菌pbs缓冲液的ep管中，涡旋震荡30s两次，充分洗脱下棉拭子上的微生物后去掉棉拭子，剩余物用于块茎附生微生物dna和rna制备；
55.步骤九：将步骤三至步骤八中不同部位收集制备的样品备份用无菌水进行10
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10
–7稀释，取不同样品的各个稀释度100μl，并涂布在不同培养基平板上。分离土壤源微生物可采用甲醇提取物培养基、tsb培养基、tyg培养基、yem培养基、m715培养基、twye培养基，分离叶际和茎围微生物可采用myx培养基、mm+meoh培养基、r2a培养基。
56.步骤十：选择3个温度梯度(25℃、30℃、35℃)培养2
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10d,每天记录平板上出现的菌落数和菌落特征；
57.步骤十一：将平板上直径不小于200μm的单菌落直接挑取放入1ml保存液中，
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80℃保存待用；
58.步骤十二：对于平板上分离效果不好的菌落和小于200μm的单菌落，将它们分别划线在原用的培养基上，使用同样的培养条件，直至获得单菌落。
59.在本实施例中，选取马铃薯植株间的空隙处取样，作为对照样品。
60.在本实施例中，如果马铃薯已有块茎形成，那么在步骤二开始时，首先将块茎摘下，然后按步骤八的操作方法制备块茎附着微生物样品，制作时保证块茎皮不被碰破。
61.在本实施例中，在步骤四和步骤五中取完微生物样品后，余下的部分，也就是土壤颗粒和沉淀物还用于制作土壤提取物培养基。
62.在本实施例中，在步骤三和步骤七中，取完微生物样品后，余下的部分，也就是超声液体和根沉淀物还用于制作马铃薯叶和根提取物培养基。
63.在本实施例中，步骤三至步骤八中收集的7种微生物样品可直接提取dna和rna，用于细菌16s rrna基因、真菌its扩增子鉴定或宏基因组、宏转录组序列测定。
64.在本实施例中，步骤九至十二中根据不同样品培养物结果可进一步进行基因组序
列测定和分析。根据基因组序列分析结果，如果纯培养物是一个新种，即可按照常规方法对其进行形态和各种生化反应鉴定。
65.在上述整个实验过程中，最好一直戴着无菌胶手套，尽量避免人为污染；
66.在上述的各个实验环节进行时，一定要作好详尽的记录，特别是各个分离到的单菌株与对应的微生物样品。因此，在实验开始前，最好将需要记录的数据设计成表格，按编页打印，实验时直接填入，每次实验结束后，再装订成册。如果有可能，可以编写一个小程序，直接按填写栏目输入，察看记录时，可以直接以表格方式输出。
67.本发明提供了一种快速、高效、方便的方法将目前马铃薯微生物组研究中所涉及的绝大多数类型的样本一次性分离、收集、提取，包括叶际、茎围、根区、根际、根表、根内、块茎附着7种类型，能够完整的分析不同环境等外界条件对马铃薯全株生长的影响及互作关系。本发明将微生物取样和扩大培养相结合，建立了一套马铃薯全株微生物分离纯化的方法，能够准确、高效的探索马铃薯全株微生物的菌群结构和主要功能，由于不同的微生物生长需要不同的培养基，不能期望使用一种或几种培养基就可以把所有的植物微生物全部分离出来，因此本发明提供了针对马铃薯叶和根系不同的培养基，均能取得较好的培养效果。
68.本发明中分别采用抖落、震荡和超声的方法分离和收集根区、根际和根表微生物样品，能够更加准确细致的将不同区域的微生物样品进行分类，在后期数据分析的过程中能够更加直接的关联到相关微生物的功能。如根表微生物受根系分泌物的影响更大，与作物的互作关系更为密切，根区微生物受土壤本身微生物的影响更大，更能反应土壤及环境的变化。如未能准确区分根系不同区域的微生物样本，会给后续高通量测序数据的分析工作带来困扰。前人有研究表明用无菌刷刷取附着于根系上的微生物作为根际微生物样品，但是该方法在操作上有一定弊端，首先是马铃薯取样后的根系水分较重，附着在根系上的土壤粘度较高，无菌刷不仅无法将其全部刷下，粘性土壤还会堵塞刷头，造成根际土壤与根系很难分离。本发明中采用将根系浸泡在pbs缓冲液震荡的方式，解决了土壤粘性的问题且通过缓冲液维持了微生物细胞正常的ph和渗透压，震荡过程容易将附着在根系上的根际土粒震落，以达到分离根际微生物样本的目的。
69.前人研究中，经常采用生理盐水分离和检测微生物样本，本发明中选择采用pbs缓冲液，二者最本质的区别是生理盐水主要作用是维持正常的渗透压,而不具备缓冲能力,而一定浓度的pbs同时具备上述两种能力，可以在温度、气体组成变化时缓冲，接近细胞的生理状态，以保证正常的ph和渗透压。
70.本发明在收集根际、根表及根内样品时，采用将pbs缓冲液离心后将沉淀重新悬浮于少量缓冲液的方式，增加收集菌体的浓度，以保证有足够的微生物进行dna和rna的提取。
71.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。