本发明涉及没食子酸的制备方法，具体涉及一种获得含量大于99％没食子酸的制备方法。
背景技术：
五倍子(gallachinensis)是一种林副产品，又名文蛤，是倍蚜虫(melaphischinensis(bell)baker)在漆树科植物盐肤木(rhuschinensismill.)、青麸杨(rhuspotaniniimaxim.)或红麸杨(rhuspunjabensisstew.var.sinica(diels)rehd.etwils.)叶子上寄生所形成的早瘿。我国是五棓子的生产大国，占世界产量的75％～90％。五倍子适宜生长在温暖湿润的山区和丘陵，我国大部分地区均有分布，主产区集中在湖北、湖南、贵州、四川、陕西、云南等六省，这些省的五倍子产量约占全国的90％以上。五棓子由于蚜虫种类与寄主不同，外形各异，主要分为肚棓、角棓和棓花三类。其中角棓含五棓子鞣质约为65.5～67.5％，肚棓约68.8～71.4％,棓花类约33.9～～38.5％。以五倍子为原料生产的单宁酸及其系列产品被广泛应用于医药、食品、制革、冶金、印染、电子、化妆品、国防等行业。随着工农业的发展，对五倍子的需求量越来越大，将来亦可能出现有价无货的现象。近年来不少产区均在建立大面积的五倍子生产基地，大力发展五倍子产业，以满足工业生产的需要。
目前国内的大规模酶法生产的没食子酸的厂家很少，主要还是酸碱法来获得，缺点就是水解不完全，生产出来的产品颜色不够白，生产过程产生大量的污染等问题，产品质量未能达到高品质。
技术实现要素：
为了解决上述现有技术的不足之处，提供了一种获得含量大于99％没食子酸的制备方法，酶法水解完全，水解副产物葡萄糖可作为能源与碳源被生物催化剂代谢，不仅提高了资源的有效利用率，而且废液易于处理，有利于环境保护。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种获得含量大于99％没食子酸的制备方法，包括以下步骤：
1)将五倍子粉碎、加水打浆之后加入第一酶酶解，所得第一酶解液进行闪式提取，分离出滤液，所述第一酶包括破壁酶。
2)将步骤1)所得滤液浓缩、离心，收集离心液调节ph；
3)将步骤2)所得溶液加入第二酶酶解，所得第二酶解液经过有机膜过滤、浓缩、结晶、干燥制得所需的没食子酸，所述第二酶由单宁水解酶和第三酶组成，所述第三酶为果胶酶、蛋白酶中的至少一种。
进一步的，所述闪式提取的电机转速为5000～6000r/min，提取次数为3～4次，提取时间为1分钟/次。
进一步的，以g/ml计，步骤1)所述五倍子和第一酶质量体积比为100：1～6。
进一步的，步骤1)所述第一酶酶解温度为40～45℃，酶解时间为1～5小时，酶解ph为4.0～4.8。
进一步的，步骤2)所述第二酶酶解温度为40～45℃，酶解时间为6～10小时，酶解ph为5.2～5.5。
更进一步的，所述第二酶酶解温度为43℃，酶解时间为8小时，酶解ph为5.3，所述第二酶加入量为3％五倍子质量。
进一步的，步骤2)所述离心包括第一次离心和第二次离心，所述第一次离心为1400～1500r/min转速离心40～50分钟，所述第二次离心为12000～15000r/min转速离心1～1.5小时。
进一步的，所述有机膜过滤步骤包括第一次过滤和第二次过滤，所述第一次过滤使用截留5000～7000分子量的有机膜，过滤压力为0.45～0.48mpa；所述第二次过滤使用截留300～600分子量的有机膜，过滤压力为1.8～2.0mpa。
进一步的，所述浓缩制得8～10波美度的稠膏。
进一步的，所述结晶温度为6～15℃，结晶时间为12～15小时。
本发明具有如下技术效果：
1、利用超微粉碎加生物酶破壁再用闪式提取替代原有的提取方法，大大提高生产效率，新提取方法快速高效，常温提取，提取率高，操作简便，节能降耗，安全可靠。
2、优选了复合酶酶解单宁，使酶解达到最大的效能，比以往的单一生物酶法酶解率更加完全，降低生产成本，生产效率增加。
3、利用酶解加有机膜的组合方式代替以往的脱色，具有如下优势：提取时间减少；操作简单方便，能耗少，脱色后的样品比酸碱活性炭脱色含量高8％，最后结晶出来的样品产品雪白，溶剂残留少，无农药残留，品质高。
4、全程过程只用到了水，没有引入其他有机试剂，提取过程无污染，环保，安全。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1)取五倍子干燥品100g，粉碎到100目，加3倍量的纯水打浆。用3％柠檬酸调节ph到4.0，加入1ml第一酶，所述第一酶由0.5ml蛋白酶和0.5ml破壁酶组成，所述破壁酶包括果胶酶、纤维素酶，在40℃酶解1小时。所得第一酶解液放入闪式提取器，用纯水作为提取溶剂，加入12倍第一酶解液体积的水，于电机转速5000r/min条件下，常温提取3分钟，提取3次，每次一分钟。提取完一次中间休息2分钟，分离出滤液，合并3次提取的滤液，得到总滤液；
2)将总滤液过膜浓缩到五倍子原料质量的5倍量，冷却所得浓缩液到25℃，先经过蝶式离心机1400r/min转速离心40分钟，再经过管式离心机12000r/min转速离心1小时，弃去离心沉淀，离心液用10％w/w氢氧化钠溶液调ph＝5.2，搅拌均匀，使ph值不变；
3)经过调节ph之后的离心液加入3％五倍子质量的第二酶，所述第二酶由1:1质量比的单宁水解酶、第三酶(果胶酶)组成，40℃酶解6小时，酶解后溶液放冷到常温，得第二酶解液。
4)将第二酶解液过有机膜，先过5000分子量的有机膜(进膜压力0.45mpa)，全过完后再过300分子量的有机膜(进膜压力1.8mpa)，得脱色过膜液。
5)将过膜液减压浓缩制成8波美度的稠膏，搅拌均匀，在6℃下结晶12小时，抽滤得晶体干燥，得到40.8g没食子酸产品。经过hplc检测含量为99.1％，收率为40.4％。
实施例2
1)取五倍子干燥品100g，粉碎到100目，加3倍量的纯水打浆。用3％柠檬酸调节ph到4.0，加入2ml第一酶，所述第一酶由0.8ml蛋白酶和1.2ml破壁酶组成，所述破壁酶包括果胶酶、纤维素酶、半纤维酶，在40℃酶解1小时。所得第一酶解液放入闪式提取器，用纯水作为提取溶剂，加入12倍第一酶解液体积的水，于电机转速5000r/min条件下,常温提取3分钟，提取3次，每次一分钟。提取完一次中间休息2分钟，分离出滤液，合并3次提取的滤液，得到总滤液；
2)将总滤液过膜浓缩到五倍子原料用量的5倍量，冷却所得浓缩液到25℃，先经过蝶式离心机1470r/min转速离心40分钟，再经过管式离心机14000r/min转速离心1小时，弃去离心沉淀，离心液用10％w/w氢氧化钾溶液调ph＝5.3，搅拌均匀，使ph值不变；
3)经过调节ph之后的离心液加入3％五倍子质量的第二酶，所述第二酶由1:1质量比的单宁水解酶、第三酶(1:1质量比的果胶酶和蛋白酶)组成，43℃酶解8小时，酶解后溶液放冷到常温，得第二酶解液。
4)将第二酶解液过有机膜，先过6000分子量的有机膜(进膜压力0.45mpa)，全过完后再过500分子量的有机膜(进膜压力1.8mpa)，得脱色过膜液。
5)将过膜液减压浓缩制成8波美度的稠膏，搅拌均匀，在6℃下结晶12小时，抽滤得晶体干燥，得到42.5g没食子酸产品。经过hplc检测含量为99.3％，收率为42.2％。
实施例3
1)取五倍子干燥品100g，粉碎到150目，加45倍量的纯水打浆。用4％柠檬酸调节ph到4.5，加入6ml第一酶，所述第一酶由3ml蛋白酶和3ml破壁酶组成，所述破壁酶包括果胶酶、纤维素酶、半纤维酶，在42℃酶解3小时。所得第一酶解液放入闪式提取器，用纯水作为提取溶剂，加入13倍第一酶解液体积的水，于电机转速5500r/min条件下,常温提取4分钟，提取4次，每次一分钟。提取完一次中间休息2分钟，分离出滤液，合并4次提取的滤液，得到总滤液；
2)将总滤液过膜浓缩到五倍子原料用量的5倍量，冷却所得浓缩液到25℃，先经过蝶式离心机1480r/min转速离心45分钟，再经过管式离心机13000r/min转速离心1.2小时，弃去离心沉淀，离心液用10％w/w氢氧化钙溶液调ph＝5.4，搅拌均匀，使ph值不变；
3)经过调节ph之后的离心液加入4％五倍子质量的第二酶，所述第二酶由1:0.5质量比的单宁水解酶、第三酶(蛋白酶)组成，42℃酶解8小时，酶解后溶液放冷到常温，得第二酶解液。
4)将第二酶解液过有机膜，先过6500分子量的有机膜(进膜压力0.47mpa)，全过完后再过400分子量的有机膜(进膜压力1.9mpa)，得脱色过膜液。
5)将过膜液减压浓缩制成9波美度的稠膏，搅拌均匀，在10℃下结晶13小时，抽滤得晶体干燥，得到43.2g没食子酸产品。经过hplc检测含量为99.2％，收率为42.8％。
实施例4
1)取五倍子干燥品100g，粉碎到200目，加5倍量的纯水打浆。用5％柠檬酸调节ph到4.8，加入1.2ml第一酶，所述第一酶由0.4ml蛋白酶和0.8ml破壁酶组成，所述破壁酶包括果胶酶、纤维素酶、半纤维酶，在45℃酶解5小时。所得第一酶解液放入闪式提取器，用纯水作为提取溶剂，加入15倍第一酶解液体积的水，于电机转速6000r/min条件下,常温提取4分钟，提取4次，每次一分钟。提取完一次中间休息2分钟，分离出滤液，合并4次提取的滤液，得到总滤液；
2)将总滤液过膜浓缩到五倍子原料用量的5倍量，冷却所得浓缩液到25℃，先经过蝶式离心机1500r/min转速离心50分钟，再经过管式离心机15000r/min转速离心1.5小时，弃去离心沉淀，离心液用10％w/w氢氧化钠溶液调ph＝5.5，搅拌均匀，使ph值不变；
3)经过调节ph之后的离心液加入5％五倍子质量的第二酶，所述第二酶由1:2质量比的单宁水解酶、第三酶(蛋白酶)组成，45℃酶解10小时，酶解后溶液放冷到常温，得第二酶解液。
4)将第二酶解液过有机膜，先过7000分子量的有机膜(进膜压力0.48mpa)，全过完后再过600分子量的有机膜(进膜压力2.0mpa)，得脱色过膜液。
5)将过膜液减压浓缩制成10波美度的稠膏，搅拌均匀，在15℃下结晶15小时，抽滤得晶体干燥，得到41.7g没食子酸产品。经过hplc检测含量为99.1％，收率为41.3％。
对比例1
采用与实施例2相同的没食子酸制备方法，区别在于步骤1)不含第一酶酶酶解步骤，步骤1)具体如下所示：
取五倍子干燥品100g，粉碎到100目，加3倍量的纯水打浆。用3％柠檬酸调节ph到4.0，所得溶液放入闪式提取器，用纯水作为提取溶剂，加入12倍所得溶液体积的水，于电机转速5000r/min,常温提取3分钟，提取3次，每次一分钟。提取完一次中间休息2分钟，分离出滤液，合并3次提取的滤液，得到总滤液。
本对比例最终得到35.8g没食子酸产品。经过hplc检测含量为81.9％，收率为29.3％。
对比例2
采用与实施例2相同的没食子酸制备方法，区别在于不含步骤3)的第二酶酶解处理步骤，将步骤2)调节ph之后所得溶液直接进行步骤4)的有机膜过滤。
本对比例最终得到24.8g没食子酸产品。经过hplc检测含量为67.5％，收率为16.7％。
对比例3
采用与实施例2相同的没食子酸制备方法，区别在于步骤3)所使用的第二酶为单宁水解酶，步骤3)具体如下所示：
经过调节ph之后的离心液加入3％五倍子质量的单宁水解酶，43℃酶解8小时，酶解后溶液放冷到常温，得第二酶解液。
本对比例最终得到32.2g没食子酸产品。经过hplc检测含量为90.58％，收率为29.2％。
本发明采用两步酶法进行没食子酸的制备，其效果远远高单一酶解的处理效果，节能省耗，环境友好，是替代传统化学处理的理想方法。