靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用

靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用。


背景技术：

2.多发性骨髓瘤(mm)是骨髓恶性浆细胞克隆增殖性疾病，导致骨髓造血受抑和溶骨性疾病。尽管应用传统化疗和造血干细胞移植以及靶向性药物可以治疗骨髓瘤，但复发难治的mm仍然不能完全治愈。
3.细胞免疫疗法正在成为一种很有前途的新策略，嵌合抗原受体修饰的t细胞(chimeric antigen receptor，car-t细胞)具有非mhc依赖性的肿瘤抗原特异性识别、增殖和杀伤能力。嵌合抗原受体由胞外抗原结合区，即由铰链区将单克隆抗体的轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)连接而成的单链抗体(scfv)、跨膜区域和胞内信号转导区构成。car-t疗法单一靶向表达特异抗原的细胞，而不杀伤其他细胞。mm细胞表面高表达一些其他正常组织细胞低表达或不表达的表面分子，如bcma、cd138、cd38、cs1等。因此，靶向这些表面分子的car-t细胞治疗成为有效治疗mm的新方案。
4.bcma(cd269)属于tnf受体超家族，结合b细胞活化因子(b-cell activating factor，baff)以及增殖诱导配体(aproliferation-inducing ligand，april)，进而促进mm细胞生长和骨髓基质细胞的黏附，bcma抗体对mm细胞系和原代mm细胞都具有杀伤作用。bcma表达于mm细胞，而浆细胞和成熟b细胞低表达或者不表达bcma。bcma缺陷小鼠的b细胞数量正常，但b细胞功能受到抑制。上述研究结果提示bcma适合作为mm治疗的靶点，并不会引起正常b细胞的功能受到明显影响。
5.因此，为了解决治疗b细胞血液肿瘤，特别是难治复发的多发性骨髓瘤缺少有效手段的问题，急需寻找一种新的产品和方法。


技术实现要素：

6.本发明的一个方面，是针对现有技术中应用传统化疗和造血干细胞移植以及靶向性药物治疗期间会因mm的逃避机制而产生复发或无效的问题，提供了一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用。
7.本发明提供的技术方案为：
8.编码靶向bcma的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含bcma结合结构域，所述bcma结合结构域为特异性结合bcma的单链抗体片段，所述单链抗体片段包含如seqidno.1所示的轻链可变区氨基酸序列和如seqidno.2所示的重链可变区氨基酸序列。
9.在本发明中，bcma
+
肿瘤细胞与bcma scfv结合后可以激活car-t细胞，产生细胞毒效应；而bcma-细胞不能激活car-t细胞产生应答。因此，以bcma scfv为抗原识别区制备的car-t细胞在识别并杀伤bcma
+
肿瘤细胞的同时，对bcma-细胞不产生脱靶效应。
10.在本发明中，上述特异性结合bcma的单链抗体片段中的轻链可变区序列和重链可
变区序列可以按照不同的方式排列。作为优选，在本发明的实施方式中，所述特异性结合bcma的单链抗体片段为按照以下顺序连接：
11.a)n-轻链可变区-连接体-重链可变区-c(记作mlh)；或
12.b)n-重链可变区-连接体-轻链可变区-c(记作mhl)。
13.其中，所述连接体(linker)可以为任意合适的序列。作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述linker的氨基酸序列为(gly4-ser)3。
14.更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述a)的氨基酸序列如seqidno.3所示，所述b)的氨基酸序列如seqidno.4所示。
15.在本发明中，可以对所述bcma scfv的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质、人源化，而这些突变后的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。
16.作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述轻链可变区氨基酸序列的第45位氨基酸残基突变为甘氨酸，突变后的轻链可变区氨基酸序列如seqidno.5所示；所述重链可变区氨基酸序列的第89位和第117位氨基酸残基分别突变为谷氨酸和丝氨酸，突变后的重链可变区氨基酸序列如seqidno.6所示。
17.同样地，突变后的轻链可变区序列和突变后的重链可变区序列可以按照不同的方式排列。作为优选，在本发明的实施方式中，所述特异性结合bcma的单链抗体片段为按照以下顺序连接：
18.c)n-突变后的轻链可变区-连接体-突变后的重链可变区-c(记作hlh)；或
19.d)n-突变后的重链可变区-连接体-突变后的轻链可变区-c(记作hhl)。
20.更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述c)的氨基酸序列如seqidno.7所示，所述d)的氨基酸序列如seqidno.8所示。
21.人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及dna重组技术改造，指抗体的恒定区部分(即ch和cl区)或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。基本保留了亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
22.在本发明中，所述核酸分子可编码信号肽。信号肽可引导抗原识别区及铰链区转移到胞外。任意合适的信号肽或信号肽的组合均可实现本发明的目的。
23.作为优选，在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90-99％同一性的氨基酸序列，所述信号肽为cd8α中的信号肽序列或gm-csf。
24.更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述信号肽为如seq id no.9所示的信号肽。
25.在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述bcma结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接。任意合适的铰链区序列均可实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述铰链区为cd8α。
26.在本发明中，所述核酸分子还编码跨膜结构域。任意合适的跨膜结构域均能实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列：t细胞受体的α、β或ζ链、cd3ε、
cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137或cd154。
27.更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述跨膜区为cd8α中的跨膜区序列。
28.在本发明中，所述核酸分子编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。
29.作为优选，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：mhc i类分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化nk细胞受体、btla、toll配体受体、ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cds、icam-1、lfa-1、4-1bb、b7-h3、cd278、gitr、baffr、light、hvem、kirds2、slamf7、nkp80、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49α、ia4、cd49d、itga6、vla6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11α、itgam、cd11b、itgax、cd11c、cd29、itgb1、itgb2、cd18、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、cd226、cd84、cd96、ceacam1、crtam、cd229、cd160、psgl1、cd100、cd69、slamf6、slam、blame、cd162、ltbr、lat、gads或slp-76。
30.更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述共刺激因子为cd28或4-1bb或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。
31.同时，本发明核酸分子还编码任意合适的胞内信号结构域。可以为cd3ζ胞内信号结构与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。
32.作为优选，本发明核酸分子所编码的嵌合抗原受体是以bcma scfv抗原识别区、cd8α铰链区和跨膜区、以及4-1bb和cd3ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域。所述核酸分子的序列如seqidno.10-13所示。
33.在本发明中，所述与其具有90-99％同一性可以为与其具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，相应序列的改变一般不会影响该蛋白质整体功能的变化。
34.另外，在上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区之间合适的位置可插入任意肽链作为间隔区，所述肽链可以为寡肽或多肽。
35.对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区等结构域的碱基序列，通过化学合成或pcr扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。
36.在本发明的一个实施方式中，发明人采用pcr扩增的方法获得bcma结合结构域bcmascfv抗原识别区的碱基序列。具体为，提取小鼠抗人bcma单克隆抗体杂交瘤细胞株的总rna，逆转录合成cdna第一链，使用“小鼠抗体scfv基因扩增试剂盒”pcr扩增合成鼠抗人bcma scfv。而后对鼠源bcma scfv进行人源化改造，并进行抗体亲和力验证，获得人源化bcma scfv抗体。
37.在本发明的另一个实施方式中，发明人采用化学合成的方法，根据本发明中所提供的序列，合成相应的核酸分子或片段。
38.上述小鼠抗人bcma单克隆抗体杂交瘤细胞株(69g8)是由中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)研制的。
39.本发明的另一个方面，是提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由上述核酸分子编码。
40.上述嵌合抗原受体的胞外区包含bcma结合结构域，所述bcma结合结构域为鼠抗人及人源化bcma抗体轻链和重链构成的scfv的氨基酸序列。
41.作为优选，本发明嵌合抗原受体是以bcma scfv抗原识别区、cd8α铰链区和跨膜区、以及4-1bb和cd3ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，氨基酸序列如序列表seq id no.14-17所示。
42.本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含上述核酸分子。
43.在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。另外，上述载体也可包含编码自杀基因的序列，可根据治疗过程，通过给予激活自杀基因的物质，从而控制体内car-t细胞的数目。
44.作为上述病毒载体，可以为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。在本发明的一个实施方式中，使用的是慢病毒表达载体。
45.本发明的另一个方面，是提供了一种细胞，所述细胞包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体或上述载体。
46.在本发明的一个实施方式中，上述细胞为人的t细胞。所述t细胞可以来自血液、骨髓等体液，也可以来自脾脏、胸腺、淋巴等组织，或者原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌症组织，经分离、纯化后得到。同时，所述t细胞可以为cd4
+
t细胞、cd8
+
t细胞、αβt细胞或γδt细胞。所述t细胞可以以合适的方式替换为nk细胞，其也视为包含在本发明的保护范围之内。
47.本发明的另一个方面，是提供了一种上述核酸分子在制备抗bcma阳性的血液肿瘤药物中的应用。
48.本发明的另一个方面，是提供了一种上述嵌合抗原受体在制备抗bcma阳性的血液肿瘤药物中的应用。
49.本发明的另一个方面，是提供了一种上述载体在制备抗bcma阳性的血液肿瘤药物中的应用。
50.本发明的另一个方面，是提供了一种上述细胞在制备抗bcma阳性的血液肿瘤药物中的应用。
51.只要其在病理过程中表达bcma，上述抗bcma阳性的血液肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤。作为优选，上述抗bcma阳性的血液肿瘤为多发性骨髓瘤。
52.更优选地，上述多发性骨髓瘤为经化疗或靶向治疗后复发难治的多发性骨髓瘤。
53.本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体、上述载体或上述细胞，以及药学上接受的载体。
54.本发明药物组合物除包含上述成分以外，还可包含任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。
55.同样，本发明药物组合物也可以和其他合适的抗癌剂联合应用。例如，美法仑、长春新碱、环磷酰胺、依托泊苷、阿霉素、泼尼松等。
56.本发明药物组合物也可以和其他car-t制剂联用，例如，cd38、cd138、cd19等car-t细胞。
57.本发明的另一个方面，是提供了一种上述核酸分子在治疗bcma阳性的血液肿瘤中的应用。
58.本发明的另一个方面，是提供了一种上述嵌合抗原受体在治疗bcma阳性的血液肿瘤中的应用。
59.本发明的另一个方面，是提供了一种上述载体在治疗bcma阳性的血液肿瘤中的应用。
60.本发明的另一个方面，是提供了一种上述细胞在治疗bcma阳性的血液肿瘤中的应用。
61.本发明的另一个方面，是提供了一种上述药物组合物在治疗bcma阳性的血液肿瘤中的应用。
62.只要其在病理过程中表达bcma，上述bcma阳性的血液肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤。作为优选，上述bcma阳性的血液肿瘤为多发性骨髓瘤。
63.更优选地，上述多发性骨髓瘤为经化疗或靶向治疗后复发难治的多发性骨髓瘤。
64.本发明的有益效果为：
65.本发明通过流式细胞术、脱颗粒分析实验、以及elisa检测t细胞分泌的细胞因子，证明嵌合抗原受体bcma scfv-cd8α-4-1bb-cd3ζ修饰的t细胞对表达bcma的多发性骨髓瘤细胞有很强的杀伤作用，对不表达bcma的细胞几乎没有杀伤作用，有效防止了脱靶效应。本发明嵌合抗原受体bcma scfv-cd8α-4-1bb-cd3ζ可用于bcma
+
多发性骨髓瘤细胞血液肿瘤的治疗，以及与cd38、cd138、cd19等car-t细胞的联合治疗。
附图说明
66.图1为本发明实施例中鼠抗人bcma单克隆抗体轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)的pcr扩增电泳图，其中，1为2kb核酸分子量标准泳道，2为vl泳道，3为vh泳道，而后对此片段进行测序并使用discovery studio软件对其进行人源化改造；
67.图2为本发明实施例中vl和vh序列进行胶回收纯化，对两者进行overlap pcr扩增鼠源bcma vl-vh(mlh)和bcma vh-vl(mhl)片段序列鉴定结果图，其中，1为2000bp marker分子量标记泳道，2为bcma vl-vh(bcma mlh)，3为bcma vh-vl(bcma mhl)，人源化序列经过公司合成得到；
68.图3为本发明实施例中慢病毒表达载体bcma mlh和bcma mhl限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1和2分别为用核酸内切酶nhe
ꢀⅰ
和notⅰ双酶切慢病毒表达质粒bcma mlh和bcma mhl所得到的编码bcma mlh和bcma mhl的dna片段(1417bp)和载体片段(7303bp)泳道，3为2kb plusⅱ核酸分子量标记泳道；
69.图4为本发明实施例中人源化bcmahlh(图4的a)和hhl(图4的b)慢病毒表达载体示意图，mlh和mhl与之结构相同，其中，逆时针序列是正向基因片段，顺时针序列为反向基因片段；
70.图5为利用流式细胞术检测本发明实施例中构建的bcmahlh、bcma hhl、bcmamlh和bcma mhl修饰t细胞中car分子的表达结果图，其中，gfp为载体携带的标志蛋白的表达，f(ab')2为山羊抗鼠igg标记bcmascfv在t细胞表面的表达；
71.图6为利用流式细胞术检测本发明实施例中多发性骨髓瘤细胞系u266、mm1.s、
h929，慢性粒细胞白血病细胞系k562-rfp细胞中bcma靶抗原分子表达阳性率结果图；
72.图7为利用流式细胞术检测本发明实施例中t细胞与靶细胞共培养后残留的肿瘤细胞存活率结果图，其中，car-t为bcmamlh、bcmamhl、bcmahlh和bcmahhl修饰t细胞的实验组；vec-t为转染空载体的t细胞的对照组；其中，a为三次重复实验中，bcmamlh、bcmamhl、bcmahlh和bcmahhl修饰t细胞与bcma阳性的h929、mm1.s、u266细胞系以及bcma阴性的k562-rfp细胞系按效靶比1:8、1:4、1:2、1:1共培养24小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；b1、b2、b3分别为vec-t、bcmahlh和bcmahhl修饰t细胞与bcma阳性的h929、mm1.s、u266细胞系以及bcma阴性的k562-rfp细胞系按效靶比1:1共培养24小时后残留的肿瘤细胞存活率流式示意图；
73.图8为本发明实施例中bcmamlh、bcmamhl、bcmahlh和bcmahhl修饰t细胞对h929、mm1.s、u266和k562-rfp(效靶比1:1)杀伤作用的脱颗粒检测结果图，其中，car-t为bcmamlh、bcmamhl、bcmahlh和bcmahhl修饰t细胞的实验组；vec-t为转染空载体的t细胞的对照组；
74.图9为本发明实施例中bcmamlh、bcmamhl、bcmahlh和bcmahhl修饰t细胞与h929、mm1.s、u266和k562-rfp细胞系按效靶比1:2共培养24小时后，t细胞释放的细胞因子ifn-γ(a图)、il-2(b图)和tnf-α(c图)水平结果图，其中，car-t为bcmamlh、bcmamhl、bcmahlh和bcmahhl修饰t细胞的实验组；vec-t为转染空载体的t细胞的对照组。
75.序列说明
76.seqidno.1为本发明特异性结合bcma的单链抗体片段中轻链可变区的氨基酸序列；
77.seqidno.2为本发明特异性结合bcma的单链抗体片段中重链可变区的氨基酸序列；
78.seqidno.3为本发明特异性结合bcma的单链抗体片段mlh的氨基酸序列；
79.seqidno.4为本发明特异性结合bcma的单链抗体片段mhl的氨基酸序列；
80.seqidno.5为本发明特异性结合bcma的单链抗体片段中突变后的轻链可变区的氨基酸序列；
81.seqidno.6为本发明特异性结合bcma的单链抗体片段中突变后的重链可变区的氨基酸序列；
82.seqidno.7为本发明特异性结合bcma的单链抗体片段hlh的氨基酸序列；
83.seqidno.8为本发明特异性结合bcma的单链抗体片段hhl的氨基酸序列；
84.seqidno.9为本发明靶向bcma的嵌合抗原受体中信号肽的氨基酸序列；
85.seqidno.10为本发明靶向bcma的嵌合抗原受体mlh的核苷酸序列；
86.seqidno.11为本发明靶向bcma的嵌合抗原受体mhl的核苷酸序列；
87.seqidno.12为本发明靶向bcma的嵌合抗原受体hlh的核苷酸序列；
88.seqidno.13为本发明靶向bcma的嵌合抗原受体hhl的核苷酸序列；
89.seqidno.14为本发明靶向bcma的嵌合抗原受体mlh的氨基酸序列；
90.seqidno.15为本发明靶向bcma的嵌合抗原受体mhl的氨基酸序列；
91.seqidno.16为本发明靶向bcma的嵌合抗原受体hlh的氨基酸序列；
92.seqidno.17为本发明靶向bcma的嵌合抗原受体hhl的氨基酸序列；
93.seqidno.18为本发明靶向bcma的嵌合抗原受体中cd8α-4-1bb-cd3ζ的氨基酸序列。
具体实施方式
94.本发明公开了一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
95.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。以下对本发明中出现的部分术语加以解释。
96.术语“单链抗体片段”(single chain antibody fragment，scfv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。scfv能较好地保留其对抗原的亲和活性,并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
97.术语“突变”在本发明中主要指通过合适的方法，例如，聚合酶链式反应，使目的dna发生所需要的变化，例如，删除、插入、点突变，从而进一步改变所对应氨基酸的序列。
98.术语“难治”是指对起始治疗反应差，没有达到mr(minimal remission,微小缓解)者。mr是指血清m蛋白减少25％～49％并且24h尿轻链减少50％～89％，若基线存在软组织浆细胞瘤，则要求可测量病变spd(sun of products of greatest diameters，两个最大垂直径乘积之和)缩小25％～49％，溶骨性病变的数量和大小没有增加(可允许压缩性骨折的发生)。
99.术语“复发”是指接受一次/一次以上治疗后出现pd(progressive disease，疾病进展)需要进行挽救性治疗者，分为临床复发和cr(complete response，完全缓解)后复发。“临床复发”符合以下1项或多项：(1)出现新的骨病变或者软组织浆细胞瘤(骨质疏松性骨折除外)；(2)明确的(可测量病变spd增加50％且绝对值≥1cm)已有的浆细胞瘤或骨病变增加；(3)高钙血症(》2.75mmol/l)；(4)血红蛋白浓度下降≥20g/l(与治疗或非mm因素无关)；(5)从mm治疗开始，血肌酐上升≥176.8μmol/l(2mg/dl)并且与mm相关；(6)血清m蛋白相关的高黏滞血症。“cr后复发”符合以下之一：(1)免疫固定电泳证实血或尿m蛋白再次出现；(2)骨髓浆细胞比例≥5％；(3)出现pd的标准之一。pd符合以下1项即可(以下所有数据均与获得的最低数值相比)：
①
血清m蛋白升高≥25％(升高绝对值≥5g/l)或m蛋白增加≥10g/l(基线血清m蛋白≥50g/l时)；
②
尿m蛋白升高≥25％(升高绝对值≥200mg/24h)；
③
若血清和尿m蛋白无法检出，则要求受累与非受累血清flc(free light chain，游离轻链)之间的差值增加≥25％，且绝对值增加》100mg/l；
④
若血清和尿中m蛋白以及血清flc都不可测定，则要求骨髓浆细胞比例升高≥25％且绝对值增加≥10％；
⑤
出现新的软组织浆细胞瘤病变：原有1个以上的可测量病变spd从最低点增加≥50％；或原有的≥1cm病变的长轴增加≥50％；
⑥
循环浆细胞增加≥50％(在仅有循环中浆细胞作为可测量病变时应用，绝对值要求至少200个细胞/μl)。
100.术语“bcma阳性”是指细胞通过流式测得表面bcma抗原阳性。
101.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对
本发明作进一步的详细说明。
102.实施例1：嵌合抗原受体中抗原识别区bcma scfv的制备
103.a.根据序列商业化合成所述bcma scfv。
104.b.bcma scfv的克隆
105.1.提取鼠抗人bcma单克隆抗体杂交瘤细胞株的总rna：在5
×
106细胞中加入rna iso plus(takara)1ml，吹打混匀。加入200μl三氯甲烷，上下颠倒、涡旋振荡混匀。4℃，12000rpm，离心5分钟。吸取上清至1.5ml ep管，加入同体积异丙醇，轻轻上下颠倒混匀。4℃，12000rpm，离心15分钟。4℃预冷75％乙醇沉淀rna，50μl depc水溶解总rna。
106.2.逆转录合成cdna第一链：配制pcr反应体系(20μl)如下：oligo d(t)15primers:2μl；m-mlv(200u/μl)：1μl；dntp(each 2.5mm)：1μl；dtt(0.1m)：2μl；first strand buffer(5
×
)：4μl；bcma-rna:2μg；depc水:补足至20μl。反应条件：37℃，60分钟，70℃10分钟。
107.3.使用“小鼠抗体scfv基因扩增试剂盒”(public protein/plasmid library)pcr扩增鼠抗人bcma单克隆抗体轻链(vl)和重链(vh)的基因片段：
108.扩增vl链：配制pcr反应体系(50μl)如下：mvl mix：45μl；dna polymerase：0.3μl；cdna：400ng；ddh2o：补足至50μl。反应条件：94℃预变性3分钟；重复如下循环30次：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
109.扩增vh链：配制pcr反应体系(50μl)如下：mvh mix：45μl；dna polymerase：0.3μl；cdna：400ng；ddh2o：补足至50μl。反应条件：94℃预变性3分钟；重复如下循环30次：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
110.琼脂糖凝胶电泳分离并回收vl、vh片段。结果如图1所示。
111.4.将vl、vh连接至pmd19-simple t载体并测序，根据测序结果确定bcma单克隆抗体vl、vh的核酸序列。而后用计算机软件进行人源化模拟，得到人源化的vl、vh核酸序列并将其合成。
112.5.overlappcr方法构建vl-linker-vh方向bcma scfv片段：
113.p1:ctagctagcgacattgtgctgacacag
114.p2:cagctggacctggctcccaccacctccacttccgccgccaccagaacctccgcctccagcccgttttatttccagc
115.p3:ataaaacgggctggaggcggaggttctggtggcggcggaagtggaggtggtgggagccaggtccagctgcagcag
116.p4:ccggaattctgcggagacagtgaccag
117.配制第一轮pcr反应体系，获得nhe
ⅰ‑
vl-linker片段(50μl)：
[0118]2×
pfu pcr master mix(tiangen公司)：25μl；
[0119]
10μmp1+p2：2μl；
[0120]
pmd19-vl质粒：100ng；
[0121]
ddh2o：补足至50μl。
[0122]
反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
[0123]
配制第一轮pcr反应体系，获得linker-vh-ecorⅰ片段(50μl)：
[0124]2×
pfu pcr master mix(tiangen公司)：25μl；
[0125]
10μmp3+p4：2μl；
[0126]
pmd19-vh质粒：100ng；
[0127]
ddh2o：补足至50μl。
[0128]
反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
[0129]
琼脂糖凝胶电泳分离并回收nhe
ꢀⅰ‑
vl-linker、linker-vh-ecor
ꢀⅰ
片段；
[0130]
配制第二轮pcr反应体系，获得bcma scfv(vl-linker-vh方向)片段(50μl)：
[0131]2×
pfu pcr master mix(tiangen公司)：25μl；
[0132]
10μmp1+p4：2μl；
[0133]
nhe
ꢀⅰ‑
vl-linker片段：100ng；
[0134]
linker-vh-ecor
ꢀⅰ
片段：100ng；
[0135]
ddh2o：补足至50μl。
[0136]
反应条件：
[0137]
94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，58℃90秒；最后，72℃延伸10分钟。
[0138]
6.overlappcr方法构建vh-linker-vl方向bcma scfv片段：
[0139]
p5:ctagctagccaggtccagctgcagcagt
[0140]
p6:cacaatgtcgctcccaccacctccacttccgccgccaccagaacctccgcctcctgcggagacagtgac
[0141]
p7:tgtctccgcaggaggcggaggttctggtggcggcggaagtggaggtggtgggagcgacattgtgctgs
[0142]
p8:ctagctagccaggtccagctgcagcagt
[0143]
配制第一轮pcr反应体系，获得nhe
ⅰ‑
vh-linker片段(50μl)：
[0144]2×
pfu pcr master mix(tiangen公司)：25μl；
[0145]
10μmp5+p6：2μl；
[0146]
pmd19-vh质粒：100ng；
[0147]
ddh2o：补足至50μl。
[0148]
反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
[0149]
配制第一轮pcr反应体系，获得linker-vl-ecor
ꢀⅰ
片段(50μl)：
[0150]2×
pfu pcr master mix(tiangen公司)：25μl；
[0151]
10μmp7+p8：2μl；
[0152]
pmd19-vl质粒：100ng；
[0153]
ddh2o：补足至50μl。
[0154]
反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
[0155]
琼脂糖凝胶电泳分离并回收nhe
ꢀⅰ‑
vh-linker、linker-vl-ecor
ꢀⅰ
片段；
[0156]
配制第二轮pcr反应体系，获得bcma scfv(vh-linker-vl方向)片段(50μl)：
[0157]2×
pfu pcr master mix(tiangen公司)：25μl；
[0158]
10μmp5+p8：2μl；
[0159]
nhe
ⅰ‑
vh-linker片段：100ng；
[0160]
linker-vl-ecorⅰ片段：100ng；
[0161]
ddh2o：补足至50μl。
[0162]
反应条件：
[0163]
94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，58℃90秒；最后，72℃延伸10分钟。
[0164]
实施例2：嵌合抗原受体载体的构建
[0165]
1.采用nhe i、ecor i核酸内切酶酶切含有cd8α-4-1bb-cd3ζ片段的质粒，获得cd8α-4-1bb-cd3ζ片段，其氨基酸序列如seq id no.18所示。所述含有cd8α-4-1bb-cd3ζ片段的质粒可通过现有技术中任意合适的方法制得。
[0166]
2.将实施例1中得到的bcmascfv(mlh)和bcmascfv(mhl)片段与目的载体进行连接，将构建的bcma-vl-vh-cd8α-4-1bb-cd3ζcar和bcma-vh-vl-cd8α-4-1bb-cd3ζcar目的载体用nheⅰ和notⅰ进行酶切鉴定。结果如图3所示，酶切结果表明阳性克隆含有目的条带且测序鉴定正确。载体示意图如图4所示。
[0167]
3.商业化合成经计算机模拟后的人源化序列，并用同实施例1中的办法构建人源化嵌合抗原受体载体并测序鉴定正确。
[0168]
实施例3：嵌合抗原受体bcma scfv-cd8α-4-1bb-cd3ζ慢病毒修饰t细胞的制备
[0169]
1.采用endofree plasmid maxi kit质粒抽提试剂盒(qiagen公司)提取bcma scfv-cd8α-4-1bb-cd3ζ(mlh、mhl、hlh、hhl)表达质粒和包装质粒prsv-rev、pmdlg-prre、pmd.2g。四种质粒按照12.2：4.11：8.75：3.5的比例用pei转染试剂(polyscience公司)进行转染(具体方法见pei转染试剂说明书)。转染后12小时更换新鲜培养液，之后24小时、48小时分别收取病毒上清，于4℃，3000rpm，离心15分钟，经0.45μm滤器过滤后，采用50000g，4℃，2.5小时超速离心后浓缩10倍，后转入-80℃保存。
[0170]
2.t细胞的制备：取新鲜健康人外周血10ml，采用rosettesep t cell enrichment cocktail(stemcell公司)和ficoll-paque plus(ge healthcare公司)提取t细胞(具体步骤按照rosettesep t cell enrichment cocktail说明书)。按细胞：磁珠＝1：1比例加入抗cd3/cd28磁珠(gibco公司)，培养24小时即为转染前的t细胞。
[0171]
3.慢病毒感染t细胞及感染后t细胞的培养：从-80℃中取出病毒上清，室温下融化，按每1
×
106t细胞加入100μl病毒上清，加入polybrene至终浓度为8μg/ml。32℃，1800rpm，离心1.5小时，转入5％co2，37℃孵箱培养。
[0172]
4.流式细胞术检测car修饰t细胞的阳性率：收集细胞，标记山羊抗鼠igg f(ab')2抗体，流式细胞术分析t细胞f(ab')2和gfp的表达。结果如图5所示，由图中可以看出，bcma hlh和bcma hhlcar-t的阳性率分别为77.4％和75.8％。bcma mlh和bcma mhlcar-t的阳性率分别为64.6％和66.2％。
[0173]
实验例4：嵌合抗原受体bcma scfv-cd8α-4-1bb-cd3ζ(mlh、mhl、hlh、hhl)慢病毒修饰t细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用
[0174]
1.多发性骨髓瘤细胞系中bcma的表达水平：
[0175]
u266、mm1.s、h929和k562细胞系均购自美国atcc。将k562细胞系以慢病毒转染rfp
红色荧光蛋白，得到k562-rfp细胞系。分别培养后，各吸取5
×
105细胞悬液，pbs洗2次后，标记apc抗人bcma单抗(biolegend公司)，以标记apc-isotype为对照组，冰上孵育30分钟。运用流式细胞术检测各种细胞系bcma的表达水平，结果如图5所示。其中h929、mm1.s、u266和k562-rfp细胞系表达bcma及对应的同型对照的直方图如图6所示，u266、mm1.s、h929和k562-rfp细胞系分别为87.6％，93.3％，95.8％和0.10％。结果表明，本实验例中所使用的各种细胞系除k562-rfp以外，均表达bcma。
[0176]
2.car修饰的t细胞与u266、mm1.s、h929和k562-rfp细胞系共培养后流式检测残留的肿瘤细胞：
[0177]
将上述细胞按2
×
105细胞/孔接种24孔培养板，分别加入2.5
×
104(e:t＝1:8)、5
×
104(e:t＝1:4)、1
×
105(e:t＝1:2)、2
×
105(e:t＝1:1)浓度的car修饰的t细胞，并重复将转染不含car的空载体t细胞(vec-t)设为对照组，于孵箱中共培养。将共培养后的细胞用pe抗人bcma单抗(biolegend公司)标记h929、mm1.s、u266和k562-rfp细胞系，用apc-cy7抗人cd3单抗(biolegend公司)标记t细胞，流式细胞术检测残留细胞。3次独立的重复实验结果汇总如图7a所示，四种bcmacar-t(mlh、mhl、hlh、hhl)与表达bcma的h929共培养24小时后残留靶细胞为0，对照组24小时后1：1的共培养体系h929的比例为50％左右，与0小时相比无明显变化。4组bcma car之间杀伤效果无明显区别。图7b1所示，vec-t分别与u266、mm1.s、h929、k562-rfp进行1：1混合后0h靶细胞的比例分别为45.3％、50.5％、45.2％、53.7％，共培养24小时后靶细胞的比例为36.5％、35％、36.2％、58.5％。图7b2所示，hlh分别与u266、mm1.s、h929、k562-rfp进行1：1混合后0h靶细胞的比例分别为53.4％、43.5％、52.1％、48.8％，共培养24小时后靶细胞的比例为0.093％、0.45％、0.36％和49.9％。图7b3所示，hhl分别与u266、mm1.s、h929、k562-rfp进行1：1混合后0h靶细胞的比例分别为51.8％、42％、50.2％、46.1％，共培养24小时后靶细胞的比例为0.4％、0.43％、0.095％、48.3％。由上述结果可以看出，bcma car-t对表达bcma的肿瘤细胞具有杀伤作用，鼠源性和人源化后的序列杀伤功能无明显区别；同时，对不表达bcma的靶细胞没有表现出脱靶效应。
[0178]
3.脱颗粒实验分析car修饰的t细胞的激活：
[0179]
将vec-t、mlh、mhl、hlh、hhlcar-t细胞分别与k562-rfp、h929、mm1.s、u266细胞系按照效靶比1:1进行共培养，并在共培养体系中加入anti-cd107a抗体和monensin；4h后应用流式细胞仪检测cd3
+
细胞表面cd107a的表达水平。结果如图8所示，结果表明，vec-t与k562-rfp、h929、mm1.s、u266细胞系共培养体系中，t细胞激活百分率分别为2.35％、1.45％、1.91％和4.02％。mlhcar-t与k562-rfp、h929、mm1.s、u266细胞系共培养体系中，t细胞激活百分率分别为2.37％、35.3％、42.1％和34％。mhlcar-t与k562-rfp、h929、mm1.s、u266细胞系共培养体系中，t细胞激活百分率分别为2.2％、36.7％、44.4％和34％。hlhcar-t与k562-rfp、h929、mm1.s、u266共培养体系中，t细胞激活百分率分别为1.86％、34.8％、41.4％和34.6％。hhlcar-t与k562-rfp、h929、mm1.s、u266共培养体系中，t细胞激活百分率分别为1.99％、38％、45.2％和37.5％。四组car-t与vec-t的激活有显著差异(p《0.001)，但四组car-t之间无明显差异；且car-t与k562-rfp细胞共培养的激活水平显著低于与bcma阳性细胞共培养的激活水平。
[0180]
4.elisa检测淋巴瘤细胞系与car-t细胞共培养上清中细胞因子ifn-γ、tnf-α和il-2的水平：
[0181]
分别将k562-rfp、h929、mm1.s和u266细胞系按照2
×
105细胞/孔接种24孔板。按每孔1
×
105细胞分别加入car-t、vec-t细胞，补充培养液至1ml于孵箱中共培养24小时后。采用人ifn-γ、tnfα和il-2的elisa检测试剂盒(r&d公司)，对共培养上清进行检测(具体步骤见elisa检测试剂盒说明书)。结果如图9所示，结果表明，表达bcma的淋巴瘤细胞系h929、mm1.s、u266与car-t共培养上清中ifn-γ、tnf-α细胞因子水平均较vec-t组有显著性升高(p《0.001)，但在不表达bcma的k562-rfp细胞的共培养上清中的ifn-γ、tnf-α和il-2几乎没有分泌。结果表明，car-t在表达bcma的肿瘤细胞刺激下，能够分泌th1类细胞因子。
[0182]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。