一种靶向神经元烟碱型乙酰胆碱受体的新型多肽分子nAChR_BP及其应用的制作方法

一种靶向神经元烟碱型乙酰胆碱受体的新型多肽分子nachr_bp及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向神经元烟碱型乙酰胆碱受体的新型多肽分子nachr_bp及其应用。


背景技术：

2.烟碱型乙酰胆碱受体(nachr)是一类乙酰胆碱门控阳离子通道，在周围神经系统的肌肉和神经上形成主要的兴奋性神经递质受体。在许多疾病中，nachr的致病作用正在被发现，涉及的机制从突变到自身免疫反应；涉及的细胞类型从肌肉、神经元到角质形成细胞；涉及的疾病包括肌肉无力、癫痫、神经退行性疾病、精神疾病和尼古丁成瘾等症状和体征。研究者对nachr参与的一些疾病的认识引发了新的研究方向，即开发针对特定nachr亚型的治疗激动剂或拮抗剂，以及使用表达克隆的nachr亚基作为可能的免疫治疗药物。
3.多肽因其具有较高的靶向性和安全性，已经成为一种药物分子开发的主流方向。目前，通过分子模拟和对接来预测多肽同靶蛋白之间的结合模式和亲合力，已经成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。
4.因此，急需研究和开发可以特异地靶向烟碱型乙酰胆碱受体nachr，为未来开发成治疗人类相关疾病的新药提供了基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，而提供一种靶向神经元烟碱型乙酰胆碱受体的新型多肽分子nachr_bp，该多肽分子能够靶向烟碱型乙酰胆碱受体nachr的α和σ亚基，且nachr_bp-nachr蛋白复合物结构稳定。
6.本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，而提供一种靶向神经元烟碱型乙酰胆碱受体的新型多肽分子nachr_bp在制备治疗烟碱型乙酰胆碱受体相关疾病的药物中的应用。
7.本发明的目的通过以下技术方案实现：
8.提供一种靶向神经元烟碱型乙酰胆碱受体的新型多肽分子nachr_bp，所述多肽分子nachr_bp的氨基酸序列如seq id no:1所示。
9.上述技术方案中，所述多肽分子nachr_bp与烟碱型乙酰胆碱受体nachr的α亚基以及σ亚基作用。
10.本发明还提供上述一种靶向神经元烟碱型乙酰胆碱受体的新型多肽分子nachr_bp在制备治疗烟碱型乙酰胆碱受体相关疾病的药物中的应用。
11.上述技术方案中，所述疾病包括肌肉无力、癫痫、神经退行性疾病、精神疾病和尼古丁成瘾性疾病，以及由于皮下肌肉记忆性紧绷引起的面部及身体皱纹。
12.本发明的有益效果：
13.本发明是基于多肽的空间折叠和分子对接技术开发了一个的新型多肽分子
nachr_bp，其分子结构中的cys2、cys3、cys7和cys
13
四个半胱氨酸残基，可以形成两对二硫键；通过蛋白分子对接模拟研究发现，该多肽分子nachr_bp可以靶向烟碱型乙酰胆碱受体nachr的α和σ亚基，且nachr_bp-nachr蛋白复合物结构稳定。此外，该多肽分子nachr_bp对过表达的nachr的cn21细胞内的钙反应的影响结果显示，其可以显著地抑制细胞内nachr。因此，本发明的多肽分子nachr_bp可稳定地靶向烟碱型乙酰胆碱受体nachr，是一个开发潜力较高的烟碱型乙酰胆碱受体靶向药物，故具有非常好的应用前景。
附图说明
14.利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
15.图1为本实施例的多肽分子nachr_bp的三维结构示意图。
16.图2为本实施例的多肽分子nachr_bp与烟碱型乙酰胆碱受体nachr的分子对接示意图。
17.图3为本实施例的动力学模拟平均整个蛋白rmsd值变化的示意图。
18.图4为本实施例的动力学模拟各氨基酸残基rmsd值变化的示意图。
19.图5为本实施不同浓度的多肽分子nachr_bp预孵育过表达的nachr的cn21细胞的钙反应示意图。
具体实施方式
20.结合以下实施例及附图对本发明作进一步描述。
21.1、多肽分子nachr_bp的设计：
22.通过计算机辅助的方法，用vector nti10.3软件对比筛选不同nachr阻断分子的单氨基酸序列，以获得具有nachr阻断效果的氨基酸序列分布情况，以指导多肽先导化合物的设计，并用bioedit软件显示和编辑比较结果，获得多肽分子nachr_bp的序列。
23.2、多肽分子nachr_bp的三维结构预测：
24.运用modeller软件对多肽分子nachr_bp的三维结构进行预测：
25.(1)首先准备好bp.ali序列文件和pdb_95.pir文件；
26.(2)运行prf.buid()命令寻找与目的基因相近的pdb模板，bpout.prf存放输出结果，前6行记录了modeller构建这个文件的相关参数，后续行对应profile.build()检测到的相似处，选择相似度高和e值比较低的模板；
27.(3)在pdb模板数据库中下载上述候选模板的pdb文件，运行命令for()in()筛选最佳模板；
28.(4)在modeller窗口中运行automodel()命令获取蛋白预测结果；
29.(5)选择dope score最低且ga341 score最高的结果为最佳模型；
30.(6)使用pymol软件打开预测结果，获得多肽分子nachr_bp的三维结构图像(见图1)。
31.3、多肽分子nachr_bp与烟碱型乙酰胆碱受体nachr的分子对接分析：
32.运用基于快速傅里叶变换的刚性蛋白对接程序的zdock进行多肽-蛋白对接分析：
33.(1)准备好nachr和多肽分子nachr_bp的pdb文件；
34.(2)启动discovery studio 4.0，在同一个3d窗口中打开受体和配体蛋白；
35.(3)打开zdock设置对话框，设置旋转角度(angular step size＝15)、zrank＝false、对接构象分簇的参数设置(top poses＝2000、rmsd cutoff＝6.0、interface cutoff＝9.0和maximum number of clusters＝60)，设置并行计算为ture；
36.(4)运行zdock并查看结果，筛选打分最高的模型；
37.(5)使用pymol软件打开对接模型，对活性口袋以及对接位点进行分析。
38.4、nachr_bp-nachr蛋白复合物的动力学模拟分析：
39.运用namd和vmd对nachr蛋白晶体和nachr_bp-nachr蛋白复合体的动力学过程进行模拟：
40.(1)在vmd控制面板中调取tk console，cd进入目的文件夹，mol new filename.pdb，用automatic psf builder进行psf文件创建，调用top_all27_prot_lipid_na.inp脚本，加载脚本信息，生成链，完成psf文件的创建；
41.(2)生成了filename.pdb和filename.psf文件，重命名为original.pdb和original.psf，添加solvationbox，boundary设置为1.5；
42.(3)运用已经写好的minimization.namd进行能量最小化，其中脚本中的boundarydata运用findbox.tcl获取，另外准备脚本par_all36_lipid_prot_carb.prm，从cmd命令窗口输入namd2+p4 minimize.namd》dummy.out获得能量最小化；
43.(4)准备好nvt.namd脚本，从能量最小化的文件中进行动力学模拟过程，从cmd命令窗口输入namd2+p8 nvt.namd》dummy.out；
44.(5)对输出结果进行分析，确定动力学模拟过程中的升温结果及动力势能等信息，运用rmsdplot对蛋白的rsmd值进行分析绘图，结果见图3和图4。
45.图3中的两条曲线分别表示出nachr蛋白晶体以及nachr_bp-nachr蛋白复合物的rmsd值变化，从中体现出蛋白骨架在动力学模拟时长中的活跃度。
46.图4中的上图为nachr蛋白晶体中各氨基酸残基的rmsd值，下图为nachr_bp-nachr蛋白复合物的氨基酸残基rmsd值，横坐标标注了氨基酸残基的位置，rmsd值用标尺所示的颜色表示。
47.5、多肽分子nachr_bp对nachr的抑制活性
48.选择利用表达人nachr受体的人类细胞cn21细胞来评估多肽分子nachr_bp的生物活性。提前一天将cn21细胞铺于12孔板中进行培养，24小时后，去除旧的培养基，加入包含有不同终浓度(10-11
～10-5
m)nachr_bp的新培养基，与细胞进行孵育。六小时后使用试剂盒检测钙离子的浓度变化，通过评估nachr介导的cn21细胞[ca
2+
]的拮抗作用，体外测定nachr_bp的活性。如图5所示，不同浓度的多肽分子nachr_bp对过表达的nachr的cn21细胞内的钙反应的影响结果显示，其可以显著地抑制细胞内nachr。
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最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。