54个Y染色体基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及应用的制作方法

54个y染色体基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，用于检测人体基因组中短串联重复序列基因座的多态性，包含54个检测位点，通过聚合酶链式反应进行复合扩增，可以对人类y染色体str进行快速准确判型，进而为法医个体识别和亲子鉴定提供判断依据。


背景技术：

2.法医dna检验技术是当前法庭科学领域中广泛应用的技术手段之一，在实际工作中发挥了重要作用。在通常进行的基因组dna检验中，检验对象分为常染色体和性染色体，其中性染色体包含x和y染色体。针对y染色体进行dna检验，可以开展家系排查和辅助父系亲缘鉴定，进而协助限定嫌疑人所在家系群体，为案件侦查提供重要线索。
3.y染色体str基因座是指存在于y染色体上由2
‑
6个核苷酸组成的短串联重复序列，是目前法医y染色体检验的主流遗传标记。y染色体除拟常染色区(pseudoautosomal region)外，在遗传过程中不与其他染色体发生重组，且序列结构特征能稳定地由父亲传给儿子，并为男性所特有，呈父系遗传，因此y
‑
str起初主要应用于父子单亲鉴定或其他父系血缘关系的鉴别和个体识别上。随着str分型技术的不断发展，y染色体在男女混合斑检验、父子关系鉴定、不同来源个体分析、灾难事故的个体识别等方面的作用日益凸显，其应用范围在不断扩展。特别是在一些凶杀案件及强奸案件的家系排查中，y
‑
str以其快速缩小排查范围、准确锁定案犯家系等巨大优势而获得越来越多的技术人员关注。
4.目前市场的y染色体str试剂盒包含的位点数较少，一次扩增得到的基因座信息可能无法满足实际应用的要求，需要一款尽可能多的包含y染色体str位点的试剂盒，提高累积个体识别力和非父排除率，应用于复杂案件中。


技术实现要素：

5.为了克服上述不足，本发明对男性y染色体str基因座的遗传多态性进行了深入的研究，目的在于提供一种具有增强鉴别能力的y染色体str基因座荧光标记复合扩增体系、试剂盒及其应用，本发明所提供的试剂盒可以应用在法医鉴定及亲子鉴定等领域中。
6.本发明采用6色荧光，包括了公安部公布y建库指导要求的20个核心基因座和15个优选基因座，还包含了一些备选基因座，将其应用于建库工作，得到的数据可以与公安部dna数据库进行比对，大大提高了现有dna数据库的利用率，同时具有更高的累积个体识别力和非父排除率。
7.为实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案：短串联重复序列的复合扩增体系，包括49对引物，可同时扩增54个位点，即53个y染色体str基因座和1个y
‑
indel；其中53个y染色体str基因座分别为：dys393、dys570、dys19、dys392、dys549、y
‑
gata
‑
h4、dys444、dys593、dys617、dys388、dys520、dys460、dys458、dys481、dys635、dys438、dys447、dys443、dys522、dys622、dys459a/b、dys389i、dys390、dys389ii、dys448、dys533、dys449、dys531、dys510、dys713、dys391、dys439、dys437、dys385a/b、dys643、dys518、dys508、dys596、y
‑
gata
‑
a10、dys576、dyf404s1、dyf387s1、dys627、dys527a/b、dys557、dys645、dys456、dys552；所述的49对引物，核苷酸序列及对应浓度如表1所示。
8.表1：49对检测引物的核苷酸序列和浓度
9.10.[0011][0012]
其中，每个基因座对应的引物对中，上排为正向引物，下排为反向引物；基因座dys459a/b、dys385a/b、dys527a/b、dyf404s1、dyf387s1均为多拷贝str基因座，每个基因座对应一个引物对。
[0013]
所述的荧光复合扩增体系被检测的位点分别由五种荧光素分子标记，相同的荧光标记视为一组，五组组合分别为：
[0014]
fam：y
‑
indel、dys393、dys570、dys19、dys392、dys549、y
‑
gata
‑
h4、dys444、dys593、dys617、dys388、dys520；
[0015]
hex：dys460、dys458、dys481、dys635、dys438、dys447、dys443、dys522、dys622；
[0016]
l552：dys459a/b、dys389i、dys390、dys389ii、dys448、dys533、dys449、dys531、dys510、dys713；
[0017]
lr600：dys391、dys439、dys437、dys385a/b、dys643、dys518、dys508、dys596、y
‑
gata
‑
a10；
[0018]
tet
‑
592：dys576、dyf404s1、dyf387s1、dys627、dys527a/b、dys557、dys645、dys456、dys552；
[0019]
该扩增体系检测用的分子量内标qd650采用橙色af633标记，为第六组荧光标记，如图1。
[0020]
所述的荧光复合扩增体系，包含一款pcr预混液：2.5mm硫酸铵，50mm氯化钾，0.3mg/ml bsa，6.00％dmso，100mm
‑
120mm甜菜碱，35mm ph 8.0的tris
‑
hcl，1.5mm
‑
2mm镁离子，0.2mm dntp以及1u taqdna聚合酶。
[0021]
所述的荧光复合扩增体系的反应条件为：第1步：95℃变性10分钟，第2步：94℃变性20秒，第3步：59℃退火90秒，重复2至3步28次，第4步：60℃延伸30
‑
60分钟。
[0022]
所述荧光复合扩增体系中还包含基因座的等位基因分型标准物，如图2。
[0023]
基于以上所述的扩增体系，本发明的目的是通过采用以上的扩增体系制作一种试剂盒，应用于法医dna分型及亲缘关系鉴定中。
[0024]
所述试剂盒，可以进行fta卡、唾液卡和dna直接扩增检测。
[0025]
所述dna样品可来源于人的血液、血痕、精液、精斑、唾液、体液、毛发、肌肉、指甲等。
[0026]
所述dna样品可用试剂盒法、酚氯仿抽提法、chelex
‑
100法、磁珠法进行dna提取处
理。
[0027]
所述扩增的pcr产物可用毛细管电泳法进行检测分析。
[0028]
本发明所提供试剂盒的优越性见表2，其中“+”指的是可以识别该str基因座，空格为不能识别该str基因座，本发明的扩增体系可以识别53个y染色体基因座和1个y
‑
indel，而其他试剂盒只能识别部分基因座。
[0029]
表2：本发明所提供试剂盒与国内外试剂盒比较
[0030]
[0031][0032]
本发明所提供的53个y染色体str基因座，包含了pp y23、yfiler plus和pathfinder plus的所有str位点，同时也包含了公安部的20个核心基因座和15个优选基因座，还包含了dys617、dys520、dys443、dys622、dys459a/b、dys531、dys510、dys713、dys508、dys552、y gata a10，提高了累积个体识别力和累积非父排除率。
[0033]
总之，本发明具有如下优点：
[0034]
1.包含公安部y
‑
str dna数据库推荐的20个核心基因座、15个优选基因座，还包含了一些备选基因座，信息量大，兼容性好，可兼容现市面上大部分的试剂盒信息及数据库信息，不会造成数据库信息的浪费；
[0035]
2.一管同时扩增54个位点，一步得到更多位点信息，极大提高累积个体识别力和非父排除率；
[0036]
3.系统特异性强、稳定性好，经反复验证多次，无非特异扩增产物产生，且信号强度稳定；
[0037]
4.适应性广，常见生物检材血液、唾液、毛发、精斑、肌肉、指甲、软骨等均能鉴定，还可以直接扩增fta卡和唾液卡；
[0038]
5.检测灵敏度高，低至0.06ng的dna仍旧可以得到准确分型；
[0039]
6.种属特异性好，除正常扩增人样本外，其他种属如鼠、猪、狗、牛、羊等均不能扩增；
[0040]
7.混合样本的检测：在男性dna模板和女性dna模板的比例达到1:500时，仍能有效检测出53个y染色体str基因座和1个y
‑
indel，无任何基因座丢失。
附图说明：
[0041]
图1为分子量内标示意图；
[0042]
图2为等位基因分型标准物示意图；
[0043]
图3为阳性对照9948扩增示意图；
[0044]
图4为男性fta卡直接扩增示意图；
[0045]
图5为男性唾液卡直接扩增示意图；
[0046]
图6为灵敏度检测示意图；
[0047]
图7为其他物种扩增示意图；
[0048]
图8为9948与9947以1：500的比例混合的扩增示意图。
具体实施方式
[0049]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0050]
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0051]
本发明对y染色体str基因座的遗传多态性进行了深入的研究，最终选择53个y染色体str、1个y
‑
indel位点，具体位点信息如下：dys393、dys570、dys19、dys392、dys549、y
‑
gata
‑
h4、dys444、dys593、dys617、dys388、dys520、dys460、dys458、dys481、dys635、dys438、dys447、dys443、dys522、dys622、dys459a/b、dys389i、dys390、dys389ii、dys448、dys533、dys449、dys531、dys510、dys713、dys391、dys439、dys437、dys385a/b、dys643、dys518、dys508、dys596、y
‑
gata
‑
a10、dys576、dyf404s1、dyf387s1、dys627、dys527a/b、dys557、dys645、dys456、dys552和y
‑
indel。各基因座所对应的等位基因范围、genbank登记号、核心重复序列如表3所示：
[0052]
表3：54个位点genbank号、核心重复序列和等位基因范围
[0053]
[0054][0055]
基于上述分析的基因座信息，依次确认以下实验参数条件。
[0056]
1、六色荧光标记组合确定
[0057]
本发明采用了六色荧光标记技术，选择了fam、hex、l552、lr600、tet
‑
592和af633建立六色荧光复合扩增体系。其中，所述af633为分子量内标所选用的荧光素。
[0058]
将54个位点分成五组，分别采用fam、hex、l552、lr600、tet
‑
592的荧光染料进行标记，通过反复多次实验验证后，确定最优荧光染料组合方案：y
‑
indel、dys393、dys570、dys19、dys392、dys549、y
‑
gata
‑
h4、dys444、dys593、dys617、dys388、dys520为第一组，采用
fam荧光素标记；dys460、dys458、dys481、dys635、dys438、dys447、dys443、dys522、dys622为第二组，采用hex荧光素标记；dys459a/b、dys389i、dys390、dys389ii、dys448、dys533、dys449、dys531、dys510、dys713为第三组，采用l552荧光素标记；dys391、dys439、dys437、dys385a/b、dys643、dys518、dys508、dys596、y
‑
gata
‑
a10为第四组，采用lr600荧光素标记；dys576、dyf404s1、dyf387s1、dys627、dys527a/b、dys557、dys645、dys456、dys552为第五组，采用tet
‑
592标记。
[0059]
2、特异引物设计
[0060]
所述的特异引物采用primer premier 5和ncbi blast等软件设计而成，设计引物时应尽量确保各引物的tm值在(59
±
2)℃的范围内。
[0061]
针对上述每个基因座设计多对引物，单对引物进行扩增实验，选择扩增效率高且不会引起非特异的引物，进行49对引物复合扩增，根据复合扩增结果重新设计可能引起非特异的引物，直到体系中无非特异扩增出现，根据引物对的扩增效率高低调整复合扩增体系中引物的浓度。
[0062]
所设计的49对特异引物核苷酸序列和浓度具体信息如表1所示：
[0063]
3、扩增体系
[0064]
通过多次反复实验，最终用于本扩增体系中的pcr预混液(2
×
buffer mix)成分包括：50mm氯化钾，0.3mg/ml bsa，6.00％dmso，100mm甜菜碱，35mm ph 8.0的tris
‑
hcl，2mm镁离子，0.2mm dntp以及1u taq dna聚合酶。
[0065]
本扩增体系的最优配比如表4所示：
[0066]
表4：pcr扩增组分配比
[0067][0068]
4、扩增反应条件
[0069]
确定了体系中酶的含量和镁离子的浓度后，对热循环参数进行优化，针对扩增循环数大小进行梯度实验，27个循环、28个循环、29个循环、30个循环和31个循环进行五个梯度实验，确定最优扩增循环数为28个循环。退火温度是在确定了循环数后进行优化，在28个扩增循环数下，退火温度分别设置57℃、59℃、61℃、63℃、65℃，确定最优的退火温度为59℃。另外也可以兼容不同pcr仪器之间的温度差异。
[0070]
所述具体热循环条件如下表5所示。
[0071]
表5：热循环参数
[0072]
[0073]
5、等位基因分型标准物构建
[0074]
等位基因标准物为分型的标准，将目前基因频率比较高的分型集合到一起，可用于对个人进行分型鉴定。本发明中所收集到的等位基因分型及大小范围如表6所示。
[0075]
表6：等位基因标准物信息
[0076][0077][0078]
具体所述实施例：
[0079]
实施例1：dna、血卡和唾液卡扩增
[0080]
取1ng常用dna 9948、男性的血卡和唾液卡作为模板，将各反应试剂按确定的比例混合震荡离心后放入pcr仪扩增。
[0081]
扩增结束后进行毛细管电泳检测：将内标qd650和甲酰胺按比例3:100混合后短暂离心，取9ul混合物加入到96孔板，再加入扩增产物样品或者是等位基因标准物1μl，混合静置数分钟，95℃变性3min，立即冰浴3min，离心后放入abi3500测序仪上，准备检测。
[0082]
将原始数据导入genemapper id
‑
x软件中，采用genemapper id
‑
x软件分析得到的数据并生成图谱。
[0083]
由图1
‑
图5所示的结果可以看出，采用本发明的体系扩增不同类型检材均可得到清晰准确的分型图，且分子量内标和等位基因分型标准物均能对分型进行准确的校准。
[0084]
实施例2：灵敏度检测
[0085]
利用54个位点的荧光复合扩增体系进行灵敏度检测，以9948为模板扩增，检测图谱如图6所示，本体系的最低检测灵敏度为0.06ng，在0.06ng是可完整检出所有分型。
[0086]
实施例3：物种特异性检测
[0087]
利用54个位点的荧光复合扩增体系进行不同物种的特异性检测，取鼠、猪、狗、牛、羊的dna模板，检测图谱如图7所示，本体系在其他物种中扩增不出条带，说明种属特异性较好。
[0088]
实施例4：混合样本扩增能力验证
[0089]
利用54个位点的荧光复合扩增体系进行两个样本的混合模拟实验，将男性模板9948和女性模板9947按照1:500的比例进行混合，扩增后得到图谱(即500ng女性dna模板存在时1ng男性dna模板的扩增结果图)，检测图谱如图8所示，
[0090]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。